Summary
발광 박테리아 메커니즘, 쿼럼 센 싱 등의 다양 한 통해 빛 생산을 통제 한다. 이 새로운 메서드는 생물 발광의 현장에서 조사와 발광 셀 밀도 상관 관계를 수 있습니다. 인공 발광 대장균 시스템 럭 스 operons, 럭 스 단백질, 그리고 그들의 상호 작용의 특성을 수 있습니다.
Abstract
세균성 종의 상당수는 빛을 방출 수 있습니다. 그들의 모든 공유 같은 유전자 클러스터, 즉 럭 스 오 페론. 이 유사성에도 불구 하 고 이러한 박테리아 성장 동작, 빛 방출의 강도 또는 생물 발광의 규정 특성에 극단적인 변화를 보여줍니다. 여기에 제시 된 방법은 플레이트 리더를 활용 하 여 시간이 지남에 따라 녹음의 세포 성장 및 발광의 발광 강도 결합 하 여 새로 개발된 된 분석 결과입니다. 결과 성장 및 발광 특성 쿼럼 감지 규칙 등 각 세균성 긴장의 중요 한 기능에 연결할 수 있습니다. 다양 한 발광 박테리아의 특정 매체 (예: 인공 바다 물 매체)를 요구 하 고 온도 정의. 쉽게 처리, 비 발광 표준 연구 박테리아 대장균 (대장균), 다른 한편으로, 수 수 재배 저렴 하 게 실험실 규모에서 높은 수량. 럭 스 전체 포함 하는 플라스 미드를 도입 하 여 대장균 을 이용 오 페론 실험 조건 단순화할 수 하 고 또한 미래의 응용 프로그램에 대 한 많은 가능성을 엽니다. 모든 럭 스 유전자는 대장균 식 스트레인을 활용 하 여 표현의 깁슨 복제를 통해 한 식 플라스 미드의 건설과 7 럭 스 유전자와의 3 개의 갈비뼈 유전자를 포함 하는 4 개의 파편의 삽입에 의해 달성 되었다 pET28a 벡터에 럭 스 리브 오 페론. 대장균 기반 럭 스 유전자 발현을 유도 하 고 발광 대장균 인 이소프로필-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) 추가 통해 제어 수 셀. 이 시스템의 장점은 쿼럼 규제 제한 및 비표준 성장 조건에 따라 복잡 한 중간 작곡과 같은 감지를 피하기 위해 온도 정의 합니다. 이 시스템은 럭 스 오 페론에서 각 유전자의 새로운 유전자, 다른 한 세균성 긴장에서 luxAB 유전자 교환도 추가 또는 여 럭 스 유전자와 그들의 상호 작용의 분석을 수 있습니다 또는 단백질 복합물, luxCDE등을 분석.
Introduction
살아있는 유기 체 (생물 발광)에 의해 빛의 방출은 박테리아, 곰 팡이, 곤충, 선 충, 생선, 그리고 오징어1에 매혹적인 과정입니다. 발광 빛 방출 chemiluminescent 반응 있는 화학 에너지는 (부분적으로) 변모 빛 에너지 ("차가운 빛")에서 나온다. 발광 박테리아 heterodimeric 효소 luciferase catalyzes 긴 사슬의 지방 족 알데하이드, 490 nm2, 에서 최대 발광 함께 해당 산 tetradecanal 등 monooxygenation 3.
그림 1 : 세균 luciferase의 일반적인 반응 계획. (LuxAB) 세균성 luciferase catalyzes 긴 체인의 monooxygenation 알데하이드 (채널3(채널2)n조) 이용 하 여 플 라빈 mononucleotide (FMNH2)과 분자 산소 (O2), 저조한 제품 감소 오래 산 (채널3(채널2)nCOOH), 플 라빈 mononucleotide (FMN), 물 (H2O), 그리고 가운데 490에 빛의 방출 체인 nm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
이 산화 동안 풀어 놓인 에너지는 상태 발광 소4역할 FMN-4a-수산화 발생 합니다. 세균 생물 발광, 즉 LuxCDABEG, 에 관련 된 단백질은 럭 스 오 페론에 의해 인코딩되고 매우 다양 한 세균성 긴장2,5이상의 보존. 유전자 거 와 luxB 는 heterodimeric luciferase;에 대 한 인코딩 luxC의 luxD의및 luxE의 유전자 제품은 복잡 한; 지방산 reductase의 구성 요소 그리고 luxG 플 라빈 reductase6인코딩합니다. 다양 한 발광 Photobacteria (e.g.,Photobacterium mandapamensis 27561) 추가 luxF 유전자를가지고. LuxF는 특이 한 플 라빈 파생 6-(3'-(R)-myristyl homodimeric 단백질은 보고 되었다)-FMN (myrFMN)7,,89,10,11 ,12. 추가적인 유전자 확인 된 리 보 플 라빈 합성 (예: ribEBH)에 대 한 책임은 또한 규제 유전자 보고 되었습니다, 그 생물 발광, 특히 비 브리 오에 대 한 쿼럼 감지 규칙에 있는 역 fischeri 브리 harveyi6,13. 높은 보존된 유전자 순서에도 불구 하 고 발광 박테리아 성장 동작, 빛 방출의 강도 또는 생물 발광2,5,14의 규정 특성에 높은 변화를 표시 .
몇 가지 수정 긴장 또는 부분을 포함 하는 플라스 미드 또는 전체 럭 스 operons 알려져 있습니다 기자 시스템 생물 발광을 이용. 발기인 활동을 결정 하는 등 다양 한 응용 프로그램 환경 또는 식품 샘플, 생물 발광 공명 에너지 전송 (브 레트), 세균 오염 모니터링 vivo에서 화상 진 찰 진 핵 유기 체에서 감염의 pyrosequencing, 고 등 설립된15,,1617를 했다. 흥미롭게도, 3 가장 자주 사용 되는 시스템은 북미 반딧불 (Photinus pyralis), 선 충 (Photorhabdus luminescens)의 장 병원 체 그리고 바다 팬 지 (Renilla에서 파생 된 발광 기자 reniformis). 그 시스템의 세균성 근원 하지만 럭 스 유전자와 operons 세균성 근원에서를 사용 하 여 응용된 연구16에 대 한 더 많은 관심을 얻고 있다. 세균성 근원에서 생물 발광 단백질의 덜 풍부한 응용 프로그램은 주로 낮은 안정성 그리고 박테리아의 발광 단백질 그들의 해양 서식 지에 관련이 있을 수 있습니다 파생 된. 해양 서식 지의 발광 박테리아는 표준 실험실 조건 하에서 cultivable있지 않습니다. 이 박테리아는 특정 성장 매체와 같은 인공 바다 물 중간 및 낮은 성장/부 화 온도 (예를 들어, 28 ° C) 조건 필요합니다.
럭 스 오 페론 특성 또는 단일 럭 스 의 비교를 단순화 하기 위해 유전자의 다른 발광 세균성 긴장, 럭 스 오 페론 식 및 분석 표준화 하는 방법의 범위는 필수입니다. 따라서, 표준 연구 박테리아 대장균 (대장균)으로 전체 럭 스 리브 오 페론을 통합의 아이디어는 나왔다. 이 위해 깁슨 어셈블리 특정 제한 사이트에 대 한 필요 없이 하나의 벡터에 다중 선형, 겹치는 파편을 통합 하는 유용한 도구가 될 입증. 이 방법은 또한 적당 한 DNA 삽입은 너무 큰 때 ( luxCDABFEG-ribEBHe.g.,P mandapamensis 27561; ~ 9 kb 오 페론 크기) PCR을 통해 증폭 될. 럭 스 오 페론 여러 겹치는 조각으로 분리 될 수 있습니다 한 식 플라스 미드로 조립 그리고 마지막으로 시퀀스 확인 어셈블리 제품 직접 적절 한 대장균 으로 변형 될 수 있다 높은 수율에 대 한 시스템 단백질 식18,,1920. 뿐만 아니라 대장균 기반 럭 스 유전자 발현을 취급 하 게 쉬운, 세포 성장 및 발광 빛 방출의 녹음을 결합 하는 간단한 방법을 설립 남아 있었다. 여기 설명 하는 방법을 현장에서 측정 및 셀 밀도의 상관 관계 및 발광 박테리아의 빛 방출 수 있습니다.
럭 스 유전자와 럭 스 오 페론 순서와 한편으로, 인공 발광 대장균 , 다양 한 발광 박테리아의 규정의 분석 시스템 P.의 전체 럭 스 리브 오 페론을 포함 하 mandapamensis 27561 고 다른 손, 결합 세포 밀도와 발광, 녹음 현장에서 새로 개발된 된 플레이트 리더 분석 결과 다양 한 세균성 럭 스 시스템에 대 한 더 많은 정보를 얻을 수 있도록 도와줍니다. 이 기본적인 특성 및 luciferases 및 관련된 효소의 비교 향상 된 안정성 및 활동 대안 이미 설립된 기자 시스템을 발생할 수 있습니다.
Protocol
1. 디자인, 준비 및 럭 스 오 페론 대장균 에서 표현
주:이 섹션에서 사용 되는 상용 키트에 대 한 내용은 테이블의 자료 를 참조 하십시오.
- 대장균 에 럭 스 오 페론을 전송에 대 한 적절 한 제한 사이트와 항생제 저항 유전자의 관심 (예: pET28a; 표준 애완 동물 벡터 선택 NcoI, XhoI, 대)입니다.
- 조각을 디자인 하 고 뇌관 깁슨 어셈블리 Photobacterium mandapamensis 27561의 DNA 순서에 따라 중복 (은행: DQ988878.2).
- 서식 파일로 설계 된 프라이 머와 Photobacterium mandapamensis 27561의 고립 된 게놈 DNA 표준 PCR 반응 설정 (뇌관 및 조건에 대 한 보충 자료 를 참조).
참고: 격리 각각 세균성 긴장의 genomic DNA의 PCR 효능을 향상 시킵니다. - 스핀-열 정화를 통해 PCR 제품을 정화.
- 45 분 동안 37 ° C에서 NcoI 및 XhoI 격리 된 pET28a 벡터의 제한 소화를 수행 합니다.
- 선형화 벡터를 정화 하 고 PCR 파편 통해 agarose 젤 전기 및 후속 스핀-열 정화.
- 각 조각 및 선형화 벡터 DNA 농도 확인 하 고 프로토콜20,21에 따라 어셈블리에 대 한 최적의 수량을 계산.
참고: 어셈블리의 효능 그리고 조각 크기와 수에 따라 제조 업체의 프로토콜20,21에 따라 조정 될 수 있다. - 모든 조각을 PCR 튜브에 버퍼를 결합 후 어셈블리 혼합물이 1 시간에 50 ° C에서 PCR 기계에 품 어.
- 적절 한 대장균 으로 대장균 세균성 플라스 미드 전이 대 한 표준 변환 프로토콜에 따라 조립된 벡터 제품 변환 시스템 고수익 플라스 미드 복제 (예를 들면, 대장균 TOP10 또는 XL-1).
- 변형 판과 DNA 격리에 대 한 새로운 접시에 행진에서 식민지를 선택 하십시오.
- 표준 프로토콜에 따라 플라스 미드 DNA를 분리.
- 모든 조각을 포함 하는 플라스 미드의 정확한 어셈블리를 확인 하려면 먼저 모든 조립된 조각에 대 한 뇌관 특정 사용 하 여 표준 프로토콜에 따라 식민지 PCR를 수행 합니다.
- 또한 식민지 PCR 및 후속 agarose 젤 전기 이동 법, 올바른 어셈블리와 올바른 DNA 시퀀스를 확인 하려면 DNA 시퀀싱에 대 한 모든 격리 된 어셈블리 벡터를 준비 합니다.
- 적절 한 대장균 으로 대장균 세균성 플라스 미드 전이 대 한 표준 변환 프로토콜에 따라 확인 된 플라스 미드를 변환 고수익 단백질 생산 (e.g.,E 대장균 BL21) 시스템.
참고: 직접 식 프로토콜 아래 계속. 더 이상 스토리지, 글리세롤 재고 준비 것이 좋습니다.
2. 수정 된 E. 콜라이 긴장의 표현
- LB 매체의 적절 한 볼륨의 접종에 의해 하룻밤 문화 (ONC) 식에 대 한 준비 (예를 들어, 100 mL) 조립된 플라스 미드 또는에서 직접 변형 대장균 BL21 셀의 이전 준비 글리세롤 재고는 변환 플레이트입니다. 대 (50 mg/mL, pET28a의 항생제 저항 유전자)의 100 µ L을 추가 하 고 37 ° C와 인큐베이터 셰이 커에 120 rpm에서 ONC 밤새 품 어.
- 주요 식 문화는 ONC의 8 mL를 (예를 들어, 파운드 매체의 800 mL) inoculate 고 대 (50 mg/mL)의 800 µ L를 추가 합니다.
- 셀 밀도의 0.6-600 세 도달할 때까지 37 ° C와 인큐베이터 셰이 커에 120 rpm에서 주요 문화를 품 어 0.8 (약 2.5 h).
- 부 화 온도를 28 ° c.를 감소 시키십시오
- 0.1 m m의 최종 농도에 IPTG을 추가 하 여 단백질 발현을 유도.
참고: 경험적 테스트 28 ° C를 온도 감소 높은 가벼운 강렬 했다 보였다. - 그들은 (약 1 시간)을 빛나는 시작 될 때까지 세포를 관찰 합니다.
참고: 식의 목적에 따라 셀 다음 날까지 재배 되 고 수확 후 또는 셀 수 있습니다 그들은 (최대 48 h) 빛나는으로 흔들어 보관. 세포와 어떤 단백질의 정화를 수확 하는 것은 표준 절차에 따라 할 수 있습니다.
3입니다. 발광 세균 긴장의 표현
참고: 세균성 발광 긴장 성장과 빛 생산에 대 한 특정 성장 매체/인공 바다 물 매체를 필요합니다.
- 인공 바다 물 매체, 구성된 두 별도로 준비 중간 구성 요소를 준비 합니다.
참고: 인공 바다 물 매체의 준비는 원래 프로토콜22에서 적응 시켰다. 다음 금액은 1 L 액체 매체 또는 1 L 한 천 매체.- 인공 바다 물 매체에 대 한 다음 소금에 무게: 28.13 g NaCl, 0.77 g KCl, 1.60 g CaCl2 · 2 H2O, 4.80 g MgCl2 · 6 H2O, 0.11 g NaHCO3및 3.50 g MgSO4 · 7 H2o.
- 증류수 1 L을 추가 하 고 모든 구성 요소를 분해.
- 다음과 같은 재료에 무게 파운드 매체에 대 한: 10 g 효 모 추출 물, 10 g 펩, 그리고 한 천 배지, 추가 20 g 한 천.
- 수돗물의 250 mL을 추가 하 고 구성 요소를 분해 합니다.
- 두 압력솥 20 분 동안 121 ° C에서 별도로 미디어를 준비.
- 한 천 배지, 압력가 마로 소독 후 직접 인공 바다 물 매체의 750 mL 250 mL 파운드 매체의 결합 및 접시를 준비.
- 압력가 마로 소독 후 직접 또는 냉각 하는 때 액체 매체에 대 한 인공 바다 물 매체의 750 mL와 파운드 매체의 250 mL를 결합 합니다.
참고: 인공 바다 물 매체 혼 탁 한 소금 강 수를 통해 얻을 수 있습니다.
- 인공 바다 물 매체 한 천 배지에서 세균성 발광 긴장을 행진 하 고 24-30 ° c.에서 밤새 품 어
참고: 오랜 시간 저장 세균성 긴장의 세균성 문화의 글리세롤 주식 동결을 통해 정상적으로 이루어집니다. 긴장 한 천 배지 녹고 후 성장에서 지연 위상으로 인해 액체 문화에 대 한 사용 하기 전에 모든 변종에 대 한 균일 한 시작 조건을 보장 하기 위해서 처음에 줄무늬 항상 한다. - 접시에서 단일 식민지와 인공 바다 물 매체를 100 mL를 접종 하 여는 ONC를 준비 합니다. 24-30 ° C와 인큐베이터 셰이 커에 120 rpm에서 ONC 밤새 품 어.
- ONC의 8 mL와 인공 바다 물 매체의 800 mL 접종
- 24-30 ° C와 인큐베이터 셰이 커에 120 rpm에서 세균성 세포를 품 어.
참고: 발광 박테리아의 빛의 강도 프로필 온도와 강하게 변화 한다. 각 세균성 긴장의 빛 생산의 규제 메커니즘에 따라 발광 후 약 1-6 h 시작할 수 있습니다. - 그들은 (대략 1-6 h) 빛나는 시작 때까지 세균 세포 배양을 관찰 합니다.
참고: 식의 목적에 따라 셀 다음 날까지 재배 되 고 수확 후 또는 셀 수 있습니다 그들은 빛나는으로 흔들어 보관. 세포와 어떤 단백질의 정화를 수확 하는 것은 표준 절차에 따라 할 수 있습니다.
4. Vivo에서 활동 분석 결과 세균 발광 긴장 및 변형된 대장균 변종에 대 한
참고: 긴장의 장시간 저장은 일반적으로 글리세롤 주식 세균성 문화의 동결을 통해 acieved. 긴장 한 천 배지 녹고 후 성장에서 지연 위상으로 인해 액체 문화에 대 한 사용 하기 전에 모든 변종에 대 한 균일 한 시작 조건을 보장 하기 위해서 처음에 줄무늬 항상 한다.
- 행진 원하는 발광 박테리아 스트레인 또는 수정 된 대장균 한 천 배지에서 변형 및 28 ° C에서 밤새 품 어.
참고: 외피 온도 스트레인 스트레인에서 변화할 수 있다 고 경험적으로 평가 될 수 있다. 발광 박테리아 긴장을 비교할 수 있게 되며 수정 된 대장균 변종, 성장 조건 동일 해야 합니다. - 한 천 배지에서 단일 식민지로 각각 스트레인와 매체의 3 mL를 접종 하 고 28 ° C에서 약 1-2 h의 인큐베이터 흔드는 180 rpm에서 세포를 품 어.
- 1시 10분의 셀 밀도 측정 650에서 액체 문화 희석 nm. 비율과 0.05의 OD650 1 mL 문화에 대 한 볼륨을 계산 합니다.
참고: 이후 플레이트 리더 분석 결과 650에서 셀 밀도 결정할 것입니다 긴장의 빛 방출에 의해 간섭을 유발 하지 않도록 nm. - 문화와 매체의 계산된 볼륨 24 잘 블랙 벽 접시 유리 바닥에 플라스틱. 수정 된 대장균 에 대 한 변형, 대 (pET28a 벡터의 항생제 저항)의 1 µ L와 IPTG (유전자 발현의 유도)의 1 µ L 샘플을 추가. 뚜껑을 측정 하는 동안 증발을 피하기 위해 접시에 놓습니다.
참고: 전체 럭 스 오 페론을 포함 하는 pET28a 벡터 대장균 문화에 의해 손실 얻이 되지 않습니다 보장, 대에 추가 되어야 합니다 각 대장균 샘플 격판덮개 우물에 대장균 의 빛 생산을 보장 하기 셀 측정 될 수 있다, IPTG에 의해 유전자 발현을 유도 해야 합니다. 누화 및 측정 간섭을 피하기 위해, 유리 아래쪽와 투명 한 뚜껑 잘 플레이트 블랙 벽으로 최상의 결과 보였다. 그럼에도 불구 하 고, 크로스 토크는 관찰 될 수 있다 하 고 잘 위치를 신중 하 게 선택 해야. - 플레이트 리더에 측정을 시작 합니다.
참고: 플레이트 리더 프로토콜은 특별히 개발 된 스크립트 기반으로이 분석 결과 대 한 ( 보충 자료참조)을 결합 하 여 두 측정, 흡 광도, 생물 발광. 데이터 포인트는 측정와 28 ° c.의 일정 한 온도 사이 영구 떨고와 매일 10 분 수집
Representative Results
럭 스 오 페론- luxCDABFEG -유전자 순서는 매우 다양 한 변종2,,514이상 보존 됩니다. 플라스 미드의 디자인에 대 한 시퀀스 정보 Photobacterium mandapamensis 27561 발광 박테리아 스트레인에서 찍은 및 유전자 순서는 동일을 유지 했다 고, 또한, 단일 유전자 사이 noncoding 시퀀스 고려 되었다. 적용 된 깁슨 복제 전략에 대 한 도식 개요는 그림 2에 묘사 된다. 20-40 자료 쌍 시퀀스를 중첩 총, luxCDAB, luxF, luxEG, 및 ribEBH, 4 개의 조각은 생성 했다. 깁슨 어셈블리20의 모든 단계를 수행한 후 DNA 시퀀싱 모든 조각을 포함 하는 플라스 미드의 정확한 어셈블리를 확인 했다. 최종 조립 제품 pET28a의 럭 스 리브 오 페론을 포함 하는 벡터 지도 그림 3에서 묘사 된다. 이 수정된 pET28a 벡터의 중요 한 장점의 활용은 대장균 성장 조건 표준화와 IPTG로 유도 제어.
발광 박테리아와 해당 셀 밀도의 발광 측정, 플레이트 리더 기반 방법 개발 되었다. 플레이트 리더에 대 한 방법 빛 강도와 세포 밀도 대 한 단일 측정 스크립트를 결합 하 여 생성 되었습니다. 이 새로운 스크립트 사용 세650 의 측정 및 빛의 강도 사용자에 대 일 분 마다 정의 (예를 들어, 10 h) 각각 분석에 사용 되는 박테리아의 생성 시간을 조정 해야 하는 기간. 광학 밀도의 측정 650에서 수행한 nm 빛 방출 간섭을 유발 하지 않도록. 증거로 서의 개념 및 건강 대장균 세포의 올바른 성장 동작을, 참조 측정 수행 했다. 그림 4 대장균 BL21 셀, 대장균 BL21 셀 포함 하는 빈 pET28a 벡터 및 대장균 BL21 셀 럭 스 리브 오 페론 pET28a 벡터를 포함 하의 비교에에서 삽입 되 게 됩니다. 후자의 스트레인에 대 한 아무 IPTG는 빛 내 쏘 기 때문에 시키는 T7 발기인의 분석에 추가 되었습니다. 모든 3 개의 기준 측정 3 개의 성장 단계 (지연, 지 수, 및 고정 단계)와 자형 성장 곡선을 표시합니다. 발광, 럭 스 리브 오 페론 삽입 시작 하지만 측정 달리 pET28a 벡터에 포함 된 대장균 BL21 셀만 30 분, 비 유발 셀 후 방출은 식 IPTG과 빛의 추가 의해 유도 된다 만 약 5 h 후 광택을 훨씬 낮은 발광 표시 시작 (ca. 4-fold) 유도 시스템에 비해.
그림 5 이 대장균 에 발광 박테리아 스트레인 P. mandapamensis 27561, 파운드 매체 또는 인공 바다 물 매체 표현 럭 스 오 페론의 빛 강도 제공 하는 성장 곡선의 비교 소설을 사용 하 여 제자리에 방법 설립. 이러한 박테리아, 비교 측정 외피 온도 28 ° c.의 수행 했다 이 온도 감소 파운드 매체 인공 바다 물 매체 뿐만 아니라 발광 세균 변종 낮은 온도 대 한 변형 수정된 대장균 의 성장 속도 중요 한. P. mandapamensis 27561 보여줍니다 대장균보다는 훨씬 더 높은 세포 조밀도이 온도 의존성 그림 5A에 표시 됩니다. 또한, 대장균 변종에 파운드 매체 세대 수 자연 발광 박테리아 변종에 대 한 더 높은 세포 밀도의 인공 바다 물 매체는 선호 하 고 생물 발광에 대 한 필수. 그림 5B와 같이 기록 된 셀 밀도 각각 빛 농도와 연관. 주목할 만한, 발광 대장균 세포 도달 비슷한 비록 높은 농도 다른 시간 지점에서 기록 된 두 파운드 매체 뿐만 아니라 인공 바다 물 매체에서 방출 맥시 마를 빛. 이 관찰, 달리 P. mandapamensis 27561 파운드 매체에서 매우 감소 된 성장 속도 함께 가능한 하지만 세균성 세포 모두 (그림 5B)에서 빛을 방출 하지 않았다. 인공 바다 물 매체, P. mandapamensis 27561 대장균보다 낮은 200의 거의 요인은 초당 약 1 × 104 카운트에서 발광의 최대를 표시 됩니다. 그림 5 C 상대 빛 단위를 생물 발광 마약에 의해 정규화 됩니다 나타냅니다. 이 결과 확인 했다는 플라스 미드의 삽입 포함 된 럭 스 오 페론 E. 콜라이 성공 하 고 기능에 뿐만 아니라 또한이 대장균 수정 긴장은 더 높은 발광으로 유효한 대안 수익률 및 마리나 박테리아, 복잡 한 해 수 등의 세균성 생물 발광의 제한 없이 중간 및 낮은 온도.
또한, 대장균 기반 럭 스 리브 유전자 발현 이상 24 h의 장기 측정 발광 (그림 6)의 장 수를 분석을 수행 되었다. 발광 19.5 h에 대 한 지속, 점진적으로 감소 어디 세균성 긴장 (예를 들어, P. mandapamensis 27561) 보다 훨씬 더 오래 10 h 후 매우 낮은 빛 방출의 결과로 관찰 되었다.
개발된 분석 결과의 한계를 설명 하기 위해 그림 7 3 발광 세균성 긴장, 즉 s 1 Photobacterium mandapamensis Photobacterium mandapamensis TH1, 비 브리 오의 측정 결과 보여 줍니다. harveyi 14126. 첫 번째 변형 (S1)에 대 한 메서드는 아주 잘 작동 하 고 거의 2 x 106의 최대한 생물 발광 강도 보여줍니다. 다른 두 변종 (TH1 및 14126), 둘 다에 의해 생성 된 빛의 강도 사용된 악기 설정의 검출 한계를 초과 했기 때문에 최대한 빛의 강도 확인할 수 없습니다. 이 두 종자의 개발된 방법 (스크립트)에 대해 정의 된 이득 값은 너무 높게 설정 되었습니다. 그럼에도 불구 하 고, 생물 발광 활동의 개시는 서로 비교할 수 있습니다. P. mandapamensis TH1 P. mandapamensis S1 시작 빛나는 약 1 시간 후에 OD650 값 0.1-0.2, 각각. 반면, harveyi 대 14126 후 약 5.5 h 1.0의 OD650 값에 빛을 방출 하기 시작 합니다. 발광의 관찰된 발병 OD 생물 발광에 있는 지 수 증가 동반 된다. V. harveyi 14126의 생물 발광 기초가 쿼럼 규제를 감지 하 고 따라서 특정 세포 밀도 그림 713에 명확 하 게 관찰 될 수 있는 럭 스 오 페론의 정품 인증을 허용 알려져 있다. 이 결과이 소설 현장에서 플레이트 리더 분석 결과 발광 박테리아를 쉽게 비교 하 고 또한 대략 쿼럼 규제를 감지 하는지 여부를 확인 하 여 이러한 긴장의 규제 메커니즘을 정의할 수는 될 수 하는 것을 보여 줍니다. 여부를 관찰 했다.
그림 8 의 대장균 BL21 세포 은닉 IPTG와 유도 후 럭 스 오 페론을 포함 하는 조립된 pET28a 플라스 미드의 식 문화는 예를 보여 줍니다. 유도 후 약 1 h, 후 대장균 세포 블루-그린 색상으로 빛나는 시작 합니다. 그림 8 A 보여줍니다 대장균 식 문화 촬영 빛에서과 어둠 속에서 같은 문화를 제공 하는 그림 8B . 그림 8 C 한 천 배지 세균성 생물 발광의 동일한 블루-그린 색상 특성에 어둠 속에서 빛나는 P. mandapamensis S1과 인공 바다 물 매체의 묘사.
그림 2 : 복제 전략 적용된 깁슨의 도식 대표. (I) 단계: 겹치는 뇌관 (색된 화살표; ca. 20-40 자료 쌍 중복) 설계 되었습니다. 겹치는 뇌관 어 닐 링 시퀀스 한 조각의 각각 5'과 3' 지역 및 인접 한 세그먼트의 각각 3'와 5' 영역 구성 포함 됩니다. 단계 (II): 어셈블리에 대 한 설계 조각 표준 PCR 반응을 통해 생성 됩니다. 단계 (III): 대상 벡터 제한 소화 (예를 들어, NcoI, XhoI)에서 오는지 이다. 단계 (IV): 모든 조각 및 선형화 벡터 DNA 농도 깁슨 (제조 업체의 프로토콜)에 따라 어셈블리에 대 한 적절 한 농도 조정 하려면 결정 해야 합니다. 단계 (V): 모든 조각이 있고 최적화 된 DNA 농도와 선형화 벡터 깁슨 어셈블리 마스터 믹스 (T5 exonuclease, DNA 중 합 효소와 DNA 리가)와 함께 결합 되어 1 h. 50 ° C에서 알을 품는 단계 (VI): 어셈블리 제품 변형 적절 한 대장균 에 표준 프로토콜에 따라 고수익 플라스 미드 복제 (예를 들면, 대장균 TOP10 또는 XL-1) 스트레인. 단계 (7 세): 플라스 미드의 정확한 어셈블리를 확인 하려면 조립된 플라스 미드의 DNA 연속 수행할 수 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 벡터 지도 pET28a 포함 하는 럭 스 리브 오 페론. P. mandapamensis 27561의 럭 스 리브 오 페론은 원래 유전자 순서 (luxCDABFEG ribEBH)에 pET28a의 다중 복제 사이트에 삽입 됩니다. 금지 사이트 복제에 사용 되는 NcoI 및 XhoI 있습니다. 파편은 오 페론의 깁슨 어셈블리에 사용 되는 오렌지에서 luxCDAB , luxF 녹색에서, 파란색에 luxEG 및 ribEBH 라벤더;에 유전자는 조각의 별도 상자로 표시 됩니다. 각 유전자는 오 페론의 사이 noncoding 시퀀스 적용된 복제 전략에 포함 됩니다. 최종 플라스 미드의 크기 pET28a 전체 럭 스 리브 오 페론을 포함 하는 14,625의 기본적인 쌍입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 성장 곡선 및 참조 긴장의 가벼운 강렬의 비교. 650에서 OD 및 초당 계산의 생물 발광 강도 마다 10 분 이상 28 ° c.에 10 h를 측정 했다 모든 측정은 각 4 개의 기술 복제와 3 개의 생물 복제의 의미 값입니다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 대장균 BL21 셀 (회색 사각형), 대장균 BL21 셀 포함 하는 빈 pET28a 벡터 (회색 원), 그리고를 대장균 BL21 셀 럭 스 리브 오 페론 삽입 (블랙 다이아몬드)와 pET28a 벡터를 포함 분석 했다 대장균 세포의 올바른 성장 동작을 확신 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : 성장 곡선의 비교와 럭 스 오 페론의 빛 강도 표현 대장균 (사각형) 및 P. mandapamensis 27561 (원) 파운드 매체 (오픈 기호) 또는 인공 바다 물 매체 (채워진된 기호). 모든 측정은 각 4 개의 기술 복제와 3 개의 생물 복제의 의미 값입니다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 모든 실험은 28 ° c.의 외피 온도에 수행 되었다 (A) 광학 밀도 (OD) 측정 650 파운드 매체 및 인공 바다 물 매체에 P. mandapamensis 27561 (오른쪽 패널) 비교 10 h. 대장균 럭 스 오 페론 식 (왼쪽된 패널) nm 10 분 마다 수행 했다. 650에서 셀 밀도 결정을 생물 발광 간섭을 피하기 위해 nm. (B) 빛의 강도 (생물 발광 [건의/s])의 측정은 수행 10 분 마다 10 h. 대장균 럭 스 오 페론 식 (왼쪽된 패널)는 파운드에 P. mandapamensis 27561 (오른쪽 패널)에 비해 중간과 인공 바다 물 매체입니다. (C) 상대 빛 강도 (RLU/OD) 대장균 (왼쪽된 패널) 및 P. mandapamensis 27561 (오른쪽 창)에서 표현 하는 럭 스 오 페론의 정상화 생물 발광 셀 밀도 의해 결정 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6 : 성장 곡선의 비교 및 대장균 의 빛 강도 24 h. 위한 럭 스 유전자 발현을 기반으로 650에서 OD 및 초당 계산의 생물 발광 강도 마다 10 분 이상 28 ° c.에 24 h를 측정 했다 모든 측정은 각 4 개의 기술 복제와 3 개의 생물 복제의 의미 값입니다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 또한, 상대 빛 강도 (RLU/OD) 생물 발광 세포 밀도 의해 정규화 되어 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7 : 발광 박테리아의 비교 평가 규정을 감지 하는 잠재적인 쿼럼. 발광 및 셀 밀도 10 h 10 분 마다 측정은 각 4 개의 기술 복제와 3 개의 생물 복제의 평균 값을 나타냅니다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. Photobacterium mandapamensis TH1의 측정 (사각형 검정), 브리 harveyi 14126 (회색 원)와 Photobacterium mandapamensis S1 (회색 다이아몬드);에 비교 했다 (A) 묘사 650에서 광학 밀도 (OD) nm, (B) 빛 강도 (생물 발광 [건의/s]), 그리고 (C) 상대 빛 강도 (RLU/OD). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 8 : 생물 발광 한 천 배지와 액체에서. (A) 5 L 플라스 크 2 L 파운드 매체와 주사 대장균 BL21 셀 pET28a 럭 스 오 페론 플라스 미드 빛에서 촬영을 표현. (B)는 같은 문화 (A)와 같이 어둠 속에서 촬영. 그림 A와 B는 식의 유도 후 약 2 시간을 촬영 했다. 어둠 속에서 촬영 하는 P. mandapamensis s 1의 질주 된 문화 (C) 인공 바다 물 매체 한 천 격판덮개. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
P. mandapamensis 27561의 전체 럭 스 리브 오 페론 구성 하는 4 개의 파편을 포함 하는 식 플라스 미드의 건설 깁슨 복제를 통해 달성 되었다. 이 대장균 기반 럭 스 유전자 발현에 빛을 방출 하는 대장균 세포 수 있습니다. 쿼럼 규정과 표준이 성장 조건 감지 피하이 시스템의 상당한 장점이 있습니다.
깁슨 복제 전략을 사용 하 여의 장점은 여러 선형 DNA 파편, 높은 유연성 및 특정 제한 사이트18,19,20에 대 한 필요의 쉬운 조립입니다. 이 메서드는 쉽게는 럭 스 오 페론, 단일 유전자 또는 유전자 클러스터를 제외 하 고 또는 새로운 유전자를 소개 또는 또 다른 한 긴장에서 유전자 교환를 변경할 수 있습니다. 이 방법의 응용 프로그램에 대 한 전제 조건 각각 럭 스 오 페론 유전자 시퀀스의 가용성 이다. 발광 박테리아의 작은 수에 대해서만 각각 럭 스 오 페론의 완전 한 DNA 순서 알려진 사용할 수 있습니다. 이 시퀀스의 많은 샷건 시퀀싱을 사용 하 여 생성 된 때문에 조각화 됩니다. 27561 조사 P. mandapamensis 의 경우 럭 스 오 페론의 완전 한 DNA 순서는 알려진 NCBI 유전자 데이터베이스 (은행: DQ988878.2).
깁슨 어셈블리의 프로토콜에서 하나의 중요 한 단계는 단일 조각의 DNA 농도의 계산 이다. 0.2-사용을 권장 했다 제조업체의 어셈블리 프로토콜에서 0.5 pmols 및 4-6 조각20,2120 µ L의 총 볼륨. 우리의 경우, 어디 luxCDABFEG ribEBH 는 4 조각으로 이루어져, 농도 및 총 볼륨 되었고 0.1 pmol 45 µ L, 각각, PCR 제품의 수익률에 따라. 한편으로, 농도 감소 하 고 다른 한편으로, 볼륨 증가 했다. 그럼에도 불구 하 고, 어셈블리 유효 하 게 매우 작용 하 고 DNA 시퀀싱 확인 첫 번째 시도에서 올바른 삽입. 이 찾기 쉽게 수정된18,,1920수 우리의 조사에 대 한 강력 하 고 적절 한 방법으로 깁슨 어셈블리 확인.
새로 설립된 된 플레이트 리더 분석 결과 메서드를 취급 하 게 쉬운 이다. 그것은 새로운의 간단한 기본 분석 가능 (유엔-) 알려진 또는 발광 세균 긴장과 제공 이미 빛 생산 (예를 들어, 낮은 세포 밀도에 발광에 지연)의 규제 메커니즘에 첫 번째 힌트. 또한, 함께 빛 생산 성장 조건 단순히 성장 매체 또는 온도 변경 하 여 쉽게 평가할 수 있습니다.
플레이트 리더 측정 28 ° c.에 수행 되었다 이 특이 한 설정에 대 한 이유는 30 ° C 이상의 온도 또는 심지어 전혀 성장 및 발광 리드 발광 세균성 긴장의 온도 감도 이다. Note, 플레이트 리더는 활성 냉각 시스템 누락의 제한 시간 동안 정의 된 온도 유지 수 있습니다. 따라서, 온도 측정 온도 수 있다.
개념의 증거로 서 발광 긴장 대장균 구문의 비교 P. mandapamensis (그림 5) 한 손으로 및 참조 측정 (그림 4)에 다른 한편으로 수행 및 확인 이 새로 설립된 된 시스템의 신뢰성입니다. 또한, 장기 측정 빛 방출 (그림 6)의 장 수를 보장합니다. 하지만 한 OD 값이 어디 적절 한 희석에 측정을 위해 필요한 것 사용 되는 측정 장치 (현재의 경우에서 약 15 h)의 특성에 따라 특정 광학 밀도, 위의 신뢰할 수 있는 고려 하는 검출기의 선형 범위입니다. OD 값에서이 높은 분산 확인이 오랜 시간 측정 신뢰할 수 없습니다. 따라서, 10 h 같은 짧은 측정은 여기 보고 실험 설정을 사용 하 여 것이 좋습니다.
설립된 플레이트 리더 분석 결과의 한계는 그림 7에서 볼 수 있습니다. 어려움은 측정의 적절 한 설정을 찾는 것입니다. '' 값 이득 사진 승수 관 (PMT)의 감도 조정합니다. 이득은 높은 이득 률은 신호 증가 의미 PMT에 신호 증폭 이다. 이득이 너무 낮게 설정 되어, 신호 대 잡음 비 증가 및 "낮은" 빛나는 발광 박테리아의 빛 강도 수 없습니다 하는 경우 어떤 더 많은 (표시 되지 않음 데이터 0에 가까운 신호)를 측정. 발광 분석 결과에 도전은 모든 세균성 긴장에 대 한 측정 결과 악기의 범위 내에서 머물 그래서 이득을 설정 하는 것 이다. 또한, 발광의 측정 범위는 측정 간격 시간에 따라 달라 집니다 (예를 들어, 2000000 1의 최대 s).
이득 2800, 경험적으로 테스트 하 고 특정 플레이트 리더가이 방법의 설립에 사용에 대 한 선택 이었다는 설정 했다. 사용된 이득 설정 허용 최대 방출된 빛의 녹화는 발광 하 여 대장균 시스템, P. mandapamensis 27561, P. mandapamensis s 1는 오버플로 없이 하지만 긴장 P. mandapamensis TH1 및 에 대 한 Harveyi V. 14126 이득 너무 높았다. 따라서, 이러한 후자의 변종 검출 한계를 초과 하 고 진짜 최대한 빛의 강도 측정할 수 없습니다. 이 기술적 제한 성장 조건 및 셀 밀도 비교할 수도 있지만 최대 발광에 높은 변화를 표시 하는 발광 박테리아의 비교를 방지 수 있습니다.
사용된 잘 플레이트 내에서 분석 된 세균성 긴장의 위치 경험적으로 평가 될 수 있다. 유리 바닥으로 검은 잘 접시 사용 되었다, 비록 샘플 사이 누화 관찰 되었다. 특정 긴장의 빛의 강도 너무 높은, 모든 이웃 웰 스 (예: 공백) 잘못 된 긍정적인 빛 배출량 표시 됩니다. 따라서, 그것은 개별적으로 또는 서로 특정 공간 분리와 함께 두 개의 다른 긴장을 측정 하는 것이 중요입니다.
많은 대장균 변종 럭 스 오 페론의 부분을 포함 하는 알려진 수정 되며 주로 응용 프로그램 지향15,,1617이미 있다. 여기에 설명 된 방법을 기초 연구, 예를 들어 각 럭 스 유전자를 별도로 분석의 가능성을 목표로 합니다. 생물 발광의 연구는 오랜 역사를가지고, 있지만 여전히 많은 관련 질문 있습니다. 제외 또는 럭 스 오 페론에서 유전자를 도입, 교환 다른 긴장에서 유전자 luxAB 유전자 또는 단백질을 분석 하 여 단지, 대장균 시스템 및 판의 추가 응용 프로그램을 처리 하기 쉬운에 포함 독자 분석 결과, 규제 프로세스 및 럭 스 유전자의 기능에 더 많은 정보를 얻을 수 수 있습니다.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
플레이트 리더에 대 한 자체 서 면된 스크립트에서 그의 지원을 위한 Wladislaw 마이어 (BMG Labtech GmbH) 감사 하겠습니다. 이 작품은 오스트리아에 의해 지원 되었다 "Fonds zur Förderung der wissenschaftlichen Forschung" (FWF) 오후 (P24189) 및 박사 학위 프로그램 "DK 분자 Enzymology" (W901) 오후.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NEBuilder High-Fidelity DNA Assembly Cloning Kit | New England Biolabs Inc. | E2621S | for 10 rxn dx.doi.org/10.17504/protocols.io.cwaxad |
| Phusion Polymerase | Thermo Scientific | F530S | |
| Q5 High Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs Inc. | M0491S | |
| GeneJet Genomic DNA Purififcation Kit | Thermo Scientific | K0721 | for 50 rxn |
| Restriction enzymes and buffer (NcoI, XhoI) | New England Biolabs Inc. | R3193S/R0146S | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up kit | Promega | A9282 | for 250 rxn |
| Monarch DNA Gel Extraction Kit | New England Biolabs Inc. | #T1020S | for 50 rxn |
| GeneJet Plasmid Miniprep Kit | Thermo Scientific | K0503 | for 250 rxn |
| GoTaq G2 DNA Polymerase | Promega | M7841 | |
| 24-well black sensoplate with glass bottom | Greiner Bio One | 662892 | |
| FLUOStar Omega plate reader | BMG Labtech | ||
| OPTIMA/Mars Analysis Software | BMG Labtech | Version 2.20 | |
| Microsoft Excel 2010 | Microsoft | ||
| Multitron Standard Incubator Shaker | Infors AG |
References
- Widder, E. A. Bioluminescence in the Ocean: Origins of Biological Chemical, and Ecological Diversity. Science. 328 (5979), 704-708 (2010).
- Dunlap, P. Bioluminescence, Microbial. Encycl Microbiol. , 45-61 (2009).
- Ulitzur, S., Hastings, J. W. Evidence for tetradecanal as the natural aldehyde in bacterial bioluminescence. Proc Natl Acad Sci USA. 76 (1), 265-267 (1979).
- Kurfürst, M., Ghisla, S., Hastings, J. W. Characterization and postulated structure of the primary emitter in the bacterial luciferase reaction. Proc Natl Acad Sci USA. 81, 2990-2994 (1984).
- Dunlap, P. Biochemistry and genetics of bacterial bioluminescence. Biolumin Fundam Appl Biotechnol. 1, 37-64 (2014).
- Meighen, E. A. Bacterial Bioluminescence: Organization, regulation, and application of the lux genes. FASEB J. 7, 1016-1022 (1993).
- Moore, S. A., James, M. N. G., O'Kane, D. J., Lee, J. Crystallization of Photobacterium leiognathi non-fluorescent flavoprotein with limited sequence identity to bacterial luciferase. J Mol Biol. 224, 523-526 (1992).
- Moore, S. A., James, M. N. G., O'Kane, D. J., Lee, J. Crystal structure of a flavoprotein related to the subunits of bacterial luciferase. EMBO J. 12 (5), 1767-1774 (1993).
- Moore, S. A., James, M. N. G. Common structural features of the luxF protein and the subunits of bacterial luciferase: Evidence for a (βα)8 fold in luciferase. Protein Sci. 3, 1914-1926 (1994).
- Moore, S. A., James, M. N. G. Structural refinement of the non-fluorescent flavoprotein from Photobacterium leiognathi at 1.60 Å resolution. J Mol Biol. 249, 195-214 (1995).
- Kita, A., Kasai, S., Miyata, M., Miki, K. Structure of flavoprotein FP390 from a luminescent bacterium Photobacterium phosphoreum refined at 2.7 Å resolution. Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 52 (1), 77-86 (1996).
- Bergner, T., et al. Structural and biochemical properties of LuxF from Photobacterium leiognathi. Biochim Biophys Acta - Proteins Proteomics. 1854 (10), 1466-1475 (2015).
- Defoirdt, T., Boon, N., Sorgeloos, P., Verstraete, W., Bossier, P. Quorum sensing and quorum quenching in Vibrio harveyi: Lessons learned from in vivo work. ISME J. 2 (1), 19-26 (2008).
- Meighen, E.
- Kelkar, M., De, A. Bioluminescence based in vivo screening technologies. Curr Opin Pharmacol. 12 (5), 592-600 (2012).
- Waidmann, M. S., Bleichrodt, F. S., Laslo, T., Riedel, C. U. Bacterial luciferase reporters: The Swiss army knife of molecular biology. Bioeng Bugs. 2 (1), 8-16 (2011).
- Wilson, T., Hastings, J. W. Bioluminescence living lights, lights for living. , Harvard University Press. (2013).
- Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nat Methods. 7 (11), 901-903 (2010).
- Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods Enzymol. 498, 349-361 (2011).
- NEB NEBuilder HiFi DNA Assembly Reaction. , (2015).
- Atlas, R. M. Handbook of Microbiological Media, Third Edition. , CRC Press. (2004).
