Summary
Vävnad-specifika mikroRNA hämning är en teknik som är underutvecklad i fältet mikroRNA. Häri, beskriver vi ett protokoll för att framgångsrikt hämma familjen miR-181 mikroRNA i gorgina celler från hjärtat. Nanovector teknik används för att leverera en mikroRNA svamp som visar betydande i vivo cardio-specifika miR-181 familj hämning.
Abstract
MikroRNA (miRNA) är små icke-kodande RNA som hämmar post-transcriptional budbärar-RNA (mRNA) uttryck. Sjukdomar, som cancer och hjärt-kärlsjukdom, har visat att aktivera vävnad eller cell-specifika miRNA uttryck som är associerat med sjukdomsprogression. Hämning av miRNA uttryck erbjuder möjlighet till en terapeutisk intervention. Traditionella metoder att hämma MicroRNA, anställa antagomir oligonukleotider, påverkar dock specifika miRNA funktioner vid global leverans. Häri, presenterar vi ett protokoll för i vivo cardio-specifik hämning av familjen miR-181 i en råtta modell. En miRNA-svamp konstruktion syftar till att omfatta 10 upprepade anti-miR-181 bindande sekvenser. Cardio-specifika α-MHC arrangören är klonade in pEGFP ryggraden att köra cardio-specifika miR-181 miRNA-svamp uttrycket. För att skapa en stabil cell finns line uttrycker den miR-181-svamp, gorgina H9c2 celler transfekterade med den α-MHC-EGFP-miR-181-sponge konstruktionen och sorterade fluorescens-aktiverad cell sortering (FACs) i GFP positiva H9c2 celler som odlas med neomycin (G418). Efter stabil tillväxt i neomycin, monoklonala cellpopulationer fastställs av ytterligare FACs och enda cell kloning. De resulterande gorgina H9c2-miR-181-svamp-GFP cellerna uppvisar en förlust av funktion i miR-181 familjemedlemmar bedömt genom det ökat uttrycket av miR-181 målproteiner och jämfört med H9c2 celler som uttrycker en rusning icke-funktionella svamp. Dessutom utvecklar vi en nanovector för systemisk leverans av den miR-181-svamp konstruktionen av komplexbildande positivt laddade liposomalt nanopartiklar och negativt laddade miR-181-svamp plasmider. In vivo imaging av GFP avslöjar att flera svans ven injektioner av en nanovector under en tre veckors period ska kunna främja en betydande uttryck av miR-181-svampen på ett hjärt-specifika sätt. Ännu viktigare, observeras en förlust av miR-181 funktion i hjärtat men inte i njurarna eller levern. MiRNA-svampen är en kraftfull metod att hämma vävnadsspecifika miRNA uttryck. Körning uttrycket miRNA-svamp från en vävnad-specifika promotorn ger specificitet för miRNA hämning, som kan begränsas till en riktad organ eller vävnad. Dessutom möjliggör att kombinera nanovector och miRNA-svamp teknik en effektiv leverans och vävnadsspecifika miRNA hämning i vivo.
Introduction
Under de senaste två decennierna, har förekommit många studier som har pekat på den betydande roll MicroRNA i mänskliga sjukdomar. Resultat från en stor mängd litteratur visar obestridligt vikten av MicroRNA i patofysiologin av sjukdomar, såsom cancer1 och hjärt-kärlsjukdom2,3,4,5. MiR-21 är exempelvis uppreglerad i många cancerformer, vilket resulterar i en ökad cellcykeln och cell spridning6. MiR-122 spelar en viktig roll i replikeringen av virus7i hepatit C infektioner, och det har visat att hämning av miR-122 minskar den virusmängd8. I hjärthypertrofi, miR-212/132 är uppreglerad i hjärtat och är involverad i patologiska fenotyp9. Den uppenbara betydelsen av nedreglering eller funktionella hämning av en uppreglerad miRNA antyder möjligheter för terapeutiskt utnyttjar miRNA biologi i nästan alla sjukdomar.
De fyra miR-181 familjemedlemmarna, miR-181a/b/c/d, finns i tre genomisk platser i det mänskliga genomet. Regionen intronic i en icke-kodande RNA värd gen (MIR181A1-HG) kodar kluster av miR-181-a/b-1. Regionen intronic i den NR6A1 genen kodar den miR-181-a/b-2. MiR-181-c/d klustret ligger i en uncharacterized avskrift på kromosom 19. Alla miR-181 familjemedlemmarna dela samma ”frö” sekvens och alla fyra miR-181 familjemedlemmar kan potentiellt reglera samma mRNA mål.
Vi3,4 och andra10 har betonat vikten av miR-181 familjemedlemmar under slutstadiet hjärtsvikt. Vi har också erkänt att en miR - 181c uppreglering uppstår under sjukdomstillstånd som är associerad med en ökad risk för hjärtsjukdom, såsom diabetes typ II, fetma och åldrande3,4,5. Det har föreslagits att överuttryck av miR - 181c orsakar oxidativ stress som leder till en hjärt-dysfunktion4.
Flera grupper har föreslagit att miRNA finns i mitokondrierna11,12,13,14, men vi var de första att visa att miR - 181 c härrör från kärntekniska genomet, bearbetas, och därefter flyttad till mitokondrierna i RISC3. Dessutom har vi upptäckt ett lågt uttryck av miR-181a och miR-181b i mitokondriell facket av hjärtat5. Ännu viktigare, har vi funnit att miR - 181c förtrycker mt-COX1 mRNA uttrycket, vilket visar att MicroRNA delta i det mitokondriella genreglering och förändra mitokondriefunktion3,4.
I artikeln beskrivs de metoder som krävs för att utforma en miRNA-svamp för att slå ner hela miR-181 familjen i hjärtmuskelceller. Dessutom beskriver vi ett protokoll för programmet i vivo av miR-181-svampen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experimentella rutiner godkändes av institutionella djur vård och användning kommittén av Johns Hopkins University.
1. svamp Design
-
MikroRNA bindande 3' UTR
Obs: A miRNA-funktioner genom bas hopkoppling samspelet med delvis kompletterande platserna i 3' oöversatta regionen (UTR) av dess mål mRNA (för en omfattande översyn, se Bartel)15.- Design av hämmare av miRNA uttryck som oligonukleotider som innehåller betydande komplementaritet att miRNA sekvensen. Binda en miRNA i en komplex genom omfattande bas ihopkoppling att blockera funktionen miRNA oligonukleotiden.
-
Utformningen av en miRNA svamp
- Design klädd tandemly delvis kompletterande miRNA sekvenser för att inkludera en utbuktning på den position som normalt klyvs av Argonaute 2. Bucklan är placerad på nukleotider 9-12 av mogen miRNA sekvensen att förhindra RNA interferens typ klyvning och nedbrytning av svampen.
- Om du vill designa sekvensen decoy mål att binda till alla miR-181 familjemedlemmar. Vid en undersökning och jämförelse av miR-181 familj miRNA sekvenser, hitta en gemensam sekvens vid 5'-sidan Ardenneroffensiven innehållande 8 på varandra följande nukleotider, eller hitta en sekvens gemensamma för alla 4 miR-181 familjemedlemmar på 3'-sidan av Bulan i ytterligare 8 på varandra följande nukleotider. Dessa 2 sekvenser representerar de vänstra och högra halvan bindningsställen, respektive.
Obs: Sekvensen bulvan är en tandem matris av vänster och höger halva bindande platser åtskilda av distanshylsa GGA. Länka ihop sekvensen 5'-änden och sekvensen 3'-sida (som beskrivs i steg 1.2.2) med en GGA spacer för att skapa bulan när glödgas till en miRNA (enligt beskrivningen i steg 1.2.1). Upprepa detta 1 miRNA bindningsställe 10 x i den slutliga miR-svamp konstruktion.
-
Andra miRNA svamp överväganden
Obs: För att klona svamp sekvensen i den mottagande uttryck vektorn, begränsning nuclease erkännande platser måste inkluderas i varje ände av sekvensen. En i silico matsmältningen analys bör användas att bekräfta ospecifika klyvning av svamp sekvensen av de valda restriktionsenzym och andra restriktionsenzym som används i nedströms kloning applikationer.- Lägga till en dubbel stop kodon (TAA TAA) på 5'-ände den syntetiska 3' UTR, sådan att sekvensen miR-181-svamp inte ingår i den kodande sekvensen för en förbättrad grönt fluorescerande protein (andra).
-
Syntes av svampen DNA för kloning
- Använda en DNA-synthesizer eller anställa en kommersiellt tillgänglig källa att syntetisera slutliga miRNA svamp sekvensen med begränsning nuclease erkännande platser för kloning. Svampen är skickat på en plasmid som kan innehålla valbara markörer för en amplifiering i bakterier. Ytterligare, svampen kan förstärks av ett polymeras-kedjereaktion (PCR) för kloning eller helt enkelt hoppade givare vektorn med de begränsning platser beskrivs i steg 1.3 (se även steg 3.1).
2. kloning mottagarens vektorn för att inkludera en vävnad-specifika promotorn
Obs: Använd pEGFP-C1 vektorn som mottagarens vektorn för uttryck kassett av miRNA svampen. PEGFP-C1 vektorn innehåller en läsning ram för en andra drivs av cytomegalovirus (CMV) främjare. Promotorn CMV är konstitutivt aktiv i däggdjursceller. Om en vävnad-specifika promotorn krävs, kan promotorn CMV avlägsnas genom rötning av AseI och NheI-enzymer (se steg 2.1). Plasmiden innehåller en omfattande flera kloning webbplats (MCS) samt kanamycin (Kan) och neomycin (G418) markörer för ett urval i bakterier och ett stabilt uttryck i däggdjursceller, respektive.
-
Ta bort CMV promotorn från pEGFP-C1
- Gör 50 μL av matsmältningen reaktion som innehåller 1 x kommersiellt tillgängliga digest buffert antyd vid tillverkning av de begränsning enzymer som används, 5 μg av plasmid DNA (i vatten) och 5 μL varje AseI och NheI enzymer. Lägga till alla komponenter i en mikrocentrifug rör och försiktigt blanda dem genom att svepa den. Snurra röret för 10 s i en mikrocentrifug att samla reaktionen vid botten. Inkubera reaktionen i 37 ° C vattenbad i 15 min.
- Rena de smält linearized Plasmiden. Lägg till 5 x reaktion volymen av kolumnen bindande buffert (en patentskyddad blandning av lämpliga bindande bufferten för tillverkning av kolumnerna DNA-rening används) och rena reaktionen med en kolumn för rening av DNA som beskrivs av tillverkaren. Eluera med 25 μL av eluering buffert (vatten) noggrant till mitten av kolumnen.
- Gel rena smält plasmiden på 0,5% agarosgel enligt följande: Tillsätt 5 μl av lastning buffert (50% glycerol-3 x laddar färgämne) till eluerade Plasmiden. Fyll hela provet i 1 väl på 0,5% agarosgel. Inkluderar ett separat körfält med 500 ng av uncut vektor. Kör den i 30-40 min tills en tillräcklig åtskillnad av skuren och Oskuren plasmider uppnås.
- Rena den linearized plasmiden som följer: visualisera DNA i agarosgel på en UV ljuslåda. Med en ren rakblad, noggrant punktskatt bandet motsvarande linjära Plasmiden.
Obs: Linjär plasmiden bör köra lägre än uncut plasmiden och visas som ett enda band på cirka 4,2 kb. Exciderad CMV arrangören visas som ett ljust band på cirka 500 nukleotider (nt). - Extrahera DNA från gel segmentet med hjälp av en kommersiellt tillgänglig kit och eluera DNA från kolonnen med 25 μL av vatten.
-
Kloning en hjärta-specifika promotorn till pEGFP-C1
Obs: Alpha-myosin heavy chain (α-MHC) Arrangören har tidigare kännetecknas och visade direkt robusta nivåer av hjärt-begränsad uttryck som beskrivs i följande Molkentin, Jobe och Markham16. I nästa avsnitt beskrivs hur att förstärka främjare av vektorn för kloning.- Klona α-MHC arrangören mellan element +420 till-2934 i förhållande till webbplatsen transkription start i p40 plasmid16 genom att först utforma PCR primers som flank denna region och sedan plasmiden som en mall för PCR. Förstärka regionen arrangören använder PCR primers tidigare beskrivna5. Framåt och bakåt PCR primers innehåller sekvenser av överlappning till smält ändarna av pEGFP-C1 (steg 2.1) att tillåta i-Fusion regisserad kloning. Läs dokumentationen till In-Fusion en utförlig förklaring av primer design för i-Fusion kloning. Primer sekvenser finns i tabell 1.
- Förbereda en 50 μL PCR-reaktion, som innehåller 1 μM av varje grundfärg och 10 ng av DNA. Tillsätt en lämplig mängd PCR-enzym och dNTP beroende på tillverkning av PCR reagens valt. Utför PCR på ett standard DNA cykling block. Utföra en 3 min 98 ° C denaturering steg, följt av 35 cykler av denaturering, glödgning och förlängning för 5, 30 och 120 s varje, respektive. Inkludera en sista förlängning av 10 minuter vid 72 ° C.
- Städa upp PCR och gel utvinning. Efter slutförandet av den PCR-cykeln, lägga till 5 x reaktion volymen av kolumnen bindande bufferten i PCR-reaktionen och rena det med en kolumn för rening av DNA som beskrivs av tillverkaren. Eluera blandningen med 25 μL av eluering buffert (vatten) noggrant till mitten av kolumnen.
- Tillsätt 5 μl av lastning buffert [50% glycerol (3 x) lastning dye] till eluerade plasmid. Fyll hela provet i 1 på 1% agarosgel. Kör den för 30-40 min. visualisera och punktskatt PCR-produkten som beskrivs ovan (steg 2.1.5).
- Ligera α-MHC arrangören med pEGFP-C1 enligt följande: tillsätt 10 μL ligering reaktionen som innehåller 1 x kommersiellt tillgängliga ligering buffert, 2 μL av renat PCR och 1 μL av linearized vektor. Utföra ligering vid 50 ° C i 15 min och sedan kyla den på is.
- Utföra en bakteriell omvandling enligt följande: transfect 50 μL av behöriga celler med 2,5 μl-Fusion ligering mix genom att lägga till komponenter. Vila Eppendorf rör på is för 20 min, Lägg den i en 42 ° C vattenbad för 40 s, och placera röret på is i 2 min.
- Efter omvandlingen, tillsätt 350 μL av SOC media och odla cellerna vid 37 ° C i 45 min. platta 200 μL av utväxt lösning på LB plattor med Kan. utföra en koloni PCR att identifiera Kan resistenta celler som innehåller den α-MHC arrangören ligering.
Obs: Screening primers var avsedda att PCR över ligering korsningen.
- Efter omvandlingen, tillsätt 350 μL av SOC media och odla cellerna vid 37 ° C i 45 min. platta 200 μL av utväxt lösning på LB plattor med Kan. utföra en koloni PCR att identifiera Kan resistenta celler som innehåller den α-MHC arrangören ligering.
- Expandera de PCR-positiva klonerna i LB-Kan buljong och plasmider renas med standard mini prep plasmid rening protokoll som beskrivs av tillverkaren.
3. kloning svampen
-
Smälta mottagarens vektorn
- Se plasmiden α-MHC-pEGFP linjär för kloning med mina och KpnI och rena gelen som beskrivs ovan (steg 2.1).
-
PCR förstärker och smälta svampen DNA
- Använd den miR-181-svamp och motsvarande 284-nt-långa scramble frakt vektorer som mall för PCR. Förstärka regionen svamp med hjälp av tidigare beskrivna PCR primers5. Observera att framåt och bakåt PCR primers innehålla restriktionsenzym sekvenser tillåta ligatur till α-MHC-pEGFP-C1. Utför PCR som beskrivs ovan (steg 2.2.2). Rena PCR produkterna innan matsmältningen som beskrivs (steg 2.2.3) och eluerat dem med vatten för matsmältningen. För primer sekvenser, se tabellen 1.
- Smälta svampen DNA för ligering. En 50 μL matsmältningen reaktion innehåller 1 x digest buffert, gel-renat PCR-reaktionen från steg 3.2.1 och 5 μL av både mina och KpnI enzymer. Lägga till alla komponenter i en mikrocentrifug rör och försiktigt blanda dem genom att svepa den. Snurra röret för 10 s i en mikrocentrifug att samla reaktionen vid botten. Inkubera reaktionen i 37 ° C vattenbad i 15 min.
- Rena smält PCR svampen med en PCR-sanering kolonn som tidigare beskrivits (steg 2.2.1).
-
Ligera miR-181-svampen i α-MHC-pEGFP-C1 vektor
- Ställa in en 21 μL ligering reaktion som innehåller 1 x ligering buffert, 3 μL rötas och renat miR-181-svamp PCR, 1 μL av linearized α-MHC-pEGFP-C1 vektor, 1 x DNA buffert och 1 μL av DNA-ligase. Utföra ligering vid rumstemperatur i 5 min och sedan placera den på isen.
- Omvandla 50 μL av XL1-blå behöriga celler med 2 μL av ligering mix. Använda omvandlingen och plätering protokoll som beskrivs ovan (steg 2.2.5). Utföra en koloni PCR att identifiera Kan resistenta bakterier som innehåller rätt α-MHC-pEGFP-miR-181-sponge sekvens. Design screening primers för PCR över ligering korsningen. Se tabell 1 för primer sekvenser.
- Förstärka och sekvens vektorn. Expandera de PCR-positiva klonerna i LB-Kan buljong och plasmider renas med hjälp av standard mini prep plasmid rening protokoll. Utföra en DNA-sekvensering för att verifiera plasmiden uttrycker de önska DNA-sekvenserna.
4. generering av stabila H9c2 miR-181-svamp att uttrycka celler
-
Tillväxt och underhåll av H9c2 celler
- Kultur H9c2 cellerna i Dulbeccos modifierade örnens Medium (DMEM) innehållande fetalt bovint serum (FBS) till en slutlig koncentration på 10%. Sub odla cellerna använder standardprotokoll och odla dem vid 37 ° C i 5% koldioxid.
-
Transfection och urval av H9c2 α-MHC-pEGFP-C1-miR-181-sponge uttrycka celler
- Utföra en elektroporation av H9c2 celler för bästa resultat. Transfect rat myoblasts (H9c2) med antingen en rusning svamp (en 284-nt-långa rusning sekvens som ersätter miR-181-svamp-sekvensen) eller den α-MHC-pEGFP-miR-181-sponge konstruktionen med en electroporator.
- Kort, transfect 4 x 10-5 celler med 2 μg av plasmid DNA (i 5 µL H2O) och 100 µL av en lösning som är förenlig med elektroporation enheten. Använda en elektroporation program av DS-120 för att transfect de H9c2 cellerna.
- Inkubera transfekterade cellerna i kyvetten i 10 min i rumstemperatur. Tillsätt 500 µL av DMEM direkt till kyvetten. Försiktigt överför totala kyvetten innehållet till en väl 6-bra platta.
- Välj för god Jordbrukarsed positiva celler efter 48 h efter transfection av FACs. Platta bara GFP-uttryckta cellerna till en 6-well platta med ett tillägg av neomycin (G418) (400ng/mL) till komplett tillväxt medier.
Obs: Före G418 valet, en kill kurva bör fastställas för att fastställa beloppet av neomycin krävs för urval. För H9c2 celler, 400 ng/mL G418 resulterade i en ca 80% dödligheten av icke-plasmid transfekterade H9c2 celler efter 24 h och ansågs vara den önska arbeta koncentrationen av G418 för dessa celler. Cellinje ansågs stabila efter tillväxt bibehölls i G418 för 16 dagar. - Utföra FACs sortering av G418 stabil cellerna använder uttrycket av GFP som en markör för en svamp positivt urval. Utsäde 5-10 celler i varje brunn en plattan med 96 brunnar av flow-sortering. Expandera de monoklonala cellerna från plattan med 96 brunnar till 24 brunnar över flera passager. Använd frys lager av celler från passage 3 (P3) celler som utgångspunkt för senare experiment.
- Utföra alla cell-linjen-baserade experiment med låg-passage celler mellan P5 och P10.
- Utföra en elektroporation av H9c2 celler för bästa resultat. Transfect rat myoblasts (H9c2) med antingen en rusning svamp (en 284-nt-långa rusning sekvens som ersätter miR-181-svamp-sekvensen) eller den α-MHC-pEGFP-miR-181-sponge konstruktionen med en electroporator.
5. Sammanfattning och rening av svamp-nanopartiklar (miR-181-svamp nanopartiklar)
- Förbered de liposomalt nanopartiklarna genom upplösning katjoniska amphiphile (DOTAP) och samtidig lipider, kolesterol och DSPE-PEG-OMe, i förhållandet 5:5:0.1 mM, respektive, i en blandning av kloroform och metanol i en injektionsflaska av glas.
- Ta bort organiska lösningsmedel på 44-45 ° C, under ett vakuum med hjälp av en roterande indunstare, följt av en skonsam flöde fuktfri kväve. Håll återstående torkade filmen av lipid under en hög vakuum för 8 h.
- Förbered en blandning genom att tillsätta 5% glukos till vakuum-torkade lipid filmen. Lämna den över natten för att tillåta denna blandning att återfukta filmen. Vortex injektionsflaskan under 2 till 3 minuter vid rumstemperatur för att producera multilamellar blåsor med en enstaka skakar i 45 ° C vattenbad.
- Sonikera de multilamellar blåsor för att förbereda små unilamellar blåsor i ett isbad för 3-4 min tills tydlighet kan observeras, på en 100% arbetscykel och 25 W uteffekt.
- Blanda antingen en rusning sekvens eller en miR-181-svamp sekvens klonade in i pEGFP(α-MHC) vektorer och Liposom på 1:3 kostnad baserat på basis att bilda den nanovector4.
Obs: En elektrostatisk komplex av positivt laddade liposomalt nanopartiklar och negativt laddade plasmid DNA är känd som en nanovector.
6. systemisk leverans av svamp-nanopartiklar och validering av In Vivo effekterna
-
Systemiska leverans av svamp-nanopartiklar i råttor
- Använd Sprague-Dawley (SD) råttor. Injicera råttorna intravenöst med miR-181-svamp nanovector eller rusning nanovector genom svansen. Använda SD hanråttor, som är ca 200 g i vikt.
- Utföra svans ven injektion med en dos på 4 mg nanovector/kg kroppsvikt och upprepa detta med en regim av 6 svans ven injektioner över 2 veckor. Efter upprepade nanovector leverans, möjliggöra en 1-veckorsperiod (dagar 15-21) uttrycket av vektor i vivo.
- Bekräfta optimeringen av imaging GFP signalen före, under och efter nanovector leverans. Analysera GFP signalen genom tomografiska bildprogram, som genererar semikvantitativt data.
-
Validering av i vivo miR-181 hämning av miR-181-svampen
- Utföra western blot för att demonstrera ett uttryck för en funktionell miR-181-svamp i hjärtat.
Obs: För denna studie undersöktes mt-COX1 uttryck.
- Utföra western blot för att demonstrera ett uttryck för en funktionell miR-181-svamp i hjärtat.
-
Funktionella konsekvenser uttrycksformer i vivo miR-181-svamp i hjärtat
- Utföra en tvådimensionell, M-läge och Doppler ekokardiografi under och efter nanovector leverans att analysera hjärtfunktion och morfologiska förändringar. För en bättre analysförmåga gnagare hjärtan, Använd ett ultraljud system utrustade med en 15 MHz linjär array givare.
- Anestesi kan påverka den hjärtats kontraktiliteten; Därför utföra leveransen av miR-181-svamp nanovector eller rusning nanovector till djur som är medvetet och utan någon bedövning reagens under processen ekokardiografi. Vänligen se Das, et al. 4 för ytterligare förtydligande.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I stabilt transfekterade pEGFP-miR-181-svamp-uttryckande H9c2 celler (från steg 4,2) minskade måttligt uttrycket av familjen hela miR-181 (miR-181a, miR-181b, miR - 181c och miR - 181d) i förhållande till pEGFP-äggröra-uttryckande H9c2 celler. MiR-181-svamp fungerar som en kompetitiv hämmare av hela miR-181 familjen, så vi förutsåg att rikta uttrycket av miR - 181c mitokondriella genen, mt-COX1, skulle öka. Western blot data tyder på att mt-COX1 uttrycket höjdes i pEGFP-miR-181-svamp-uttryckande H9c2 cellerna jämfört med pEGFP-scramble-uttryckta H9c2 cellerna. Dessutom var ingen uttryck förändringar för mt-COX2 eller mt-COX3 upptäckta via immunoblot i pEGFP-miR-181-svamp-uttryckande H9c2 celler. Α-tubulin använde vi som kontrollen normalisering för immunoblotting analys. GFP signaler observerades huvudsakligen i lever och njure upp till 2 veckor efter systemisk leverans av den miR-svamp nanovector (figur 1A). GFP uttrycket var dock betydligt högre i hjärtat efter 3 veckor av miR-181-svamp nanovector leverans (figur 1A och 1B). Notera, det fanns en god Jordbrukarsed signal upptäckt i levern vävnad hos vissa djur 3 veckor efter den systemiska leveransen. Det fanns dock inga funktionella effekter av miR-181-svampen i levern vid denna tidpunkt.
Western blot uppvisade en betydande ökning i mt-COX1 uttrycket i miR-181-svamp nanovector-insprutning råttor jämfört med rusning nanovector grupper (figur 2). Högre mt-COX1 antyder att det finns en lägre miR - 181c uttryck i hjärtat efter 3 veckor av miR-181-svamp nanovector leverans, som mt-COX1 är det direkta målet för miR - 181c. Vi använde α-tubulin som normalisering kontroll för immunoblots.
Ekokardiografi visade ingen förändring i hjärtfunktionen miR-181-svamp nanovector-insprutning rats före, under och i slutet av behandlingsregim, jämfört med den rusning nanovector gruppen av djur.
Figur 1. In vivo analys av nanovector leverans av miR-181-svampen. (A) denna panel visar protokollen optimerad 3-veckors behandling med 6 intravenösa injektioner genom svansen. Den gula färgsättning i epifluorescence bilden visar uttrycket av pEGFP vektorn. Maximala intensiteten i den gula färgläggning observeras vecka 3 tidpunkt. (B), att α-MHC arrangören sekvens i pEGFP vektorn uttrycker selektivt antingen miR-181-svampen eller kodade sekvensen i hjärtat på dag 21. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Validering av effekten av miR-181-svamp nanovector på miR - 181c uttryck. Detta är western blot analys av mt-COX1 uttrycket i det hjärtat lysates erhålls från pEGFP-scramble och pEGFP-miR-181-svamp nanovector-insprutning råttor. Hela-hjärta homogenates var utforskad med de angivna antikropparna. Vi använde α-tubulin som lastning kontroll. Den band-densitometry visas i stapeldiagrammet nedan. Student's t-test utfördes, och medelfel var ritade i stapeldiagrammet som felstaplar. p < 0,05 vs. pEGFP-scramble grupp. n = 4.
| Primer namn | Sekvens | TM | Anteckningar | Användning | Mål | |
| SAM3-1F | ATGCATTAGTTATTAATGCTT GACACACTTGACAATTTCT |
58,4 | Rat MHC arrangören att klona in andra | PCR | MHC arrangören | |
| SAM3-2R | GACCGGTAGCGCTAGCTG ACTCACTGGGAGATTGCTT |
59,8 | Rat MHC arrangören att klona in andra | PCR | MHC arrangören | |
| SAM3-3F | CGAACGACCTACACCGAACT | 64 | Skärmen andra-F | Kolonin PCR | Positiv arrangören kloner | |
| SAM3-4R | CGCTAGTCCTTGACCCTCTG | 63,9 | Skärmen MHC-R | Kolonin PCR | Positiv arrangören kloner | |
| SAM5-1F | CCTGTCTCCAACACACAAGC | 59,3 | Sekvens MHC arrangören | Sekvensering | MHC arrangören | |
| SAM5-2R | CAGACTGCAGGGCTGGTT | 60 | Sekvens MHC arrangören | Sekvensering | MHC arrangören | |
Tabell 1. Primer-sekvenser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den här artikeln beskrivs design och syntes av en miRNA-svamp och visat hur vävnadsspecifika uttrycket av svampen är ett kraftfullt verktyg att hämma vävnadsspecifika miRNA familjeuttryck.
Vi har visat att en miR-181 familj inriktning svamp kan klonas in i ett uttryck plasmid med en hjärt-specifika promotorn. Plasmiden kan vara effektivt förpackad till en nanovector för leverans både in vitro- och in-vivo med elektroporation eller en svans ven injektion, respektive (figur 1). MiR-181 svampen kan hämma ett hjärt-specifika uttryck i familjen miR-181 och kan påverka uttrycket av miR-181 målgener (figur 2). Den god Jordbrukarsed i plasmiden är en extra fördel, som kan visualisera leveransen och nanovector uttryck profil utan att offra djur.
Kort, en miRNA-svamp består av en serie av miRNA antisense sekvenser placeras efter en reporter gen som fungerar som en bulvan miRNA rikta mRNA. Naturligt hittats förekommande miRNA-svampar endogenously uttrycks i växter och djurceller som länge icke-kodande RNAs (lncRNAs)17. I den aktuella studien, har vi utnyttjat en svamp strategi för att hämma hela miR-181 familjen i hjärtat. Även om metoden med miR-181-svamp är ett fysiologiskt relevanta metod till downregulate familjen miR-181 i odlade celler, kan ansökan i vivo av miR-181-svampar vara skadligt. Till exempel har flera studier visat en skyddande roll av miR-181a och miR-181b i olika cell/vävnad typer18,19,20. MiR-181-svamp uttrycket bör därför riktas specifikt till hjärtat vävnad.
Liten oligonukleotider har påvisats för att blockera funktionen miRNA genom glödgning till mogen miRNA guide delen och förhindra en ordentlig påfyllning av RNA-inducerad ljuddämpningssystemet komplexet (RISC). Ett problem i samband med detta tillvägagångssätt är att oligonukleotider har levereras i en mättar dos som är tillräcklig för att blockera cellulära pooler av mogen microRNA. Oligonukleotider lider också utmaningar som innefattar transport över cellmembran och en allmän stabilitet av molekylen. Genialiskt, har det visats att ett exogent medföljande miRNA mål kan fungera som ett lockbete för dess cognate miRNA21. Enligt flera bindningsställen bundna tillsammans i en pseudo 3' UTR konstruera, decoy målet, eller miRNA-svamp, kunna stabilt interagera med dess mål MicroRNA och binda miRNA i microribonucleoprotein komplex (miRNPs), således effektivt förhindrar att funktionen miRNA. Så kallade ”miRNA-svampen” är en effektiv anti sense teknik, som kan effektivt downregulate miRNA både in vitro- och in vivo. Tillämpningen av en miRNA-svamp kan därför användas för att studera miRNA förlust-av-funktion fenotyper.
Föreställningen att RNA-interferens (RNAi) kan leda till en ny klass av therapeutics uppmärksammats har av många utredare snart efter dess upptäckt. Fältet för tillämpad RNAi therapeutics har flyttat mycket snabbt från lab till säng. För närvarande miRNA therapeutics är en av de snabbväxande terapeutiska ingripandena i onkologi och är för närvarande i fas 1 kliniska prövningar. Antisense oligonukleotider eller antagomirs, är en av de mest använda miRNA hämmande strategierna. Ma et al. 22 används miR-10b antagomir, både in vitro- och in-vivo, att tysta uppreglerad miR-10b i en solid tumör.
In vivo, det effektiv ljuddämpning av ledhinnans MicroRNA kräver en kemisk modifiering av antagomirs att förbättra affinitet, biostability och farmakokinetiska egenskaper. Att öka duplex smälttemperatur (Tm) och förbättra nuclease motståndet av antagomirs, kan kemiska modifieringar utföras, som 2 '-O-metyl (2 '-O-Me), 2 '-O-methoxyethyl (2′-MOE) 2′-fluoro och de bicykliska-locked nucleic acid ( LNA)23,24,25,26,27,28,29,30,31. För en bättre effektivitet i vivo leverans, kan antagomir ändras av phosphorothioate (PS) kopplingar, som har ökat i nuclease motstånd28. Dessutom förbättra PS ryggraden ändringar också bindningen till plasmaproteiner minskar urinutsöndringen. PS-modifierat antagomirs visar alltså, en betydande förbättring av farmakokinetiska egenskaper, underlätta deras systemisk leverans32. Det har också visat att använda peptid-nukleinsyra (PNA) eller morpholino oligomerer, utformade för att rikta en specifik miRNA, kan användas för att studera miRNA förlust-av-funktion fenotyper33,34,35, 36 , 37 , 38 , 39. Polylysine-konjugerat och nanopartiklar-komplex PNA antagomirs effektivt hämmar miRNA fungera både in vitro- och in-vivo36,37,38, 39. Trots senaste framsteg, en effektiv och vävnadsspecifika leverans av miRNA-derivat är fortfarande en utmaning. Dessa inkluderar potentialen för off-target effekter, utlöser medfödda immunsvar och, viktigast av allt, få en viss leverans in i cellerna av riktade organ/vävnader.
Dessutom miRNA uttrycksnivåerna varierar kraftigt beroende på cellen och vävnad typ40. Dessutom kan miRNA uttrycket ökas eller minskas vid sjukdom. En följd av en förändrad miRNA uttryck och effekten på cellulär och vävnad funktion med svamp-hämmade miRNA uttryck måste valideras och bestäms empiriskt. Omfattande prekliniska studier i animaliska sjukdomsmodeller behövs för att bestämma den optimala nivån av hämning för en given miRNA mål.
Intressant, uppvisar miR - 181c miRNA subcellulär uppdelning3,4,5. Specifikt, som förväntat, de miR-181s kodas i kärnan och transkriberat som long-pri-miRNA avskrifter som bearbetas i cytoplasman tärningstävling maskineriet och införlivas med RISC. Men till skillnad från canonical MicroRNA som fungerar i cytoplasman, translocates mogen form av miR - 181c in i mitokondrierna och funktioner i regleringen av mitokondrie-specifika gener3. Vi har visat att miR-181-svampen kan binda mogen form av miR - 181c i cytoplasmiska fraktionen, därmed förhindra på flyttning till mitokondrierna. Följaktligen kan en uppreglering av mt-COX1 observeras i mitokondrierna villkor i en nedreglering av miR - 181c uttrycket.
Vi har rapporterat den metodik som krävs för att utforma en miRNA-svamp för att slå ner ett uttryck för någon miRNA och beskrivs ett protokoll för programmet i vivo av miRNA-svampen. Vävnadsspecifika miRNA hämning är för närvarande ett underutvecklat teknik i fältet miRNA. Vikten av nedreglering eller funktionella hämning av ledhinnans MicroRNA i mänskliga sjukdomar tyder på att det kan vara möjligt att utnyttja miRNA biologi för terapeutisk intervention.
Denna studie belyste en strategi för att sänka en miRNA, som framgångsrikt kan användas i en vävnad-specifika sätt i vivo. De miRNA-svampar utnyttjar antisense sekvensen av sekvensen miRNA ”frö”. Därför miRNA-svampar kan downregulate alla de MicroRNA som delar samma ”frö” sekvens, dvs, familjen hela miRNA. I denna studie har vi observerat en betydande nedreglering av familjen hela miR-181 (miR-181a, miR-181b, miR - 181c och miR - 181d) med uttryck för miR-181-svampen, både in vitro- och in vivo. Om en familjemedlem ger skydd medan en annan familjemedlem har negativa effekter inom samma organ, skulle med hjälp av miRNA-svamp-teknik inte vara den perfekta strategin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Anthony K. L. Leung av Institutionen för biokemi och molekylärbiologi, Bloomberg School of Public Health, Johns Hopkins University för hans tekniska hjälp utforma den miR-181-svamp bygga. Vi tackar också Polina Sysa-Shah och Kathleen Gabrielson av Department of Molecular och jämförande patobiologi, Johns Hopkins Medical institutioner för deras tekniskt bistånd av de in-vivo imaging av miRNA-Sponge leveransen.
Detta arbete fick stöd genom bidrag från NIH, HL39752 (till Charles Steenbergen) och av en vetenskapsman utveckling bidrag från den American Heart Association 14SDG18890049 (till Samarjit Das). Rat cardio-specifika promotorn lämnades generöst av Jeffery D. Molkentin vid Cincinnati Children's Hospital.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pEGFP-C1 vector | Addgene | 6084-1 | |
| In-fusion | Clontech | 121416 | |
| QIAprep Miniprep | Qiagen | 27104 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| miR-181-sponge synthesis | Introgen GeneArt | custome made | |
| PCR primers | Integrated DNA Technologies | custome | |
| EcoRI enzymes | New Endland Biolabs | R0101S | |
| KpnI enzymes | New Endland Biolabs | R0142S | |
| Rapid DNA Ligation Kit | Sigma-Aldrich | 11635379001 | |
| H9c2 cells | ATCC | CRL-1446 | |
| DMEM Media | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082139 | |
| Nucleofector 2b Device | Lonza | AAB-1001 | |
| Nucleofector Kits for H9c2 (2-1) | Lonza | VCA-1005 | |
| G418, Geneticin | Thermo Fisher Scientific | 11811023 | |
| FACSAria II Flow cytometer | BD Bioscience | 644832 | |
| Branson 450 sonifier | Marshall Scientific | EDP 100-214-239 | |
| The Xenogen IVIS Spectrum optical imaging device | Caliper Life Sciences | ||
| Anti-MTCO1 antibody | Abcam | ab14705 | |
| α-tubulin antibody | Abcam | ab7291 | |
| Sequoia C256 ultrasound system | Siemens |
References
- Hammond, S. M. microRNA detection comes of age. Nat Methods. 3 (1), 12-13 (2006).
- van Rooij, E., Olson, E. N. MicroRNAs: powerful new regulators of heart disease and provocative therapeutic targets. The Journal of Clinical Investigation. 117 (9), 2369-2376 (2007).
- Das, S., et al. Nuclear miRNA regulates the mitochondrial genome in the heart. Circulation Research. 110 (12), 1596-1603 (2012).
- Das, S., et al. miR-181c regulates the mitochondrial genome, bioenergetics, and propensity for heart failure in vivo. PLoS One. 9 (5), e96820 (2014).
- Das, S., et al. Divergent effects of miR-181 family members on myocardial function through protective cytosolic and detrimental mitochondrial microRNA targets. Journal of the American Heart Association. 6 (3), e004694 (2017).
- Sicard, F., Gayral, M., Lulka, H., Buscail, L., Cordelier, P. Targeting miR-21 for the therapy of pancreatic cancer. Molecular Therapy. 21 (5), 986-994 (2013).
- Jopling, C. L., Yi, M., Lancaster, A. M., Lemon, S. M., Sarnow, P. Modulation of hepatitis C virus RNA abundance by a liver-specific microRNA. Science. 309 (5740), 1577-1581 (2005).
- Lanford, R. E., et al. Therapeutic silencing of microRNA-122 in primates with chronic hepatitis C virus infection. Science. 327 (5962), 198-201 (2010).
- Ucar, A., et al. The miRNA-212/132 family regulates both cardiac hypertrophy and cardiomyocyte autophagy. Nature Communications. 3, 1078 (2012).
- Zhu, X., et al. Identification of micro-RNA networks in end-stage heart failure because of dilated cardiomyopathy. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (9), 1173-1187 (2013).
- Bandiera, S., et al. Nuclear outsourcing of RNA interference components to human mitochondria. PLoS One. 6 (6), e20746 (2011).
- Barrey, E., et al. Pre-microRNA and mature microRNA in human mitochondria. PLoS One. 6 (5), e20220 (2011).
- Bian, Z., et al. Identification of mouse liver mitochondria-associated miRNAs and their potential biological functions. Cell Research. 20 (9), 1076-1078 (2010).
- Kren, B. T., et al. MicroRNAs identified in highly purified liver-derived mitochondria may play a role in apoptosis. RNA Biology. 6 (1), 65-72 (2009).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
- Molkentin, J. D., Jobe, S. M., Markham, B. E. Alpha-myosin heavy chain gene regulation: delineation and characterization of the cardiac muscle-specific enhancer and muscle-specific promoter. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 28 (6), 1211-1225 (1996).
- Poliseno, L., et al. A coding-independent function of gene and pseudogene mRNAs regulates tumour biology. Nature. 465 (7301), 1033-1038 (2010).
- Henao-Mejia, J., et al. The microRNA miR-181 is a critical cellular metabolic rheostat essential for NKT cell ontogenesis and lymphocyte development and homeostasis. Immunity. 38 (5), 984-997 (2013).
- Williams, A., Henao-Mejia, J., Harman, C. C., Flavell, R. A. miR-181 and metabolic regulation in the immune system. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 78, 223-230 (2013).
- Hori, D., et al. miR-181b regulates vascular stiffness age dependently in part by regulating TGF-beta signaling. PLoS One. 12 (3), e0174108 (2017).
- Ebert, M. S., Sharp, P. A. MicroRNA sponges: progress and possibilities. RNA. 16 (11), 2043-2050 (2010).
- Ma, L., et al. Therapeutic silencing of miR-10b inhibits metastasis in a mouse mammary tumor model. Nature Biotechnology. 28 (4), 341-347 (2010).
- Davis, S., Lollo, B., Freier, S., Esau, C. Improved targeting of miRNA with antisense oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 34 (8), 2294-2304 (2006).
- Davis, S., et al. Potent inhibition of microRNA in vivo without degradation. Nucleic Acids Research. 37 (1), 70-77 (2009).
- Elmen, J., et al. LNA-mediated microRNA silencing in non-human primates. Nature. 452 (7189), 896-899 (2008).
- Esau, C. C. Inhibition of microRNA with antisense oligonucleotides. Methods. 44 (1), 55-60 (2008).
- Stenvang, J., Kauppinen, S. MicroRNAs as targets for antisense-based therapeutics. Expert Opinion on Biological Therapy. 8 (1), 59-81 (2008).
- Lennox, K. A., Behlke, M. A. A direct comparison of anti-microRNA oligonucleotide potency. Pharmaceutical Research. 27 (9), 1788-1799 (2010).
- Lennox, K. A., Behlke, M. A. Chemical modification and design of anti-miRNA oligonucleotides. Gene Therapy. 18 (12), 1111-1120 (2011).
- van Rooij, E., Olson, E. N. MicroRNA therapeutics for cardiovascular disease: opportunities and obstacles. Nature Reviews. Drug Discovery. 11 (11), 860-872 (2012).
- Stenvang, J., Petri, A., Lindow, M., Obad, S., Kauppinen, S. Inhibition of microRNA function by antimiR oligonucleotides. Silence. 3 (1), 1 (2012).
- Levin, A. A. A review of the issues in the pharmacokinetics and toxicology of phosphorothioate antisense oligonucleotides. Biochimica et Biophysica Acta. 1489 (1), 69-84 (1999).
- Flynt, A. S., Li, N., Thatcher, E. J., Solnica-Krezel, L., Patton, J. G. Zebrafish miR-214 modulates Hedgehog signaling to specify muscle cell fate. Nature Genetics. 39 (2), 259-263 (2007).
- Kloosterman, W. P., Lagendijk, A. K., Ketting, R. F., Moulton, J. D., Plasterk, R. H. Targeted inhibition of miRNA maturation with morpholinos reveals a role for miR-375 in pancreatic islet development. PLoS Biology. 5 (8), e203 (2007).
- Martello, G., et al. MicroRNA control of Nodal signalling. Nature. 449 (7159), 183-188 (2007).
- Fabani, M. M., Gait, M. J. miR-122 targeting with LNA/2'-O-methyl oligonucleotide mixmers, peptide nucleic acids (PNA), and PNA-peptide conjugates. RNA. 14 (2), 336-346 (2008).
- Fabani, M. M., et al. Efficient inhibition of miR-155 function in vivo by peptide nucleic acids. Nucleic Acids Research. 38 (13), 4466-4475 (2010).
- Babar, I. A., et al. Nanoparticle-based therapy in an in vivo microRNA-155 (miR-155)-dependent mouse model of lymphoma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), E1695-E1704 (2012).
- Torres, A. G., et al. Chemical structure requirements and cellular targeting of microRNA-122 by peptide nucleic acids anti-miRs. Nucleic Acids Research. 40 (5), 2152-2167 (2012).
- Kent, O. A., McCall, M. N., Cornish, T. C., Halushka, M. K. Lessons from miR-143/145: the importance of cell-type localization of miRNAs. Nucleic Acids Research. 42 (12), 7528-7538 (2014).
