Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

In Vivo Nanovector levering van een hart-specifieke MicroRNA-spons

Published: June 15, 2018 doi: 10.3791/57845
Automatic Translation
1, 2, 2
1Princess Margaret Cancer Centre, University of Toronto, 2Department of Pathology, Department of Cardiology, Johns Hopkins University

Summary

Weefsel-specifieke microRNA remming is een technologie die in het veld microRNA onderontwikkeld is. Hierin beschrijven we een protocol om met succes het remmen van de familie van de miR-181 microRNA in myoblast cellen uit het hart. Nanovector technologie wordt gebruikt voor het leveren van een microRNA spons die significante in vivo cardio-specifieke miR-181 familie remming toont.

Abstract

MicroRNA (miRNA) is klein niet-coderende RNA die post-transcriptional boodschapper-RNA (mRNA) expressie remt. Menselijke ziekten, zoals kanker en hart-en vaatziekten, hebben aangetoond dat het activeren van weefsel en/of cel-specifieke miRNA expressie die is gekoppeld met de progressie van de ziekte. De remming van miRNA meningsuiting biedt de mogelijkheid voor een therapeutische interventie. Traditionele benaderingen voor de remming van miRNAs, dienst antagomir oligonucleotides, beïnvloeden echter specifieke miRNA functies op wereldwijde levering. Hierin presenteren wij een protocol voor de in vivo cardio-specifieke remming van de miR-181-familie in een rat-model. Een miRNA-spons construct is ontworpen om 10 herhaalde anti-miR-181 bindende sequenties. De cardio-specifieke α-MHC promotor wordt gekloond in de ruggengraat van de pEGFP om te rijden de cardio-specifieke miR-181 miRNA-spons-expressie. Als u wilt maken van een stabiele cel zijn lijn uitdrukken van de miR-181-spons, myoblast H9c2 cellen transfected met de α-MHC-EGFP-miR-181-sponge constructie en gesorteerd door fluorescentie-activated cell sorting (FACs) in GFP positieve H9c2 cellen, die worden gekweekt met Neomycine (G418). Naar aanleiding van stabiele groei in neomycine, zijn monoclonal cel populaties opgericht door extra FACs en eencellige klonen. De resulterende myoblast H9c2-miR-181-spons-GFP cellen vertonen een verlies van functie van miR-181 familieleden zoals beoordeeld door de verhoogde expressie van miR-181 doel eiwitten en vergeleken met H9c2 cellen, uiting geven aan een niet-functionele spons scramble. Bovendien ontwikkelen wij een nanovector voor de systemische levering van de miR-181-spons constructie door complexvormers positief geladen Liposomale nanodeeltjes en negatief geladen miR-181-spons plasmiden. In vivo imaging van GFP blijkt dat meerdere staart ader injecties van een nanovector een drie weken durende periode kunnen bevorderen een belangrijke uiting van de miR-181-spons op een cardio-specifieke wijze. Nog belangrijker is, wordt een verlies van miR-181 functie waargenomen in het hartweefsel maar niet in de nieren of de lever. De miRNA-spons is een krachtige methode voor de remming van weefsel-specifieke miRNA expressie. Rijden de miRNA-spons expressie van een weefsel-specifieke promotor biedt specificiteit voor de remming van de miRNA, die kan worden beperkt tot een gerichte orgaan of weefsel. Bovendien maakt combineren nanovector en miRNA-spons technologieën een effectieve levering en weefsel-specifieke miRNA remming in vivo.

Introduction

In de afgelopen twee decennia, zijn er tal van studies die hebben gewezen op de belangrijke rol van miRNAs in ziekten bij de mens. Bevindingen van een grote hoeveelheid literatuur tonen het onmiskenbare belang van miRNAs in de pathofysiologie van ziekten, zoals kanker1 en hart-en vaatziekten2,,3,,4,5. MiR-21 is bijvoorbeeld upregulated in vele vormen van kanker, wat resulteert in een verhoogde celcyclus en cel proliferatie6. MiR-122 speelt een belangrijke rol in de replicatie van het virus7in hepatitis-C-infecties, en het heeft aangetoond dat de remming van de miR-122 de virale lading-8 vermindert. In de hypertrofie van het hart, miR-212/132 is upregulated in het hart en is betrokken bij de pathologisch fenotype9. Het voor de hand liggende belang van de Downregulatie of functionele remming van een upregulated miRNA suggereert kansen voor de therapeutische exploitatie de miRNA biologie in bijna alle ziekten.

De vier miR-181 familieleden, miR-181 a/b/c/d, zijn te vinden in drie genomic locaties in het menselijk genoom. De intronic regio van een niet-coderende RNA host gen (MIR181A1-HG) codeert het cluster van miR-181-a/b-1. De intronic regio van het NR6A1-gen codeert de miR-181-a/b-2. De miR-181-c/d-cluster bevindt zich in een genfunctieonderzoek transcript op chromosoom 19. Alle de miR-181 familieleden delen dezelfde "zaad" volgorde en alle vier miR-181 familieleden mogelijk dezelfde mRNA doelstellingen kunnen regelen.

Wij3,-4 en anderen10 hebben gewezen op het belang van de leden van de familie van de miR-181 tijdens de einde-fase hartfalen. Wij hebben ook erkend dat een miR - 181c opregulatie onder pathologische voorwaarden in verband met een verhoogd risico op hart-en vaatziekten, zoals type II diabetes, zwaarlijvigheid en veroudering3,4,5 optreedt. Het heeft zijn gepostuleerd dat de overexpressie van miR - 181c veroorzaakt oxidatieve stress die tot een cardiale dysfunctie4 leidt.

Verschillende groepen hebben gesuggereerd dat de miRNA bestaan in mitochondriën11,12,13,14, maar wij de eersten om aan te tonen dat miR - 181 c is afgeleid van het nucleair genoom waren, verwerkt, en vervolgens translocated naar de mitochondriën in de RISC-3. We hebben bovendien een lage uitdrukking van miR-181 a en miR-181b gedetecteerd in de mitochondriale compartiment van de hart-5. Nog belangrijker is, hebben we gevonden dat miR - 181c onderdrukt de mt-COX1 mRNA uitdrukking, aldus aan te tonen dat miRNAs deelnemen aan de mitochondriale genregulatie en veranderen van mitochondriale functie3,4.

Dit artikel bespreekt de methodologie moet ontwerpen een miRNA-spons voor het hele gezin van de miR-181 in cardiomyocytes neerhalen. Anderzijds schetsen we een protocol voor de in vivo toepassing van de miR-181-spons.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle experimentele procedures werden goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité van Johns Hopkins University.

1. spons Design

  1. MicroRNA bindend 3' UTR
    Opmerking: A miRNA functies door middel van specifieke basis pairing interacties met gedeeltelijk aanvullende sites in de 3' niet-vertaalde regio (UTR) van haar doel mRNAs (Zie voor een uitgebreide evaluatie, Bartel)15.
    1. Het ontwerp van de inhibitors van miRNA expressie als oligonucleotides die aanzienlijke complementariteit in de miRNA reeks bevatten. Een miRNA in een complexe via uitgebreide basis koppeling te blokkeren de miRNA functie oligonucleotide sekwestreren.
  2. Ontwerp van een spons van miRNA
    1. Ontwerp gekleed tandem gedeeltelijk complementaire miRNA sequenties tot een uitstulping op de positie die doorgaans gekloofd door Argonaute 2. De Ardennen is bij nucleotiden 9-12 van de volwassen miRNA sequentie om te voorkomen dat RNA interferentie type splijten en de degradatie van de spons geplaatst.
    2. Indien gewenst, ontwerpen de lokvogel doel volgorde te binden aan alle familieleden van de miR-181. Na een onderzoek en vergelijking van de miR-181 familie miRNA sequenties, vinden van een gemeenschappelijke reeks op de 5'-kant van de Ardennen met 8 opeenvolgende nucleotiden, of een reeks gemeenschappelijke aan alle 4 miR-181 familieleden vinden aan de 3'-kant van de Ardennen een extra 8 opeenvolgende nucleotiden. Deze 2 reeksen vertegenwoordigen de linker en rechter helft bandplaatsen, respectievelijk.
      Opmerking: De lokvogel-reeks is een array van de tandem van de linker en rechter helft bandplaatsen gescheiden door een spacer GGA. Aan elkaar koppelen de 5'-eind-reeks en de volgorde van de 3'-kant (beschreven in stap 1.2.2) met een GGA spacer ontworpen voor het maken van de Ardennen als gegloeid om een miRNA (zoals beschreven in stap 1.2.1). Herhaal deze 1 miRNA bindende site 10 x in de structuur van de definitieve miR-spons.
  3. Andere overwegingen miRNA spons
    Opmerking: Om kloon de volgorde van de spons in de ontvangende expressie vector, beperkingsplaatsen nuclease erkenning moet aan elk uiteinde van de reeks. Een spijsvertering in silico analyse moet worden gebruikt ter bevestiging van het niet-specifieke splijten van de spons-reeks door de gekozen restrictie-enzymen en andere enzymen van de beperking in downstream klonen toepassingen gebruikt.
    1. Voeg een dubbele stop codon (TAA TAA) aan het 5'-eind van de synthetische 3' UTR, zodanig dat de volgorde van de miR-181-spons geen deel uit van de volgorde van de codering voor een verbeterde groen fluorescent proteïne (EGFP maakt).
  4. Synthese van de spons van DNA voor het klonen
    1. Gebruik je een DNA synthesizer of een commercieel beschikbare bron voor het synthetiseren van de definitieve miRNA spons volgorde met nuclease erkenning beperkingsplaatsen in plaats voor het klonen van dienst. De spons is verzonden op een plasmide die selecteerbare merkers voor een versterking in bacteriën kan bevatten. Verder, de spons kan worden versterkt door een polymerase-kettingreactie (PCR) voor het klonen of gewoon afgevallen de vector van de donor met behulp van de beperkingsplaatsen in stap 1.3 beschreven (Zie ook stap 3.1).

2. klonen de ontvangende Vector als u wilt opnemen van een weefsel-specifieke promotor

Opmerking: Gebruik de vector pEGFP-C1 als de ontvangende vector voor de cassette van de expressie van de miRNA spons. De pEGFP-C1-vector bevat een leesraam voor een EGFP gedreven door een promotor cytomegalovirus (CMV). De CMV-promotor is constitutively actief in zoogdiercellen. Als een weefsel-specifieke promotor vereist is, kan de CMV-promotor worden verwijderd door vertering van AseI en NheI enzymen (zie stap 2.1). Het plasmide bevat een uitgebreide meerdere klonen site (MCS) en kanamycine (Kan) en neomycine (G418) markeringen voor een selectie in bacteriën en een stabiele expressie in zoogdiercellen, respectievelijk.

  1. De CMV-promotor verwijderen uit pEGFP-C1
    1. 50 μl van spijsvertering reactie met 1 x verkrijgbare digest buffer gesuggereerd door de vervaardiging van de enzymen van de beperking gebruikt, 5 μg plasmide DNA (in water) en 5 μl van AseI en NheI enzymen maken. Alle onderdelen toevoegen aan een microcentrifuge buis en meng ze zachtjes door het flicking. Draai de buis voor 10 s in een microcentrifuge voor het verzamelen van de reactie op de bodem. Incubeer de reactie in een waterbad 37 ° C gedurende 15 minuten.
    2. Zuiveren het verteerd gelineariseerde plasmide. Voeg 5 x het volume van de reactie van kolom bindende buffer (een eigen mix van de juiste bindende buffer voor de vervaardiging van de DNA zuivering kolommen gebruikt) en te zuiveren van de reactie met een DNA zuivering kolom zoals beschreven door de fabrikant. Elueer met 25 μL van elutie buffer (water) zorgvuldig aan het midden van de kolom toegevoegd.
    3. Gel zuiveren het verteerd plasmide op 0,5% agarose gel als volgt: 5 μl van het laden van de buffer (50% glycerol-3 x laden kleurstof) aan de eluted plasmide toevoegen. Laad het gehele monster in 1 goed op 0,5% agarose gel. Opnemen van een afzonderlijke lane met 500 ng van Onbesneden vector. Stormloop op voor 30-40 min tot een adequate functiescheiding knippen en Onbesneden plasmiden is bereikt.
    4. Zuiveren van de gelineariseerde plasmide als volgt: het DNA in de agarose gel op een lichtbak UV visualiseren. Met een schone scheermesje, accijnzen zorgvuldig de band die overeenkomt met de lineaire plasmide.
      Opmerking: Het lineaire plasmide lager is dan de Onbesneden plasmide wordt uitgevoerd en wordt weergegeven als een enkele band bij ongeveer 4.2 kb. De verwijderde CMV-promotor zal verschijnen als een lichte band op ongeveer 500 nucleotiden (nt).
    5. Uittreksel van het DNA van het segment van de gel met een commercieel beschikbare kit en elueer de DNA uit de kolom met 25 μL van water.
  2. Klonen van een hart-specifieke promotor in pEGFP-C1
    Opmerking: De alpha-myosin zware keten (α-MHC) promotor is eerder gekenmerkt en aangetoond dat zij directe robuuste niveaus van cardiale-beperkte expressie zoals beschreven in de volgende Molkentin, Jobe en Markham16. De volgende secties wordt beschreven hoe aan het versterken van de promotor van de vector voor het klonen.
    1. Kloon van de promotor van de α-MHC tussen elementen +420 aan-2934 ten opzichte van de transcriptie start site in de p40 plasmide16 door de eerste ontwerpen van PCR inleidingen die flank van deze regio, waarna de plasmide als een sjabloon voor PCR. De regio van de promotor met behulp van PCR inleidingen eerder beschreven5versterken. Voorwaartse en omgekeerde PCR inleidingen bevatten sequenties van overlap aan de verteerd uiteinden van de pEGFP-C1 (stap 2.1) toe In-Fusion geregisseerd klonen. Raadpleeg de handleiding van de In-Fusion voor een uitvoerige uitleg van de primer ontwerp voor het klonen van In-Fusion. Primer sequenties zijn te vinden in tabel 1.
    2. Bereiden van een PCR-reactie 50 μl, waarin 1 μM van elke primer en 10 ng van sjabloon DNA. Het toevoegen van een passend bedrag van PCR enzymen en dNTPs afhankelijk van de vervaardiging van de PCR Reagentia gekozen. PCR op een standaard DNA fietsen blok uitvoeren. Uitvoeren van een 3 min 98 ° C denaturering stap, gevolgd door 35 cycli van de denaturering, gloeien en uitbreiding voor 5, 30 en 120 s elke, respectievelijk. Opnemen van een definitieve verlenging van 10 minuten bij 72 ° C.
    3. Schoonmaken van de PCR en gel extractie. Na voltooiing van de PCR cyclus, 5 x het volume van de reactie van de kolom bindende buffer aan de PCR reactie toevoegen en het zuiveren met een DNA zuivering kolom zoals beschreven door de fabrikant. Elueer het mengsel met 25 μL van elutie buffer (water) zorgvuldig aan het midden van de kolom toegevoegd.
      1. Voeg toe 5 μl van het laden van de buffer [50% glycerol (3 x) laden kleurstof] naar plasmide geëlueerd. Laad het gehele monster in 1 goed op 1% agarose gel. Draaien voor 30-40 min; Visualiseer en accijnzen van het PCR-product zoals hierboven (stap 2.1.5) beschreven.
    4. Afbinden van de α-MHC promotor met de pEGFP-C1 als volgt: de 10 μL afbinding reactie met 1 x verkrijgbare afbinding buffer, 2 μL van gezuiverde PCR en 1 μL van gelineariseerde vector toevoegen. Het uitvoeren van de afbinding bij 50 ° C gedurende 15 minuten en vervolgens afkoelen in de ijskast.
    5. Uitvoeren van een bacteriële transformatie als volgt: transfect 50 μl van bevoegde cellen met 2,5 μL van-Fusion afbinding mix door de componenten toe te voegen. Rusten de Eppendorf buis op ijs gedurende 20 minuten, zet hem in een waterbad van 42 ° C voor 40 s, en vervolgens plaats de buis op ijs gedurende 2 minuten.
      1. Na de transformatie, Voeg 350 μL van SOC media en groeien van cellen bij 37 ° C gedurende 45 min. plaat 200 μL van uitgroei oplossing op LB platen met Kan. uitvoeren een PCR Kan resistente cellen waarin de α-MHC promotor afbinding opsporen van de kolonie.
        Opmerking: Screening inleidingen werden ontworpen om PCR over de kruising van de afbinding.
    6. Vouw de positieve klonen van PCR in LB-Kan Bouillon en plasmiden gezuiverd met behulp van standaard Mini prep plasmide zuivering protocollen zoals beschreven door de fabrikant.

3. het klonen van de spons

  1. De ontvangende vector verteren
    1. Breng het α-MHC-pEGFP-plasmide lineaire voor het klonen met EcoRI en KpnI en zuiveren van de gel zoals hierboven (stap 2.1) beschreven.
  2. PCR versterken en verteren de spons DNA
    1. De miR-181-spons en bijbehorende 284-nt-long scramble verzending vectoren als de sjabloon voor PCR te gebruiken. De regio van de spons met behulp van de eerder beschreven PCR inleidingen5versterken. Merk op dat voorwaartse en omgekeerde PCR inleidingen restrictie-enzym sequenties bevatten zodat afbinding in α-MHC-pEGFP-C1. PCR uitvoeren zoals beschreven hierboven (stap 2.2.2). Zuiveren van de PCR producten vóór de spijsvertering zoals beschreven (stap 2.2.3) en geëlueerd hen met water voor de spijsvertering. Zie voor primer sequenties, tabel 1.
    2. De spons DNA voor afbinding verteren. Een reactie van de spijsvertering 50 μl bevat 1 x digest buffer, de gel-gezuiverd PCR reactie uit stap 3.2.1 en 5 μL van zowel EcoRI als KpnI enzymen. Alle onderdelen toevoegen aan een microcentrifuge buis en meng ze zachtjes door het flicking. Draai de buis voor 10 s in een microcentrifuge voor het verzamelen van de reactie op de bodem. Incubeer de reactie in een waterbad 37 ° C gedurende 15 minuten.
    3. Zuiveren de verteerd PCR spons met behulp van een PCR-opschonen kolom zoals eerder is beschreven (stap 2.2.1).
  3. Het afbinden van de miR-181-spons in α-MHC-pEGFP-C1 vector
    1. Een 21 μL afbinding reactie waarin 1 x afbinding buffer ingesteld, 3 μL van verteerd en gezuiverd van miR-181-spons PCR, 1 μL van gelineariseerde α-MHC-pEGFP-C1 vector, 1 x DNA buffer en 1 μL van DNA ligase. Uitvoeren van de afbinding bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten en plaats het dan op ijs.
    2. Transformeren 50 μl van XL1-blauw bevoegde cellen met 2 μL van afbinding mix. Gebruik de transformatie en plating protocollen zoals hierboven (stap 2.2.5) beschreven. Het uitvoeren van een PCR te identificeren Kan resistente bacteriën waarin de tekenvolgorde van de α-MHC-pEGFP-miR-181-sponge van de kolonie. Screening inleidingen aan de PCR ontwerpen over de kruising van de afbinding. Zie tabel 1 voor primer sequenties.
    3. Versterken, en het volgnummer van de vector. De positieve klonen van PCR in LB-Kan Bouillon en plasmiden gezuiverd met behulp van standaard Mini prep plasmide zuivering protocollen uit te breiden. Het uitvoeren van een DNA rangschikkend om te controleren of het uitdrukken van de gewenste opeenvolgingen van DNA plasmide.

4. productie van stabiele H9c2 cellen van het uitdrukken van de miR-181-spons

  1. Groei en het onderhoud van de H9c2 cellen
    1. Cultuur de H9c2 cellen in de Dulbecco bewerkt Eagle's Medium (DMEM) met foetale runderserum (FBS) om een eindconcentratie van 10%. Sub cultuur de cellen gebruikt standaard protocollen en ze groeien bij 37 ° C in 5% kooldioxide.
  2. Transfectie en selectie van H9c2 α-MHC-pEGFP-C1-miR-181-sponge uiten van cellen
    1. Voer een electroporation van H9c2 cellen voor de beste resultaten. Transfect rat myoblasts (H9c2) met een scramble spons (een 284-nt-long scramble-reeks die de miR-181-spons-sequence vervangt) of de α-MHC-pEGFP-miR-181-sponge constructie met een electroporator.
      1. Kort, transfect 4 x 10-5 cellen met 2 μg plasmide DNA (in 5 µL van H2O) en 100 µL van een compatibel met het apparaat electroporation oplossing. Gebruik een electroporation programma van DS-120 tot transfect van de H9c2 cellen.
      2. Incubeer de transfected cellen in de meetcel gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. 500 µL van DMEM rechtstreeks toevoegen aan de cuvette. Voorzichtig verplaats de totale cuvette-inhoud naar een putje van de plaat van een 6-well.
    2. Selecteer voor GFP positieve cellen na 48u na transfectie door FACs. Plaat alleen de cellen bevat GFP-uitgedrukt in een 6-well-plaat met een toevoeging van neomycine (G418) (400ng/mL) tot de volledige groei media.
      Opmerking: Voorafgaand aan de selectie van de G418, een curve doden moet worden vastgesteld om te bepalen van de hoeveelheid neomycine vereist voor de selectie. Voor H9c2 cellen, 400 ng/mL G418 resulteerde in een ongeveer 80% sterftecijfer van niet-plasmide H9c2 cellen transfected na 24 h en werd beschouwd als de gewenste concentratie van de werken van G418 voor deze cellen. De cellijn werd als stabiel beschouwd nadat groei bleef in G418 16 dagen.
    3. Voer de FACs sortering van de G418 stabiele cellen met behulp van de expressie van GFP als een marker voor een positieve selectie van spons. 5-10 cellen in ieder putje van een 96-wells-plaat wordt gesorteerd stroom zaad. Vouw de monoclonal cellen van de 96-wells-plaat 24-Wells-platen over verschillende passages. Gebruik diepvries voorraden van cellen uit passage 3 (P3) cellen als uitgangspunt voor verdere experimenten.
    4. Het uitvoeren van alle cel-regel gebaseerde experimenten met lage-passage cellen tussen P5 en P10.

5. synthese en zuivering van spons-nanodeeltjes (miR-181-spons nanodeeltjes)

  1. Bereid de liposomale nanodeeltjes door ontbinding van kationische Amfifiel (DOTAP) en co lipiden, cholesterol en DSPE-PEG-OMe, in een verhouding van 5:5:0.1 mM, respectievelijk, in een mengsel van chloroform en methanol in een glazen ampul.
  2. Verwijder het organische oplosmiddel bij 44-45 ° C, onder een vacuüm met behulp van een roterende verdamper, gevolgd door een zachte stroom van vochtvrije stikstof. Houd de resterende gedroogde film van lipide onder een hoog vacuüm voor 8 h.
  3. Bereid een mengsel door het toevoegen van 5% glucose aan de vacuüm gedroogd lipide-film. Laat het 's nachts zodat dit mengsel te hydrateren van de film. Vortex de flacon gedurende 2 tot 3 minuten bij kamertemperatuur om te produceren multilamellar blaasjes met een af en toe schudden in een waterbad van 45 ° C.
    1. Bewerk ultrasone trillingen ten de multilamellar vesikels ter voorbereiding van kleine unilamellar blaasjes in een ijsbad gedurende 3-4 minuten totdat duidelijkheid kan worden waargenomen, op een taakcyclus van 100% en 25 W uitgangsvermogen.
  4. Meng een scramble-reeks of een reeks van de miR-181-spons gekloond in de pEGFP(α-MHC) vectoren en liposomen op een 1:3 gratis verhouding basis te vormen van de nanovector4.
    Opmerking: Een elektrostatische complex van positief-geladen Liposomale nanodeeltjes en negatief geladen plasmide DNA staat bekend als een nanovector.

6. systemische levering voor spons-nanodeeltjes en validering van In Vivo effecten

  1. Systemische levering van spons-nanodeeltjes in ratten
    1. Gebruik Sprague-Dawley (SD) ratten. De ratten intraveneus injecteren met de miR-181-spons nanovector of scramble nanovector via de ader van de staart. Gebruik SD mannelijke ratten, die ongeveer 200 g in lichaamsgewicht.
    2. Het uitvoeren van de staart veneuze injectie met behulp van een dosis van 4 mg nanovector/kg lichaamsgewicht en herhaal dit met behulp van een regime van 6 staart ader injecties meer dan 2 weken. Naar aanleiding van de herhaalde nanovector levering, kunt u een 1-weekse periode (15-21 dagen) voor de expressie van de vector in vivo.
    3. Bevestig de optimalisatie door het GFP-signaal imaging vóór, tijdens en na de levering van de nanovector. Analyseer het GFP-signaal door tomografische imaging software, die semi-kwantitatieve gegevens genereert.
  2. Validatie van in vivo miR-181 remming door de miR-181-spons
    1. Westelijke vlek om aan te tonen van de uitdrukking van een functionele miR-181-spons in het hartweefsel uitvoeren
      Opmerking: Deze studie mt-COX1 expressie werd onderzocht.
  3. Functionele gevolgen van in vivo miR-181-spons-expressie in het hart
    1. Een twee-dimensionale, M-stand en Doppler echocardiografie tijdens en na de levering van de nanovector aan het analyseren van de hartfunctie en de morfologische veranderingen uitvoeren Voor een beter scannen capaciteit in de knaagdier harten, door een systeem van de echografie uitgerust met een 15 MHz lineaire matrix transducer te gebruiken.
    2. Anesthesie invloed kan hebben op de cardiale contractility; Daarom, de levering van de miR-181-spons nanovector of scramble nanovector aan dieren die bewust en zonder enige verdoving reagens tijdens de echocardiografie kan uitvoeren. Raadpleeg Das, et al.. 4 voor verdere verduidelijking.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De expressie voor het hele gezin van de miR-181 (miR-181 a, miR-181b, miR - 181c en miR - 181d) werd in stabiel transfected pEGFP-miR-181-spons-uiting van H9c2 cellen (uit stap 4.2), matig verlaagd ten opzichte van pEGFP-vervormd-uiting van H9c2 cellen. MiR-181-spons fungeert als een concurrerende inhibitor van het hele gezin van de miR-181, dus wij verwachten dat de expressie van de miR - 181c mitochondriale target gen, mt-COX1, zou vergroten. Westelijke vlek gegevens suggereren dat de expressie van de mt-COX1 in de pEGFP-miR-181-spons-uiting van H9c2 cellen ten opzichte van de H9c2 pEGFP-scramble-uitgedrukt cellen werd verhoogd. Bovendien werden geen expressie veranderingen voor mt-COX2 of mt-COX3 gevonden via immunoblot in de H9c2 pEGFP-miR-181-spons-uiting geven aan cellen. We gebruikten α-tubuline als het besturingselement van de normalisatie voor de immunoblotting analyse. GFP signalen werden voornamelijk waargenomen in de lever en de nier omhoog tot 2 weken na systemische levering van de miR-spons nanovector (figuur 1A). Echter, het GFP-expressie was significant hoger in het hartweefsel na 3 weken van miR-181-spons nanovector levering (figuur 1A en 1B). Van de nota, er was een GFP signaal gedetecteerd in het leverweefsel bij sommige dieren 3 weken na de systemische levering; Er waren echter geen functionele gevolgen van de miR-181-spons in de lever op dat tijdstip.

De westelijke vlek toonde een aanzienlijke stijging in de expressie van de mt-COX1 bij de miR-181-spons nanovector-geïnjecteerd in ratten vergeleken met de scramble nanovector groepen (Figuur 2). Hogere mt-COX1 blijkt er een lagere miR - 181c-expressie in het hart na 3 weken van de miR-181-spons nanovector levering, zoals mt-COX1 het directe doelwit voor miR - 181c is. We gebruikten α-tubuline als het besturingselement van de normalisatie voor de immunoblots.

Echocardiografie toonde geen verandering in de cardiale functie van de miR-181-spons nanovector-geïnjecteerd rats vóór, tijdens en aan het einde van de behandeling regime, in vergelijking met de scramble nanovector groep dieren.

Figure 1
Figuur 1. In vivo analyse van nanovector levering van de miR-181-spons. (A) dit paneel toont de geoptimaliseerde 3-weekse behandelprotocollen met 6 intraveneuze injecties via de ader van de staart. De gele kleuring in de epifluorescence afbeelding toont de expressie van het pEGFP vector. De maximale intensiteit van de gele kleuring is waargenomen bij de week 3 tijdstip. (B) de α-MHC promotor fragment in de vector pEGFP selectief geeft uiting aan de miR-181-spons of de gecodeerde reeks in het hart op dag 21. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2. Validatie van het effect van miR-181-spons nanovector op miR - 181c expressie. Dit is de westelijke vlekkenanalyse van de expressie van de mt-COX1 in het hart lysates verkregen pEGFP-scramble en pEGFP-miR-181-spons nanovector-geïnjecteerd ratten. Geheel-hart homogenates waren gesondeerd met de aangegeven antilichamen. We gebruikten α-tubuline als een besturingselement laden. De band-densitometrie wordt weergegeven in het staafdiagram hieronder. Van de student t-test is uitgevoerd, en de standaardfout was uitgezet in het staafdiagram als foutbalken. p < 0,05 vs. pEGFP-scramble groep. n = 4.

De naam van de primer Volgorde TM Notities Gebruik Doel
SAM3-1F ATGCATTAGTTATTAATGCTT
GACACACTTGACAATTTCT		 58,4 Rat MHC promotor te klonen in EGFP PCR MHC promotor
SAM3-2R GACCGGTAGCGCTAGCTG
ACTCACTGGGAGATTGCTT		 59,8 Rat MHC promotor te klonen in EGFP PCR MHC promotor
SAM3-3F CGAACGACCTACACCGAACT 64 Scherm EGFP-F PCR van de kolonie Positieve promotor klonen
SAM3-4R CGCTAGTCCTTGACCCTCTG 63,9 Scherm MHC-R PCR van de kolonie Positieve promotor klonen
SAM5-1F CCTGTCTCCAACACACAAGC 59.3 Reeks MHC promotor Sequencing MHC promotor
SAM5-2R CAGACTGCAGGGCTGGTT 60 Reeks MHC promotor Sequencing MHC promotor

Tabel 1. Primer sequenties.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In dit artikel beschreven van het ontwerp en de synthese van een miRNA-spons en aangetoond hoe de weefsel-specifieke expressie van de spons is een krachtig hulpmiddel voor de remming van weefsel-specifieke miRNA familie expressie.

We hebben aangetoond dat een familie van de miR-181 gericht op de spons in een plasmide expressie kan worden gekloond met een cardiale-specifieke promotor. Het plasmide efficiënt kan worden verpakt in een deeltje van de nanovector voor levering zowel in vitro als in vivo met electroporation of een staart veneuze injectie, respectievelijk (Figuur 1). De miR-181 spons een cardiale-specifieke uitdrukking van de miR-181-familie kan remmen en kan invloed hebben op de expressie van miR-181 doelgenen (Figuur 2). Het GFP in het plasmide is een bijkomend voordeel, dat de levering en het profiel van de expressie van de nanovector visualiseren kunt zonder in te boeten op de dieren.

Kortom, een miRNA-spons bestaat uit een reeks van miRNA antisense sequenties geplaatst na een verslaggever gen dat fungeert als een lokvogel miRNA mRNA target. Natuurlijk zijn voorkomende miRNA-sponzen gebleken als lang niet-coderende RNAs (lncRNAs)17endogeen uitgedrukt in planten en dierlijke cellen. In de huidige studie, hebben we een spons aanpak om te remmen de hele miR-181-familie in het hart gebruikt. Hoewel de aanpak van de miR-181-spons een fysiologisch relevante methode om downregulate de familie van de miR-181 in gekweekte cellen is, kan een in vivo toepassing van miR-181-sponzen schadelijk zijn. Verschillende studies hebben bijvoorbeeld aangetoond dat een beschermende rol van miR-181 a en miR-181b in verschillende cellen/weefsels typen18,19,20. De miR-181-spons expressie moet daarom specifiek op hartweefsel worden gericht.

Kleine oligonucleotides hebben aangetoond dat de miRNA functie via het gloeien aan de volwassen miRNA gids bundel blokkeren en voorkomen dat een juiste laden in het RNA-geïnduceerde silencing complex (RISC). Een probleem met deze benadering is dat oligonucleotides moeten worden geleverd in een saturating dosis voldoende cellulaire zwembaden van volwassen miRNAs blokkeren. Oligonucleotides ook last van uitdagingen met betrekking tot vervoer over de cellulaire membranen en een algemene stabiliteit van de molecule. Ingenieus, is gebleken dat een exogenously meegeleverde miRNA doelwit als een lokvogel voor haar cognaat miRNA21 fungeren kan. Op grond van meerdere bandplaatsen aangebonden samen in een pseudo 3' UTR bouwen, het doel van de lokvogel, of de miRNA-spons, vermag stabiel interactie met haar doel miRNAs en sekwestreren de miRNA in microribonucleoprotein complexen (miRNPs), dus effectief het voorkomen van de miRNA functie. De zogenaamde "miRNA-spons" is een effectieve anti-sense technologie, die kan efficiënt downregulate miRNA zowel in vitro als in vivo. Daarom kan de toepassing van een miRNA-spons worden gebruikt om te studeren van miRNA verlies-van-functie fenotypen.

De notie dat RNA-interferentie (RNAi) tot een nieuwe klasse van therapeutics leiden kan trok de aandacht van veel onderzoekers kort na zijn ontdekking. Het gebied van toegepaste RNAi therapeutics is zeer snel verhuisd van lab naar bed. Op dit moment miRNA therapeutics is een van de snel groeiende therapeutische ingrepen in de oncologie en is momenteel in fase 1 klinische proeven. Antisense oligonucleotides, of antagomirs, zijn één van de meest gebruikte miRNA remmende benaderingen. Ma et al. 22 gebruikt miR-10b antagomir, zowel in vitro als in vivo, upregulated miR-10b in een solide tumor zwijgen op te leggen.

In vivo, de efficiënte zwijgen van upregulated miRNAs vereist een chemische wijziging van de antagomirs om de bindende affiniteit, biostability en farmacokinetische eigenschappen. De duplex smelttemperatuur (Tm) verhogen en verbeteren van de nuclease weerstand van antagomirs, kunnen chemische wijzigingen worden uitgevoerd, zoals 2′-O-methyl (2′-O-Me), 2 '-O-methoxyethyl (2′-MOE) 2′-fluoro en het nucleïnezuur bicyclische-vergrendeld ( LNA)23,24,25,26,27,28,29,30,31. Voor een betere efficiëntie van de levering in vivo , kan de antagomir worden gewijzigd door de phosphorothioate (PS) verbanden, die de nuclease weerstand28hebben verhoogd. Bovendien, versterken PS ruggengraat wijzigingen ook de binding aan plasma-eiwitten verminderen de urinaire excretie. Dus, PS-gewijzigd antagomirs tonen een aanzienlijke verbetering van farmacokinetische eigenschappen, hun systemische levering32te vergemakkelijken. Het heeft ook aangetoond dat met een peptide nucleïnezuur (PNA) of morfolino oligomeren, ontworpen om te richten van een specifieke miRNA, kan worden gebruikt voor het bestuderen van miRNA verlies-van-functie fenotypen33,34,35, 36 , 37 , 38 , 39. Polylysine-geconjugeerd en nanoparticle-complexvorm PNA-antagomirs efficiënt remmen de miRNA functioneren zowel in vitro als in vivo36,37,38, 39. ondanks de recente vooruitgang, een effectieve en weefsel-specifieke uitvoering van miRNA-derivaten blijft een uitdaging. Het gaat hierbij om de potentieel voor off-target effecten, triggering aangeboren immuunresponsen en, belangrijker nog, het verkrijgen van een specifieke levering in de cellen van gerichte organen/weefsels.

Bovendien miRNA expressie niveaus sterk variëren afhankelijk van de cel en weefsel typt u40. Bovendien kan de miRNA expressie worden verhoogd of verlaagd in ziekte. Het gevolg van een veranderde miRNA expressie en het effect op cellulair en weefsels functie met spons-geremd miRNA uitdrukking moet worden gevalideerd en empirisch bepaald. Uitgebreide Preklinische studies in dierziekte modellen nodig zijn om te bepalen van het optimale niveau van de remming voor een bepaalde miRNA doel.

Interessant, vertoont miR - 181c miRNA subcellular opdeling3,4,5. Specifiek, zoals verwacht, zijn de miR-181s gecodeerd in de kern en getranscribeerd als lange-pri-miRNA afschriften die worden verwerkt in het cytoplasma van de dicing machine en opgenomen in RISC. Echter, in tegenstelling tot canonieke miRNAs die in het cytoplasma functioneren, de volwassen vorm van miR - 181c translocates in de mitochondriën en functies in de regulering van de mitochondriale-specifieke genen3. We hebben aangetoond dat de miR-181-spons de volwassen vorm van miR - 181c kunt binden in de cytoplasmatische Fractie, waardoor de translocatie voor de mitochondriën. Bijgevolg kan een opregulatie van mt-COX1 worden waargenomen in de mitochondriën onder de voorwaarden van een Downregulatie van de miR - 181c-expressie.

We hebben gemeld van de methodologie die nodig is om te ontwerpen een miRNA-spons aan het neerhalen van de uitdrukking van een miRNA en schetste een protocol voor de in vivo toepassing van de miRNA-spons. Weefsel-specifieke miRNA remming is momenteel een onderontwikkelde techniek op het gebied van miRNA. Het belang van Downregulatie of functionele remming van upregulated miRNAs in ziekten bij de mens suggereert dat het mogelijk is te benutten van miRNA biologie voor therapeutische interventie.

Deze studie belicht een strategie voor het verlagen van een miRNA, die met succes kan worden ingezet in een weefsel-specifieke wijze in vivo. De miRNA-sponzen gebruiken de antisense opeenvolging van de opeenvolging van miRNA "zaad". Daarom miRNA-sponzen downregulate kunnen alle van de miRNAs die dezelfde "zaad" volgorde, namelijk, de gehele miRNA familie. In deze studie, die we hebben gezien een significante Downregulatie van het hele gezin van de miR-181 (miR-181 a, miR-181b, miR - 181c en miR - 181d) met de expressie van de miR-181-spons, zowel in vitro als in vivo. Als een familielid bescherming, verleent terwijl een ander familielid nadelige gevolgen binnen de dezelfde orgel heeft, zou met behulp van de technologie van de miRNA-spons niet de ideale aanpak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

We bedanken Anthony K. L. Leung van het departement van biochemie en moleculaire biologie, Bloomberg School of Public Health, Johns Hopkins University voor zijn technisch helpen met het ontwerpen van de miR-181-spons-constructie. Wij danken ook Polina Sysa-Shah en Kathleen Gabrielson van de afdeling van moleculaire en vergelijkende Pathobiology, Johns Hopkins Medical instellingen voor hun technische bijstand door de in vivo imaging van de miRNA-spons levering.

Dit werk werd gesteund door subsidies van de NIH, HL39752 (naar Charles Steenbergen) en door een subsidie van de wetenschapper-ontwikkeling van de American Heart Association 14SDG18890049 (aan de Samarjit Das). De rat cardio-specifieke promotor was gulle wijze aangeboden door Jeffery D. Molkentin in het kinderziekenhuis van Cincinnati.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pEGFP-C1 vector Addgene 6084-1
In-fusion Clontech 121416
QIAprep Miniprep Qiagen 27104
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704
miR-181-sponge synthesis Introgen GeneArt custome made
PCR primers Integrated DNA Technologies custome
EcoRI enzymes New Endland Biolabs R0101S
KpnI enzymes New Endland Biolabs R0142S
Rapid DNA Ligation Kit Sigma-Aldrich 11635379001
H9c2 cells ATCC CRL-1446
DMEM Media Thermo Fisher Scientific 11965092
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 10082139
Nucleofector 2b Device Lonza AAB-1001
Nucleofector Kits for H9c2 (2-1) Lonza VCA-1005
G418, Geneticin Thermo Fisher Scientific 11811023
FACSAria II Flow cytometer BD Bioscience 644832
Branson 450 sonifier Marshall Scientific EDP 100-214-239
The Xenogen IVIS Spectrum optical imaging device Caliper Life Sciences
Anti-MTCO1 antibody Abcam ab14705
α-tubulin antibody Abcam ab7291
Sequoia C256 ultrasound system Siemens

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hammond, S. M. microRNA detection comes of age. Nat Methods. 3 (1), 12-13 (2006).
  2. van Rooij, E., Olson, E. N. MicroRNAs: powerful new regulators of heart disease and provocative therapeutic targets. The Journal of Clinical Investigation. 117 (9), 2369-2376 (2007).
  3. Das, S., et al. Nuclear miRNA regulates the mitochondrial genome in the heart. Circulation Research. 110 (12), 1596-1603 (2012).
  4. Das, S., et al. miR-181c regulates the mitochondrial genome, bioenergetics, and propensity for heart failure in vivo. PLoS One. 9 (5), e96820 (2014).
  5. Das, S., et al. Divergent effects of miR-181 family members on myocardial function through protective cytosolic and detrimental mitochondrial microRNA targets. Journal of the American Heart Association. 6 (3), e004694 (2017).
  6. Sicard, F., Gayral, M., Lulka, H., Buscail, L., Cordelier, P. Targeting miR-21 for the therapy of pancreatic cancer. Molecular Therapy. 21 (5), 986-994 (2013).
  7. Jopling, C. L., Yi, M., Lancaster, A. M., Lemon, S. M., Sarnow, P. Modulation of hepatitis C virus RNA abundance by a liver-specific microRNA. Science. 309 (5740), 1577-1581 (2005).
  8. Lanford, R. E., et al. Therapeutic silencing of microRNA-122 in primates with chronic hepatitis C virus infection. Science. 327 (5962), 198-201 (2010).
  9. Ucar, A., et al. The miRNA-212/132 family regulates both cardiac hypertrophy and cardiomyocyte autophagy. Nature Communications. 3, 1078 (2012).
  10. Zhu, X., et al. Identification of micro-RNA networks in end-stage heart failure because of dilated cardiomyopathy. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (9), 1173-1187 (2013).
  11. Bandiera, S., et al. Nuclear outsourcing of RNA interference components to human mitochondria. PLoS One. 6 (6), e20746 (2011).
  12. Barrey, E., et al. Pre-microRNA and mature microRNA in human mitochondria. PLoS One. 6 (5), e20220 (2011).
  13. Bian, Z., et al. Identification of mouse liver mitochondria-associated miRNAs and their potential biological functions. Cell Research. 20 (9), 1076-1078 (2010).
  14. Kren, B. T., et al. MicroRNAs identified in highly purified liver-derived mitochondria may play a role in apoptosis. RNA Biology. 6 (1), 65-72 (2009).
  15. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
  16. Molkentin, J. D., Jobe, S. M., Markham, B. E. Alpha-myosin heavy chain gene regulation: delineation and characterization of the cardiac muscle-specific enhancer and muscle-specific promoter. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 28 (6), 1211-1225 (1996).
  17. Poliseno, L., et al. A coding-independent function of gene and pseudogene mRNAs regulates tumour biology. Nature. 465 (7301), 1033-1038 (2010).
  18. Henao-Mejia, J., et al. The microRNA miR-181 is a critical cellular metabolic rheostat essential for NKT cell ontogenesis and lymphocyte development and homeostasis. Immunity. 38 (5), 984-997 (2013).
  19. Williams, A., Henao-Mejia, J., Harman, C. C., Flavell, R. A. miR-181 and metabolic regulation in the immune system. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 78, 223-230 (2013).
  20. Hori, D., et al. miR-181b regulates vascular stiffness age dependently in part by regulating TGF-beta signaling. PLoS One. 12 (3), e0174108 (2017).
  21. Ebert, M. S., Sharp, P. A. MicroRNA sponges: progress and possibilities. RNA. 16 (11), 2043-2050 (2010).
  22. Ma, L., et al. Therapeutic silencing of miR-10b inhibits metastasis in a mouse mammary tumor model. Nature Biotechnology. 28 (4), 341-347 (2010).
  23. Davis, S., Lollo, B., Freier, S., Esau, C. Improved targeting of miRNA with antisense oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 34 (8), 2294-2304 (2006).
  24. Davis, S., et al. Potent inhibition of microRNA in vivo without degradation. Nucleic Acids Research. 37 (1), 70-77 (2009).
  25. Elmen, J., et al. LNA-mediated microRNA silencing in non-human primates. Nature. 452 (7189), 896-899 (2008).
  26. Esau, C. C. Inhibition of microRNA with antisense oligonucleotides. Methods. 44 (1), 55-60 (2008).
  27. Stenvang, J., Kauppinen, S. MicroRNAs as targets for antisense-based therapeutics. Expert Opinion on Biological Therapy. 8 (1), 59-81 (2008).
  28. Lennox, K. A., Behlke, M. A. A direct comparison of anti-microRNA oligonucleotide potency. Pharmaceutical Research. 27 (9), 1788-1799 (2010).
  29. Lennox, K. A., Behlke, M. A. Chemical modification and design of anti-miRNA oligonucleotides. Gene Therapy. 18 (12), 1111-1120 (2011).
  30. van Rooij, E., Olson, E. N. MicroRNA therapeutics for cardiovascular disease: opportunities and obstacles. Nature Reviews. Drug Discovery. 11 (11), 860-872 (2012).
  31. Stenvang, J., Petri, A., Lindow, M., Obad, S., Kauppinen, S. Inhibition of microRNA function by antimiR oligonucleotides. Silence. 3 (1), 1 (2012).
  32. Levin, A. A. A review of the issues in the pharmacokinetics and toxicology of phosphorothioate antisense oligonucleotides. Biochimica et Biophysica Acta. 1489 (1), 69-84 (1999).
  33. Flynt, A. S., Li, N., Thatcher, E. J., Solnica-Krezel, L., Patton, J. G. Zebrafish miR-214 modulates Hedgehog signaling to specify muscle cell fate. Nature Genetics. 39 (2), 259-263 (2007).
  34. Kloosterman, W. P., Lagendijk, A. K., Ketting, R. F., Moulton, J. D., Plasterk, R. H. Targeted inhibition of miRNA maturation with morpholinos reveals a role for miR-375 in pancreatic islet development. PLoS Biology. 5 (8), e203 (2007).
  35. Martello, G., et al. MicroRNA control of Nodal signalling. Nature. 449 (7159), 183-188 (2007).
  36. Fabani, M. M., Gait, M. J. miR-122 targeting with LNA/2'-O-methyl oligonucleotide mixmers, peptide nucleic acids (PNA), and PNA-peptide conjugates. RNA. 14 (2), 336-346 (2008).
  37. Fabani, M. M., et al. Efficient inhibition of miR-155 function in vivo by peptide nucleic acids. Nucleic Acids Research. 38 (13), 4466-4475 (2010).
  38. Babar, I. A., et al. Nanoparticle-based therapy in an in vivo microRNA-155 (miR-155)-dependent mouse model of lymphoma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), E1695-E1704 (2012).
  39. Torres, A. G., et al. Chemical structure requirements and cellular targeting of microRNA-122 by peptide nucleic acids anti-miRs. Nucleic Acids Research. 40 (5), 2152-2167 (2012).
  40. Kent, O. A., McCall, M. N., Cornish, T. C., Halushka, M. K. Lessons from miR-143/145: the importance of cell-type localization of miRNAs. Nucleic Acids Research. 42 (12), 7528-7538 (2014).

Tags

Biologie kwestie 136 MicroRNA miRNA miRNA-spons miRNA inhibitie nanoparticle nanovector miR-181 hart mitochondriale miRNA
<em>In Vivo</em> Nanovector levering van een hart-specifieke MicroRNA-spons
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kent, O. A., Steenbergen, C., Das,… More

Kent, O. A., Steenbergen, C., Das, S. In Vivo Nanovector Delivery of a Heart-specific MicroRNA-sponge. J. Vis. Exp. (136), e57845, doi:10.3791/57845 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter