Summary
Alterações em metabólitos neuroativos Quinurenina caminho (KP) estão implicadas em doenças psiquiátricas. Investigar os resultados funcionais de um Quinurenina alterado via metabolismo na vivo em roedores pode ajudar a elucidar as novas abordagens terapêuticas. O protocolo atual combina abordagens bioquímicas e comportamentais para investigar o impacto de um desafio de Quinurenina aguda em ratos.
Abstract
O caminho da Quinurenina (KP) de degradação do triptofano tem sido implicado em transtornos psiquiátricos. Especificamente, o metabólito derivado astrocyte cinurênico ácido (KYNA), um antagonista em ambos N-metil-d-aspartato (NMDA) e α7 os receptores nicotínicos de acetilcolina (α7nACh), tem sido implicado em processos cognitivos na saúde e na doença. Como CLAYDSON níveis são elevados no cérebro de pacientes com esquizofrenia, uma avaria no glutamatérgico e receptores colinérgicos é acreditada para ser causalmente relacionadas com disfunção cognitiva, um domínio principal da psicopatologia da doença. CLAYDSON pode desempenhar um papel significativo pathophysiologically em indivíduos com esquizofrenia. É possível elevar CLAYDSON endógena do cérebro de roedor, tratar os animais com o Quinurenina bioprecursor direto, e estudos pré-clínicos em ratos demonstraram que elevações agudas na CLAYDSON podem impactar seus processos de aprendizagem e memória. O atual protocolo descreve esta abordagem experimental em detalhe e combina a) uma análise bioquímica da Quinurenina níveis no sangue e cérebro formação de CLAYDSON (usando cromatografia líquida de alta eficiência), teste b) comportamental para sondar o dependentes do hipocampo memória contextual (paradigma de vacância passiva) e c) uma avaliação do comportamento de sono-vigília [gravações telemetria combinando o eletroencefalograma (EEG) e eletromiografia (EMG) sinais] em ratos. Tomados em conjunto, uma relação entre elevados CLAYDSON, sono e cognição é estudada, e este protocolo descreve detalhadamente uma abordagem experimental para compreender os resultados da função de elevação Quinurenina e CLAYDSON formação na vivo em ratos. Resultados obtidos através de variações deste protocolo irão testar a hipótese de que o KP e CLAYDSON servem papéis pivotal em modulação sono e cognição nos Estados de saúde e na doença.
Introduction
A KP é responsável pela degradação de quase 95% do aminoácido essencial triptofano1. O cérebro de mamíferos, Quinurenina tidas em astrócitos é metabolizada na molécula pequena neuroativos CLAYDSON principalmente pela enzima Quinurenina aminotransferase (KAT) II2. CLAYDSON age como um antagonista nos receptores NMDA e α7nACh no cérebro2,3,4, e também alvos receptores, incluindo receptor aril hidrocarboneto (AHR) e a G-proteína de sinalização acoplado receptor 35 (GPR35)5 ,6. Em animais experimentais, elevações no cérebro CLAYDSON foram mostradas para prejudicar seu desempenho cognitivo em uma matriz de ensaios comportamentais2,7,8,9,10 . Uma hipótese emergente sugere que CLAYDSON desempenha um papel central na modulação de funções cognitivas pelo impacto de vigília-sono comportamento11, assim apoiam o papel das moléculas de derivados astrocyte em modulando a neurobiologia do sono e cognição,12.
Clinicamente, elevações em CLAYDSON foram encontradas no líquido cefalorraquidiano e tecido cerebral de post-mortem de pacientes com esquizofrenia13,14,15,16, um transtorno psiquiátrico debilitante caracterizada por deficiências cognitivas. Pacientes com esquizofrenia são também muitas vezes atormentados por distúrbios de sono que podem agravar a doença17. Compreender o papel do metabolismo de KP e CLAYDSON na modulação de uma relação entre o sono e cognição, particularmente entre a aprendizagem e memória, pode levar ao desenvolvimento de novas terapias para o tratamento destes resultados pobres em esquizofrenia e outros doenças psiquiátricas.
Um método confiável e consistente para a medição de metabólitos de KP é importante assegurar que as pesquisas emergentes de diferentes instituições podem ser integradas a compreensão científica da biologia de KP. Neste momento, descrevemos a metodologia para medir Quinurenina no plasma de ratos e CLAYDSON em cérebro de ratos por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC). O presente protocolo, que faz uso de uma detecção fluorimétrica na presença de Zn2 +, foi desenvolvido por Shibata18 e mais recentemente adaptado e otimizado para derivatize com acetato de zinco de 500 mM como o reagente pós-coluna, permitindo a a detecção de endógena, quantidades nanomolar de CLAYDSON no cérebro11.
Para estimular a produção de CLAYDSON endógena de novo como descrito no presente protocolo, a Quinurenina bioprecursor direto é injectada intraperitonealmente (i.p.) em ratos. Em combinação com avaliações bioquímicas para determinar o grau de produção CLAYDSON, os impactos de uma Quinurenina desafiam a memória hipocampo-dependente (paradigma de vacância passiva) e a arquitetura de sono-vigília (sinais de EEG e EMG) é também investigadas,11. Uma combinação destas técnicas permite o estudo do impacto bioquímico e funcional de um Quinurenina desafio na vivo em ratos.
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Protocol
Nossos protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de utilização e cuidados animais institucionais da Universidade de Maryland e seguiram guia do National Institutes of Health para o cuidado e o uso de animais de laboratório.
Nota: O adulto ratos machos Wistar (250-350 g) foram utilizados em todos os experimentos. Coortes separadas dos animais foram utilizados para análise bioquímica, experimentos comportamentais e gravações de sono-vigília. Os animais foram alojados em instalações climatizada no centro de pesquisa psiquiátrico de Maryland. Foram mantidos em um ciclo claro-escuro de 12/12 h, com luzes hora de zeitgeber (ZT) 0 e luzes apagadas às 12 ZT. Os animais receberam ad libitum acesso à comida e água durante os experimentos. A instalação foi totalmente credenciada pela Associação Americana para a acreditação do laboratório Cuidado Animal.
1. intraperitoneal Quinurenina administração a ratos
Nota: No presente protocolo, Quinurenina foi administrada em ZT 0 (o início da fase de luz) e tecido foi coletado na ZT 2 e 4 ZT para determinar um curso de tempo para o metabolismo da Quinurenina. Soro fisiológico injetado animais foram utilizados como um controle. Por exemplo, se um rato pesa 500 g e a dose desejada é de 100 mg/kg, o rato deve receber uma injeção de 5 mL de uma solução de 10 mg/mL de Quinurenina.
- Pesar de sulfato de L-Quinurenina ("Quinurenina") e coloque-o dentro de um frasco de vidro de 20 mL. Certifique-se de manter a Quinurenina no gelo em todos os momentos.
-
Adicione soro fisiológico para atingir a concentração desejada e ajustar o pH para 7,6 usando 1 N de hidróxido de sódio (NaOH). Vórtice e proceda à sonicação a solução até dissolver completamente a Quinurenina.
Atenção: Tome todas as precauções de recomendação ao manusear o NaOH.- Por exemplo, para alcançar uma solução de 10 mg/mL, pesar 200 mg de Quinurenina e colocá-lo em um frasco de vidro. Adicionar 15 mL de solução salina e vórtice e proceda à sonicação (20 kHz para s de 5 – 10, 1/8 de polegada de diâmetro microtip) para dissolver. Usando o NaOH, ajuste o pH da solução. Por último, utilize soro fisiológico para ajustar o volume de 20 mL.
- Pesar cada rato experimental e calcular o volume de cada injeção com base no peso do corpo do animal e a dose de tratamento desejado. Retire cuidadosamente o animal de sua gaiola em casa, injetar a solução intraperitonealmente e devolver o animal para sua gaiola.
2. cromatografia líquida de alto desempenho Quinurenina medições usando
- Coleção de tecido
Nota: No presente protocolo, Quinurenina foi administrada em ZT 0 (o início da fase de luz) e tecido foi coletado na ZT 2 e 4 ZT para determinar um curso de tempo para o metabolismo da Quinurenina. Soro fisiológico injetado animais foram utilizados como um controle.- Use o dióxido de carbono para abater o animal. Após os sinais da respiração a cessação por 1 min, execute um método secundário de eutanásia por decapitação.
- Para coletar o sangue do tronco inteiro, coloque um funil descartável em um tubo de 15 mL contendo 20 μL de K3-EDTA (0,5 M). Permitir que o sangue para dentro do tubo de drenagem do corpo. Inverter o tubo repetidamente para assegurar o EDTA é misturado ao longo.
- Com uma tesoura, corte a pele no topo da cabeça para baixo da linha média para expor o crânio. Remova qualquer músculo do pescoço em excesso na parte de trás do crânio e, na abertura para a medula espinhal, corte através do crânio de trás para frente.
- Com cuidado, puxe os dois lados do crânio aberto para expor o cérebro e então remova cuidadosamente o cérebro com fórceps para não danificá-lo. Retire os bulbos olfatórios com uma lâmina de barbear e cortar o cérebro pela metade para baixo da linha média. Usando a pinça, disse o hemibrain em regiões de interesse (ou seja, o hipocampo e córtex).
- Coloque todos os pedaços de cérebro dissecado em folha de alumínio em gelo seco. Depois que o tecido completamente congelados, transferir para um frasco de plástico de 20 mL e armazená-lo a-80 ° C.
- Centrifugar o sangue do baú a 300 x g por 10 min. Retire o sobrenadante (plasma) e transferi-lo para tubos de centrífuga de novo antes de armazená-los a-80 ° C.
- Preparação da amostra
- Plasma: coletado de animais tratados
- Descongelar o tubo congelado com plasma (consulte a etapa 2.1 para a coleção de tecido) no gelo molhado.
- Em um novo tubo de centrifugação, dilua a amostra com água ultrapura (1:2 para Quinurenina, 01:10 por CLAYDSON). Adicione 100 μL de amostra diluída, 25 μL de ácido perclórico de 6%.
Atenção: Tome todas as precauções de recomendação durante a manipulação de ácido perclórico. - Vórtice todas as amostras, então eles centrifugar a 12.000 x g por 10 min. Uma vez terminado, retirar 100 μL do sobrenadante (cada tubo) e colocá-los em um tubo de microcentrifugadora pequeno 0,25 mL para o Quinurenina ou determinação CLAYDSON.
- Cérebro: coletado de animais tratados
- Colocar os tubos com as amostras de cérebro congelado (consulte a etapa 2.1 para a coleção de tecido) em gelo seco. Pese individualmente cada amostra do cérebro em uma balança analítica precisa. Devolvê-lo ao tubo e colocá-lo no gelo seco.
- Depois que todas as amostras foi pesadas, avançar os tubos para o gelo molhado. Diluir cada amostra 01:10 w/v com água ultrapura e homogeneizá-los usando um sonicador (20 kHz para s de 5 – 10, 1/8 de polegada de diâmetro microtip). Por exemplo, para 100 mg de tecido cerebral, adicione 900 μL de água ultrapura.
- Alíquota 100 μL de cada diluição da amostra para um tubo novo e acidificá-lo com 25 μL de ácido perclórico a 25%. Vórtice, então ele centrifugar a 12.000 x g por 10 min.
- Após a centrifugação, remover 100 μL do sobrenadante e colocá-lo em tubos de microcentrifuga pequeno 0,25 mL para a determinação de CLAYDSON.
- Plasma: coletado de animais tratados
- Executar instalação e HPLC
- Prepare a fase móvel da 50mm de sódio acetato. Dissolva 6,81 g de acetato de sódio tri-hidratado em 1 L de água ultrapura. Ajustar o pH a 6.2 usando ácido acético glacial e vácuo filtrá-la em vidro limpo. Transferi a fase móvel acetato de sódio para um frasco de vidro limpo 1 L.
- Prepare o acetato de zinco de 500 milímetros. Dissolva 54,88 g de acetato de zinco em 500 mL de água ultrapura, então vácuo filtrá-la. Transfira para um frasco de vidro limpo 500 mL. Encha uma garrafa de 1 L com água ultrapura e uma garrafa de 500 mL com HPLC grau acetonitrilo.
- Coloque o tubo de entrada da máquina separadamente para a fase móvel, a água ultrapura e a 100% acetonitrila HPLC. Bomba de solução de acetato de zinco separadamente através de uma bomba peristáltica que combina com a pós-coluna fase móvel e antes de derivatização.
- Usando o painel de controle da máquina, programá-lo para executar acetonitrilo 5% e 95% de água ultrapura em 0,5 mL/min. deixe-o correr por 20 a 30 min alcançar uma pressão estável e linha de base.
- Mediante o estabelecimento de uma base estável, altere a composição da solução de acetonitrilo 5% e 95% de sódio acetato móvel fase. Equilibrar-se por 30 min.
- Ligue a lâmpada no detector de fluorescência e deixe-o aquecer.
- Entretanto, também ativar a bomba pós-coluna para um caudal de 0,1 mL/min. permitem atingir uma pressão estável de cerca de 500 psi após aproximadamente 20 min.
- Prepare as normas.
- Por CLAYDSON, começam com uma solução stock de 1 mM e diluí-la para preparar 5 concentrações padrão (ou seja, 10 nM, 5 nM, 2,5 nM, 1 nM e 500 pM).
Nota: Isto irá produzir uma curva padrão que variam de 200 fmoles de 10 fmoles por injeção de 20 μL. - Para Quinurenina, começam com uma solução stock de 1 mM e diluí-la para preparar 5 concentrações padrão (ou seja, 10 μM, 5 μM, 2,5 μM, 1 μM e 500 nM).
Nota: Isto irá produzir uma curva padrão que variam de 200 pmoles a 10 pmoles por injeção de 20 μL.
- Por CLAYDSON, começam com uma solução stock de 1 mM e diluí-la para preparar 5 concentrações padrão (ou seja, 10 nM, 5 nM, 2,5 nM, 1 nM e 500 pM).
- Configure o software de sistema HPLC para controlar os parâmetros de sequência de amostra e permitir a autoinjections de várias amostras.
- Quando na tela de "Executar a amostra", clique em "Arquivo" e arraste para baixo para "Criar nova amostra definido". Quando a nova janela se abre, selecione "Vazio". Individualmente, liste todos os padrões (ver passo 2.3.8) ou amostras na ordem que eles devem ser executados.
- Na coluna "Função", designe os padrões e amostras. As normas devem ser analisadas no início e no final da sequência. Injete água entre cada 5 amostras.
- Definir o tempo de execução para cada amostra de 15 min. Injete 20 μL da amostra das normas e a preparação do plasma ou injetar 30 μL da amostra a preparação de homogeneizado de cérebro.
- Definir os excitação e emissão de comprimentos de onda (depende do composto a ser avaliado) para Quinurenina à excitação: 365 nm, emissão: 480 nm e o tempo de retenção: ~ 6 min e por CLAYDSON à excitação: 344 nm, emissão: 398 nm e o tempo de retenção: ~ 11 min.
- Uma vez que todos os parâmetros foram estabelecidos e a máquina tem incubado, execute a sequência.
- Para quantificar os dados, navegue até a tela de "Projeto navegar". Na aba "Exemplo de moda", clique duas vezes na amostra definida para ser quantificada. A lista de todas as injeções, destacar todas as normas e com o botão direito. Na nova janela, selecione o "Processo" e, em seguida, use o menu drop-down para selecionar "Calibrar e dosar" ao lado "Como":.
- Destacar todas as normas novamente, botão direito do mouse e selecione "Review". Quando abrir cromatogramas, use os botões na parte superior para "Integrar" e então "calibrar" cada norma; Isto irá criar automaticamente a curva padrão.
- Retornar à guia "Amostra de moda" e clique duas vezes sobre o conjunto da amostra. Em seguida, destaca todas as normas. Repita o processo acima referido, mas em vez disso, selecionando "Quantitate" do menu drop-down. Destacar todas as amostras novamente, então clique com botão direito e selecione "Review". Quando cromatogramas aberto, use os botões na parte superior para "Integrar" e então "Dosar" cada amostra.
Nota: Isto imprimirá a concentração de cada amostra com base na curva padrão criada anteriormente.
3. paradigma de evasão passiva
Nota: Estes experimentos comportamentais foram projetados com base em nossos achados bioquímicos com o desafio de Quinurenina aguda. Para maximizar o aumento do cérebro CLAYDSON, Quinurenina (100 mg/kg) foi administrada em ZT 0, 2 h antes da sessão de treinamento no paradigma da vacância passiva para testar a aprendizagem hippocampal mediada, que ocorreu em 2 ZT. O aparelho consiste em 2 tamanhos igualmente compartimentos (21,3 cm de altura, 20,3 cm de largura e 15,9 cm de profundidade) separada por uma porta de guilhotina e contido dentro de uma caixa à prova de som. Os dois compartimentos do aparato de teste são denominados "lado bom" e o "lado negro". As paredes do lado da luz são claras e, durante os ensaios, uma luz acende para iluminar ainda mais este compartimento. As paredes do compartimento escuro são completamente cobertas para manter uma condição opacas.
-
Dia 1: julgamento de treinamento
- Antes do testar, limpe o aparelho com álcool 70%.
- Trazer os animais para a sala de testes.
- Delicadamente, coloque o animal experimental para o lado luz do aparelho e fechar e trancar a porta do aparelho e a caixa à prova de som.
- Usando o software associado, começa o julgamento. A tela inicial, selecione "Arquivo" e depois "Sessão aberta" do menu drop-down. Na nova janela, certifique-se que o procedimento correto e o aparelho está selecionado e clique em "Fechar". Em seguida, selecione "Configurar" e "Sinais". Na nova janela, selecione o aparelho correto e clique em "Problema".
Nota: O software iniciará uma luz para ligar na luz lateral do aparelho e abrir a porta de guilhotina entre os dois compartimentos. Um cronômetro será iniciado. - Quando o animal totalmente entra o lado negro do aparelho, a guilhotina porta irá fechar e um choque inevitável pé (0,56 mA por 1 s) serão entregues.
- Registrar o tempo decorrido antes do animal entrou no compartimento escuro.
- Após o animal ter recebido o choque, permitir 30 s de tempo de recuperação antes de retirar o animal do aparelho.
- Coloque a animal de volta em sua gaiola em casa.
- Antes de iniciar o julgamento com o próximo animal, limpe o aparelho limpo com uma toalha molhada e elimine qualquer pelotas fecais.
- Depois que todos os animais foram treinados, devolvê-los para as instalações de animais.
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Dia 2: teste de julgamento
- Trazer animais de volta para a sala de testes 24 h depois do julgamento de formação. Começa o teste julgamento para o primeiro animal por colocá-lo no lado luz do aparelho, fechando e trancando a porta e caixa à prova de som.
- Iniciar o julgamento de teste usando os mesmos comandos de software como o dia anterior; a luz acende na luz lateral do aparelho e abrirá a porta de guilhotina entre os dois compartimentos. Um cronômetro será iniciado.
- Quando o animal entra no compartimento escuro, fechará a porta de guilhotina. Registro do tempo decorrido.
Nota: O julgamento será encerrado através do software após um máximo de 300 s se o animal permanece do lado luz do aparelho de teste. - Coloque a animal de volta em sua gaiola em casa e limpar o aparelho (conforme descrito na etapa 3.1.9) antes de iniciar o julgamento com o próximo animal.
4. análise de dormir
- Através da implantação cirúrgica de um transmissor sem fio de EEG/EMG
Nota: Os transmissores de telemetria devem ser esterilizados e preparados antes da cirurgia.- Usando uma lâmina de barbear, retire com cuidado um pequeno comprimento do revestimento plástico para revelar os fios que se dirigem. Coloque os transmissores em um tubo cônico de 50 mL, preenchido com solução de esterilização [por exemplo, Wavecide (2,65% glutaraldeído)].
- Embora os transmissores na solução desinfectante para pelo menos 12 h. Então, antes da cirurgia, transfira a solução para um contentor de resíduos. Enxágue o transmissor com soro fisiológico estéril.
- No dia da cirurgia, pese o animal antes de colocá-lo em uma câmara de anestesia. Induzi o isoflurano 3 – 5%, em 100% O2.
- Após uma anestesia bem sucedida, remover o animal e raspar com cuidado, usando um barbeador elétrico, o topo da cabeça e pescoço, bem como um pequeno pedaço de cabelo na parte de trás do corpo, deixada um pouco e abaixo da caixa torácica.
- Administre o carprofeno (5 mg/kg) por via subcutânea para analgesia pós-operatória.
- Coloque uma almofada de aquecimento de água quente controlado termostaticamente conjunto a 37 ° C sob o animal para manter a temperatura do corpo do animal durante a cirurgia.
- Em uma armação estereotáxica, coloque o animal em um cone de nariz para manter a condição anestésica e colocar barras de orelha para estabilizar a cabeça. Esterilize a pele depilada, alternando compressas de betadine esfoliante e 70% de etanol. Aplica a pomada de opthalamic aos olhos para lubrificá-los.
- Para garantir a adequada anestesia antes da primeira incisão, use o teste do beliscão-dedo do pé.
- Usando um bisturi estéril, faça uma incisão de apenas atrás dos olhos até a nuca. O crânio e o músculo do pescoço cervical dorsal devem ser expostas.
- Se for necessário expor o crânio, use aplicadores com ponta de algodão para remover qualquer membranas. Abraçadeiras micro-bulldog podem ser usadas para manter a pele do crânio. Localize e marque a posição do bregma. Faça 2 buracos no crânio- e insira parafusos metais 2,0 mm anterior / + 1,5 mm lateral e 7,0 mm posterior /-1.5 mm lateral em relação ao bregma. Completas 2 revoluções para apertar os parafusos. Cobrir o crânio exposto com um pedaço de gaze.
- Usando uma tesoura cirúrgica estéril, fazer uma incisão dentro da cavidade do corpo, logo abaixo das costelas.
- Na folha de cirúrgica, certifique-se de registar o número serial do transmissor a ser implantado.
- Inserir o transmissor estéril dentro da cavidade do corpo. Os fios de arame devem estar fora do corpo.
- Use Suturas absorvíveis para costurar a parede muscular, garantindo que todos os contatos são reunidos para uma extremidade da incisão.
- Retire a gaze da cabeça e levante a pele apenas abaixo da incisão. Execute um par de hemostatos tempo estéril sob a pele da cabeça incisão para a incisão no lado. Mantenha a pressão sobre a pele de modo a minimizar qualquer lesão.
- Uma vez que o hemostatos são visíveis perto da incisão de corpo, clip qualquer membrana que pode cobri-los com tesoura cirúrgica e agarrar que o transmissor quatro leva com os hemostatos. Lentamente... tirar os hemostatos, para que os fios colocar sob a pele e corram para o crânio.
- Designe quais 2 pistas serão conectadas ao crânio. Usando fórceps, prenda a extremidade de um fio com uma mão e logo abaixo a extremidade da bainha plástica com o outro. Puxe o fio até laços individuais só podem ser feitos para fora.
- Firmemente enrole o fio em torno de um dos parafusos metais x 3 – 4. Uma vez seguro, aperte o parafuso para evitar que o fio se desenrolando e clip fora qualquer fio extra. Repita isto com o segundo protagonista e parafuso.
- Puxe ambas as pistas de EEG da cavidade do corpo para que eles se sentam confortavelmente contra o crânio.
- Use cimento dental para cobrir os parafusos e leva cortical, criando um tampão sobre o crânio exposto. Certifique-se que não há cimento dental adere à pele ou músculo e que são criadas sem bordas afiadas. Deixe o cimento dental secar.
Nota: A tampa deve ser pequena o suficiente para que a pele pode ser suturada por cima. - Para os condutores de EMG, prenda a extremidade do fio e bainha plástica conforme descrito na etapa 4.1.15. Estica o fio até os laços individuais são claramente discerníveis.
- Execute uma agulha 22g sob o músculo do pescoço do lado direito para 2 a 3 mm antes de permitir que a emergir. Utilizar suturas, coloque uma sutura simples, solta ao redor da agulha incorporada.
- Passe o fio de EMG na agulha e puxe a agulha para fora, permitindo que o fio de EMG para segmento sob o músculo. Aperte a sutura para garantir o fio permanece no lugar e clip extra de fio que pode emergir do músculo.
- Repita as etapas de 4.1.20 e 4.1.21 para o segundo protagonista de EMG, cerca de 1 mm abaixo do cabo de primeira.
- Puxe ambas as pistas de EMG da cavidade do corpo para que eles se sentam confortavelmente contra o músculo.
- Use pontos inabsorvíveis para fechar a incisão de cabeça e pescoço. Tuck todo fio extra sob a pele do corpo e usar clipes de ferida para fechar a incisão do corpo.
- Aplique pomada de lidocaína para ambos os locais de incisão para auxiliar o animal com dor pós-operatória.
- Retorno do animal para sua gaiola em casa, permitindo que a gaiola sentar-se sobre a almofada de aquecimento até que o animal se recuperou da anestesia.
Nota: O animal deve se recuperar por 7-10 dias antes do início das gravações.
- Usando uma lâmina de barbear, retire com cuidado um pequeno comprimento do revestimento plástico para revelar os fios que se dirigem. Coloque os transmissores em um tubo cônico de 50 mL, preenchido com solução de esterilização [por exemplo, Wavecide (2,65% glutaraldeído)].
- Gravação de EEG/EMG
Nota: No presente protocolo, nós administrado soro fisiológico ou Quinurenina na ZT 0 e então gravou os padrões de sono-vigília do animal por 24 h.- Complete todas as gravações de dormir em um quarto onde os animais não serão interrompidos para a duração da gravação.
- Coloque a gaiola em casa do animal (tendo o transmissor implantado de EEG/EMG) em uma unidade do receptor. Ligue o transmissor cirurgicamente implantado usando um ímã.
Nota: Uma luz deve aparecer na unidade receptora, quando o transmissor está ativado. - Configure a gravação dos dados do EEG/EMG usando o software associado.
- Selecione "Experimento" e, em seguida, "Criar" no menu suspenso. Nomeie o experimento e então salvá-lo. Em seguida, selecione o "Hardware" e, em seguida, "Editar a configuração de MX2".
- Na nova janela, selecione todos os transmissores utilizados no experimento e indicar qual voa cada é emparelhada com. Quando estiver pronto, inicie a gravação, pressionando "Começar todas contínua".
- Com o término dos experimentos, selecione "Parar todos contínua" no software associado e desligar os transmissores usando o ímã.
- Abater os animais por asfixia de CO2 seguida de uma punção cardíaca. Remova cuidadosamente o transmissor reabertura da incisão ao longo do topo da cabeça com uma tesoura cirúrgica e cortando as pontas livres do músculo dental cimento e pescoço.
- Em seguida, abrir a cavidade do corpo, localizar o transmissor e lentamente, remova-o do corpo.
- Análise de EEG/EMG
- Use o software associado para analisar os dados de sono-vigília. Abra o programa e selecione "Adicionar novo local". Na nova janela, selecione os dados para importá-lo para o software de pontuação.
Nota: Isto irá criar um novo arquivo dentro do software contendo todas as formas de onda brutos coletadas durante o experimento. - Marca manualmente os Estados de vigilância para os experimentos desejados. Depois de marcar, analise os parâmetros tais como a duração total, o número de acessos e a duração de tal média dos vários Estados vigilância [movimento rápido dos olhos (REM), não - REM NREM e despertar].
Nota: A análise pode ser realizada a gravação inteira ou encurtada para pontos específicos de tempo de interesse. Aqui, a análise foi realizada para o período de gravação entre ZT 0 a 2 ZT.
- Use o software associado para analisar os dados de sono-vigília. Abra o programa e selecione "Adicionar novo local". Na nova janela, selecione os dados para importá-lo para o software de pontuação.
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Representative Results
Para validar o uso de uma injeção intraperitoneal Quinurenina como um método para elevar o cérebro CLAYDSON, foi realizada uma análise HPLC de tecido. Curvas padrão (Figura 1) foram construídas usando o software associado e permitido para a quantificação das amostras de tecido. Cromatogramas representativas para Quinurenina e CLAYDSON são apresentadas na Figura 2. Quinurenina foi observada em um tempo de retenção de 6 min, e CLAYDSON tinha um tempo de retenção de 11 min. Para observar a dinâmica de KP, 100 mg/kg de Quinurenina foi administrado no presente protocolo, e tecido foi coletado imediatamente após a injeção, ou 2 ou 4 h pós-injeção (Figura 3a). Foram quantificados o plasma Quinurenina (Figura 3b) e hippocampal CLAYDSON (Figura 3C). Os parâmetros específicos utilizados na determinação dos metabolitos Quinurenina HPLC estão descritos na tabela 1. A curva de dose-resposta produzida pelo presente protocolo suporta sua descrição de uma injeção de Quinurenina aguda como um método para aumentar os níveis de CLAYDSON de cérebro, com um pico alcançado no pós-injeção de 2h e os níveis de CLAYDSON retornada a sua injeção de pós de 4h de base.
Baseado nas observações bioquímicas acima mencionadas, o treinamento no paradigma da vacância passiva foi realizado 2 h após a injeção Quinurenina (figura 4a). Não há diferenças de grupo foram observadas durante o julgamento de treinamento (figura 4b). Durante o julgamento de teste, os animais de controle exibido um aumento significativo na latência para entrar do lado escuro, indicando a aprendizagem contextual. Animais injetados com Quinurenina no dia anterior não exibir o mesmo aumento na latência, demonstrando um déficit na aprendizagem. Com base nesses resultados, podemos concluir que a elevação Quinurenina aguda, durante o tempo de aquisição de memória e consolidação, resulta em um desempenho prejudicado em uma tarefa mediada no hipocampo.
Para investigar o impacto de uma elevação de Quinurenina aguda durante a fase de luz na arquitetura do sono, os animais foram injetados com solução salina no dia 1 e Quinurenina no dia 2 de ZT 0 (Figura 5a). Sinais de EEG/EMG foram registrados telemetrically para o período inteiro de 48 h. Foram feitas comparações entre a injeção de solução salina (veículo) no dia 1 e a injeção de Quinurenina no dia 2. Os resultados indicaram uma redução na duração total de sono REM (apresentada como uma mudança de porcentagem da linha de base) durante as primeiras 2 horas (Figura 5b) depois de uma injeção. Isso foi espelhado por um aumento na duração do despertar durante estes períodos de tempo e uma ligeira redução no sono NREM. Estes resultados demonstram que uma elevação de Quinurenina aguda provoca perturbações na dinâmica de sono-vigília.
Figura 1: curvas padrão para uma injeção de KYNA e Quinurenina. 20 µ l de cada norma foi injetado para criar a curva padrão para Quinurenina (A) e (B) CLAYDSON. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: representante cromatogramas para Quinurenina e CLAYDSON. As normas foram executadas antes de uma amostra para confirmar seus tempos de retenção. Estes painéis mostram amostras representativas para Quinurenina de soro (A) e (B) cérebro CLAYDSON. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: análise de soro e tecido hippocampal por HPLC seguindo um desafio Quinurenina. (A) Quinurenina (100 mg/kg) ou salina foram administrados por uma injeção intraperitoneal em tempo de zeitgeber (ZT) 0. Os tecidos foram coletados 2 ou 4 post-injeção h. Os seguintes painéis mostram a exposição a (B) soro elevados Quinurenina Quinurenina e hippocampal CLAYDSON (C) os níveis de 2 h após a injeção. P < 0,001 indica o significado por um bidirecional análise de variância (ANOVA) seguido por um de Bonferroni t-testar a correção. N = 4-5 por grupo. Todos os dados são média ± SEM. Esta figura foi modificada de Pocivavsek et al . 11. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: efeito de uma elevação de Quinurenina na memória hipocampo-dependente no paradigma da vacância passiva. (A) Quinurenina (100 mg/kg) ou salina foram administrados por injeção intraperitoneal em tempo de zeitgeber (ZT) 0. Os animais foram treinados na tarefa em 2 ZT. 24 h após o treinamento, os animais foram testados para a formação da memória. (B), uma exposição no Quinurenina antes do treinamento reduzido a latência para evitar o contrário do compartimento escuro no dia do teste. P < 0,01, * * * P < 0,001 indicam o significado por um bidirecional análise de variância (ANOVA) seguido por um de Bonferroni t-testar a correção. N = 8 – 14 por grupo. Todos os dados são média ± SEM. Esta figura foi modificada de Pocivavsek et al . 11. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: efeito de uma elevação de Quinurenina na arquitetura de sono-vigília. (A) soro fisiológico (dia 1) e Quinurenina (100 mg/kg; dia 2) foram administrados por uma injeção intraperitoneal em tempo de zeitgeber (ZT) 0. O comportamento de sono foi gravado para o subsequente 24 h. (B) a duração do sono de movimento rápido dos olhos (REM) foi reduzida e a duração do velório foi aumentada nas primeiras 2 horas após a injeção de Quinurenina. P < 0,05 indica o significado por um bidirecional análise de variância (ANOVA) seguido por um de Bonferroni t-testar a correção. N = 6 – 8 por grupo. Todos os dados são média ± SEM. Esta figura foi modificada de Pocivavsek et al . 11. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Composição da fase móvel | acetato de sódio de 50 mM, pH 6.2 |
| 5% acetonitrila | |
| Taxa de fluxo da fase móvel | 0,5 mL/min |
| Reagente de derivatização pós-coluna | acetato de zinco de 500 mM |
| Taxa de fluxo de derivatização pós-coluna | 0,1 ml/min |
| Tipo de coluna | ReproSil-Pur C18 |
| Dimensões da coluna | 4 x 150 mm2 |
| Temperatura do detector | 4,0 º C |
| Comprimento de onda Quinurenina | Ex: 365, Em: 480 |
| Tempo de retenção Quinurenina | ~ 6 min |
| Comprimento de onda CLAYDSON | Ex: 344, Em: 398 |
| Tempo de retenção CLAYDSON | ~ 11 min |
Tabela 1: Parâmetros para uma determinação de HPLC de metabólitos de caminho Quinurenina.
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Discussion
Para uma avaliação fiável da CLAYDSON no cérebro após uma administração Quinurenina periférica, é fundamental para combinar e interpretar experimentos bioquímicos e funcionais. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado que permite que novos usuários para estabelecer métodos eficazes para medir o plasma Quinurenina e cérebro CLAYDSON de ratos. A medição da Quinurenina no plasma confirmou a injeção exata e a medição de um metabólito CLAYDSON confirma a síntese de novo no cérebro. Existem várias vantagens do método HPLC fluorométrica descrito, adaptado de Shibata18, para derivatize CLAYDSON na presença de Zn2 +, incluindo a capacidade de detectar precisamente quantidades endógenas de CLAYDSON no cérebro na faixa nanomolar . Além disso, o método foi adaptado para detectar a Quinurenina bioprecursor no plasma na faixa de micromolar ajustando os fluorométrica comprimentos de onda de excitação e emissão, conforme descrito no protocolo.
Passos críticos dentro do protocolo, tais como horários específicos entre o tratamento e a eutanásia, são descritos com precisão, determinar o curso do tempo da formação CLAYDSON no cérebro e orientar o projeto e análise do comportamental e sono experiências de monitoramento. Aprendizagem mediada por hippocampal foi avaliada utilizando o paradigma de vacância passiva e uma análise de sono foi conduzida com gravações de telemetria de dados de EEG/EMG. Como determinamos que o cérebro CLAYDSON eram maior injeção de pós de 2 h, nós calculamos a sessão de treinamento comportamental paradigma nesse sentido, para que a aquisição na tarefa passiva vacância ocorreu quando os níveis de CLAYDSON eram mais altos, em 2 ZT. Além disso, focamos também a análise do comportamento de sono-vigília na crítica ZT 0 para 2 ZT período de tempo durante o qual os níveis CLAYDSON foram mais altos no cérebro. Tomados em conjunto, o desenho experimental cuidadosamente considerado nos permitiu colmatar juntos resultados de experimentos bioquímicos e funcionais, introduzindo CLAYDSON como um modulador de tanto sono e cognição comportamento11.
Um número de limitações deve ser considerado no protocolo descrito. Para estimular a produção endógena de CLAYDSON, a Quinurenina bioprecursor direto foi injetada perifericamente em ratos. Quinurenina atravessa facilmente a barreira hemato - encefálica e o metabolismo de KP estimulado ocorre em uma variedade de cérebro regiões2. Atualmente focamos a elevação em derivados astrocyte CLAYDSON no hipocampo; no entanto, é importante considerar que injeções sistêmicas da Quinurenina também elevam metabolitos do ramo neurotóxico do protocolo de Quioto, incluindo 3-hydroxykynurenine (3-HK) e ácido quinolinic. Para arreliar distante os efeitos causados pelas elevações em HK-3 em comparação com aquelas causadas por elevações CLAYDSON, a metodologia deve ser ajustada. Além disso, a elevação de perfuse no metabolismo de KP em todo o cérebro11 fornece uma introspecção limitada as regiões específicas do cérebro que estão mediando as alterações no comportamento.
Ao projetar o experimento comportamental descrito aqui, nós aperfeiçoamos o paradigma de vacância passiva no que diz respeito a métodos existentes, conforme descrito em detalhes, empenhar-se mediada por hippocampal memória contextual. Memória é composta por três grandes subprocessos: codificação, consolidação e recuperação. Condições ideais para processos de consolidação de memória ocorrem durante o sono, quando recém codificado memória está integrada no longo prazo armazenamento19,20. Como estudos em roedores têm focado em janelas de tempo estreita de consolidação de memória e identificou que a memória aparece mais sensível quando o sono é adiado após a aquisição, optou-se por elevar o Quinurenina e formação CLAYDSON no cérebro durante este sensível janela de tempo, impactando a aquisição e a consolidação, para testar a hipótese do presente artigo. Nós não, no entanto, atualmente testar se a recuperação da memória foi impactada por Quinurenina elevações, como mostrada anteriormente21. É criticamente importante também considerar as regiões do cérebro envolvidas em roedores para executar uma tarefa. Enquanto que para este estudo, principalmente estávamos interessados no papel do hipocampo na cognição de modulação, modificações do protocolo podem ser útil para testar animais em paradigmas comportamentais alternativas que foram mostradas para ser impactado por uma aguda Quinurenina desafio, tais como medo condicionado e trabalhar tarefas de memória2,7,8,9,10.
Além disso, em vez de injeções sistêmicas da Quinurenina para elevar o cérebro CLAYDSON, estratégias alternativas a considerar incluem a infusão direta de CLAYDSON em uma área de interesse ou a alvo inibição da enzima sintetiza KAT II por farmacológica ferramentas ou abordagens moleculares do knock-down em regiões específicas do cérebro, para testar hipóteses mecanicistas. Enquanto essas abordagens também podem introduzir procedimentos potencialmente invasivos que independentemente afetar os resultados funcionais medidos, é fundamental para o planejamento de experimentos com condições de controlo ideal.
Por último, o sono gravação protocolo de EEG/EMG descrito aqui tem a vantagem de ser Telemétrico amarrados, eliminando o ruído elétrico, os artefatos de movimento e o risco de ferimentos em um animal que tem puxado os cabos amarrados ao invés. O tamanho físico e peso leve do dispositivo telemetria e respectiva colocação por via subcutânea, em vez de intraperitonealmente em ratos para otimizar a recuperação pós-cirúrgica, permite gravações sem fio que capturam o comportamento de vigília-sono naturalista com um livre amplitude de movimento. No entanto, uma consideração importante ao usar o sistema de telemetria é a capacidade limitada de gravação de canais múltiplos simultâneos. O paradigma atual pares um canal de EEG e um canal de EMG e permite o marcador de REM e NREM comportamento de velório.
A combinação dos métodos descritos atualmente fornece insights sobre ensaios comportamentais e bioquímicos para elucidar os resultados funcionais de uma elevação de Quinurenina. Estes protocolos demonstram uma relação entre o KP, cognição e sono, uma dinâmica nunca antes explorado. Utilizar os métodos experimentais detalhados fornecidos aqui irá aumentar o entendimento científico do impacto funcional da Quinurenina e neurobiologia CLAYDSON em animais. Em última análise, continuou trabalhando neste campo pode levar a novas abordagens terapêuticas para aliviar os resultados em indivíduos combater distúrbios psiquiátricos e perturbações no sono.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
O presente estudo foi financiado em parte pelo National Institutes of Health (R01 NS102209) e uma doação do Clare E. Forbes Trust.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wistar rats | Charles River Laboratories | adult male, 250-350 g | |
| L-kynurenine sulfate | Sai Advantium | ||
| ReproSil-Pur C18 column (4 mm x 150 mm) | Dr. Maisch GmbH | ||
| EZ Clips | Stoelting Co. | 59022 | |
| Mounting materials screws | PlasticsOne | 00-96 X 1/16 | |
| Nonabsorbable Sutures | MedRep Express | 699B | CP Medical Monomid Black Nylon Sutures, 4-0, P-3, 18", BOX of 12 |
| Absorbable Sutures | Ethicon | J310H | 4-0 Coated Vicryl Violet 1X27'' SH-1 |
| Dental Cement | Stoelting Co. | 51458 | |
| Drill Bit | Stoelting Co. | 514551 | 0.45 mm |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alliance HPLC system | |||
| E2695 separation module | Waters | 176269503 | |
| 2475 fluorescence detector | Waters | 186247500 | |
| post-column reagent manager | Waters | 725000556 | |
| Lenovo computer | Waters | 668000249 | |
| Empower software | Waters | 176706100 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Passive avoidance box for rat | |||
| Extra tall MDF sound attenuating cubicle | MedAssociates | ENV-018MD | Interior: 22" (W) x 22" (H) x 16" (D) |
| Center channel modulator shuttle box chamber | MedAssociates | ENV-010MC | |
| Stainless steel grid floor for rat | MedAssociates | ENV-010MB-GF | |
| Auto guillotine door | MedAssociates | ENV-010B-S | |
| Quick disconnect shuttle grid floor harness for rat | MedAssociates | ENV-010MB-QD | |
| Stimulus light, 1" white lens, mounted on modular panel | MedAssociates | ENV-221M | |
| Sonalert module with volume control for rat chamber | MedAssociates | ENV-223AM | |
| SmartCtrl 8 input/16 output package | MedAssociates | DIG-716P2 | |
| 8 Channel IR control for shuttle boxes | MedAssociates | ENV-253C | |
| Infrared source and dectector array strips | MedAssociates | ENV-256 | |
| Tabletop interface cabinet, 120 V 60 Hz | MedAssociates | SG-6080C | |
| Dual range constant current aversive stimulation module | MedAssociates | ENV-410B | |
| Solid state grid floor scrambler module | MedAssociates | ENV-412 | |
| Dual A/B shock control module | MedAssociates | ENV-415 | |
| 2' 3-Pin mini-molex extension | MedAssociates | SG-216A-2 | |
| 10' Shock output cable, DB-9 M/F | MedAssociates | SG-219G-10 | |
| Shuttle shock control cable 15', 6 | MedAssociates | SG-219SA | |
| Small tabletop cabinet and power supply, 120 V 60 Hz | MedAssociates | SG-6080D | |
| PCI interface package | MedAssociates | DIG-700P2-R2 | |
| Shuttle box avoidance utility package | MedAssociates | SOF-700RA-7 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sleep-Wake Monitoring Equipment | |||
| Ponehmah software | Data Sciences International (DSI) | PNP-P3P-610 | |
| MX2 8 Source Acquisition interface | Data Sciences International (DSI) | PNM-P3P-MX204 | |
| Dell computer, Optiplex 7020, Windows 7, 64 bit | Data Sciences International (DSI) | 271-0112-013 | |
| Dell 19" computer monitor | Data Sciences International (DSI) | 271-0113-001 | |
| Receivers for plastic cages, 8x | Data Sciences International (DSI) | 272-6001-001 | |
| Cisco RV130 VPN router | Data Sciences International (DSI) | RV130 | |
| Matrix 2.0 | Data Sciences International (DSI) | 271-0119-001 | |
| Network switch | Data Sciences International (DSI) | SG200-08P | |
| Neuroscore software | Data Sciences International (DSI) | 271-0171-CFG | |
| Two biopotential channels transmitter, model TL11M2-F40-EET | Data Sciences International (DSI) | 270-0134-001 |
References
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