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Chemistry

गोल्ड (III) के बंधन द्वारा गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन के विभिन्न संरचनाओं में Luminophore गठन

Published: August 31, 2018 doi: 10.3791/58141
Automatic Translation
1, 1
1Department of Physics and Optical Science, Center for Biomedical Engineering & Science, University of North Carolina

Summary

गोल्ड cations के बंधन का अध्ययन करने के लिए प्रोटोकॉल (au (III)) गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन के विभिंन संरचनाओं के लिए (BSA) के रूप में अच्छी तरह के रूप में निस्र्पक के लिए संरचना निर्भर अद्वितीय BSA-Au प्रतिदीप्ति प्रस्तुत कर रहे हैं ।

Abstract

प्रस्तुत प्रोटोकॉल के प्रयोजन के लिए Au (iii) BSA के लिए बाध्यकारी की प्रक्रिया का अध्ययन है, अनुरूप परिवर्तन-प्रेरित लाल प्रतिदीप्ति (λem = ६४० एनएम) के BSA-Au (iii) परिसरों । विधि को दिखाने के लिए पीएच समायोजित कर देता है कि लाल प्रतिदीप्ति के उद्भव BSA अनुरूपता के पीएच प्रेरित संतुलन संक्रमण के साथ संबद्ध है । रेड फ्लोरोसेंट BSA-Au (III) परिसरों केवल पर या ९.७ से ऊपर पीएच के एक समायोजन के साथ गठन किया जा सकता है, जो "एक फार्म" BSA के अनुरूप करने के लिए संगत । के लिए BSA को समायोजित करने के लिए प्रोटोकॉल au दाढ़ अनुपात और au (III) बाइंडिंग की प्रक्रिया के समय-पाठ्यक्रम की निगरानी करने के लिए वर्णन किया गया है । Au (III) प्रति BSA की ंयूनतम संख्या, लाल प्रतिदीप्ति का उत्पादन करने के लिए, सात से कम है । हम चरणों में प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए BSA में एकाधिक Au (III) बाध्यकारी साइटों की उपस्थिति वर्णन । पहले, तांबे (घन (द्वितीय)) या निकेल (एनआई (द्वितीय)) cations au (iii) द्वारा पीछा किया जोड़ने के द्वारा, इस विधि au (iii) है कि लाल fluorophore नहीं है के लिए एक बाध्यकारी साइट से पता चलता है । दूसरा, thiol कैपिंग एजेंटों द्वारा BSA संशोधित करके, एक और nonfluorophore-Au (III) बाध्यकारी साइट बनाने से पता चला है । तीसरा, डाइसल्फ़ाइड बांड के सट और कैपिंग द्वारा BSA अनुरूपता बदलने, संभव Au (III) बाध्यकारी साइट (ओं) सचित्र हैं । प्रोटोकॉल वर्णित, BSA संरचनाओं और Au (III) बाध्यकारी नियंत्रण के लिए, आम तौर पर अंय प्रोटीन और धातु cations की बातचीत का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है ।

Introduction

एक BSA-Au यौगिक एक पराबैंगनी (यूवी) का प्रदर्शन-उत्तेजित लाल प्रतिदीप्ति, उल्लेखनीय स्टोक्स बदलाव के साथ, मूल रूप से Xie एट अलद्वारा संश्लेषित किया गया है । 1. अद्वितीय और स्थिर लाल प्रतिदीप्ति संवेदन2,3,4, इमेजिंग5,6,7, या nanomedicine 8 जैसे क्षेत्रों में विभिन्न अनुप्रयोगों पा सकते हैं ,9,10,11,12,13. इस यौगिक हाल के वर्षों में नैनो विज्ञान के क्षेत्र में कई शोधकर्ताओं द्वारा बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है14,15,16. BSA-au यौगिक au25 nanoclusters के रूप में व्याख्या की गई है । प्रस्तुत विधि का लक्ष्य विस्तार से इस यौगिक की जांच करना और लाल प्रतिदीप्ति की उत्पत्ति को समझना है । प्रस्तुत दृष्टिकोण का पालन करके, एकाधिक au बाध्यकारी साइटों की उपस्थिति, और प्रतिदीप्ति के मूल, au25 nanoclusters के एकल साइट nucleation के लिए वैकल्पिक, सचित्र किया जा सकता है । एक ही दृष्टिकोण कैसे अंय प्रोटीन17,18,19 Au (III) के साथ परिसर में अपने आंतरिक फ्लोरोसेंट संपत्तियों को बदल सकते है अध्ययन करने के लिए नियोजित किया जा सकता है ।

लाल-फ्लोरोसेंट BSA-au यौगिक के संश्लेषण के लिए प्रतिदीप्ति की तीव्रता को अधिकतम करने के लिए au (BSA: au) के दाढ़ अनुपात के एक संकीर्ण नियंत्रण की आवश्यकता है और उत्तेजना उत्सर्जन नक्शे (EEM)20में चोटियों के स्थान । यह दिखाया जा सकता है कि कई बाध्यकारी साइटों Au के लिए मौजूद (III) Asparagine टुकड़ा (या Asp टुकड़ा, N-BSA के पहले चार अमीनो एसिड अवशेषों सहित),21,22से बाइंड करने के लिए । BSA (Cys-३४) के ३४वें एमिनो एसिड भी au (iii) समंवय करने के लिए और लाल प्रतिदीप्ति ([Cys34-छाया हुआ-BSA]-au (iii))20के तंत्र में शामिल होने के लिए दिखाया गया है । पर सभी Cys-Cys डाइसल्फ़ाइड बांडों और कैपिंग सभी thiols, लाल प्रतिदीप्ति का उत्पादन नहीं है ([सभी thiol-छाया-BSA]-Au (III)) । यह लाल प्रतिदीप्ति का निर्माण करने के लिए Au (III) बाइंडिंग साइट के रूप में Cys-Cys डाइसल्फ़ाइड बांड की आवश्यकता को इंगित करता है ।

प्रोटीन रसायन विज्ञान तकनीक व्यापक रूप से नैनो में BSA-Au (III) परिसरों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया गया है साइंस समुदाय । हालांकि, यह इन तकनीकों को रोजगार के लिए इन परिसरों के कुछ पहलुओं को समझने के लिए मूल्यवान होगा, के रूप में अच्छी तरह के रूप में Au (III) BSA में बाध्यकारी साइटों की विस्तृत समझ हासिल करने के लिए । यह आलेख इन तकनीकों में से कुछ को दिखाने के लिए अभिप्रेत है ।

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Protocol

1. BSA का संश्लेषण-Au (III) जटिल

  1. एक 5 मिलीलीटर प्रतिक्रिया शीशी में उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) ग्रेड पानी की 1 मिलीलीटर में BSA के 25 मिलीग्राम भंग ।
    नोट: समाधान स्पष्ट दिखाई देना चाहिए ।
  2. सोने को भंग (III) क्लोराइड trihydrate (chloroauric एसिड) HPLC ग्रेड पानी में 5 मिमी की एकाग्रता के लिए ।
    नोट: समाधान पीला दिखाई देना चाहिए । Chloroauric एसिड इस एकाग्रता पर तैयार समाधान एक BSA में 1:13 के अनुपात Au के लिए परिणाम होगा ।
    1. वैकल्पिक रूप से, ०.३८ mm (BSA: au = 1:1) के बीच कहीं भी की एकाग्रता के साथ chloroauric एसिड का एक समाधान तैयार HPLC ग्रेड पानी में 20 mm (BSA: au = 1:50) ।
      नोट: सोने के लिए BSA के विभिंन अनुपात काफी उत्तेजना उत्सर्जन नक्शे के विभिंन लाल प्रतिदीप्ति पैटर्न में परिणाम होगा ।
  3. एक ३७ ° c पानी स्नान में BSA की प्रतिक्रिया शीशी प्लेस और जोरदार एक चुंबकीय सरगर्मी का उपयोग कर ७५० rpm पर हलचल ।
  4. सरगर्मी शुरू होने के तुरंत बाद, समाधान के लिए chloroauric एसिड की 1 मिलीलीटर जोड़ें । समाधान का रंग स्पष्ट से पीला करने के लिए बदलना चाहिए ।
  5. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए मिश्रण हिलाओ और ७५० rpm पर एक चुंबकीय सरगर्मी का उपयोग कर ।
  6. प्रतिक्रिया शीशी में, 1 मीटर NaOH के १०० μL जोड़ने के लिए 12 के लिए पीएच लाने के समाधान के लिए ।
    नोट: NaOH के तुरंत बाद, समाधान एक पीले भूरे रंग के लिए थोड़ा अंधा और फिर पीले रंग में वापस बारी चाहिए ।
  7. 2 घंटे के लिए ७५० rpm पर और ३७ डिग्री सेल्सियस पर हलचल जारी है । समाधान धीरे पीले से एक गहरे पीले रंग के लिए बदलना चाहिए/ यह रंग परिवर्तन लाल fluorescing BSA-Au (III) परिसर के गठन को इंगित करता है ।
  8. नमूना 2 दिनों के लिए कमरे के तापमान पर बैठने के लिए अनुमति दें, और समाधान एक एंबर ब्राउन करने के लिए काला करने के लिए जारी रहेगा और प्रतिदीप्ति तीव्रता में वृद्धि होगी ।
    1. वैकल्पिक रूप से, दो नमूने के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर हलचल जारी रखने के लिए 12 अधिक एच समाधान के रंग के रूप में एक एंबर ब्राउन के लिए विकसित ।

2. BSA का संश्लेषण-घन (द्वितीय)-Au (III)

  1. HPLC ग्रेड पानी की 1 मिलीलीटर में BSA के 25 मिलीग्राम भंग । समाधान स्पष्ट दिखाई देना चाहिए ।
  2. तांबा भंग (द्वितीय) क्लोराइड डाईहाइड्रेट HPLC ग्रेड पानी में 5 मिमी की एकाग्रता के लिए । समाधान हल्का नीला दिखाई देना चाहिए ।
  3. ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक पानी स्नान में एक 5 मिलीलीटर प्रतिक्रिया शीशी और जगह के लिए जलीय BSA समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें । ७५० rpm पर मिश्रण हिलाओ ।
  4. तुरंत तांबे की ०.५ मिलीलीटर (II) क्लोराइड डाईहाइड्रेट समाधान प्रतिक्रिया शीशी और मिश्रण के लिए 2 मिनट के लिए जोड़ें । इसका समाधान हल्का नीला ही रहेगा ।
  5. 1 मीटर NaOH के ७५ μL जोड़ें 12 के लिए पीएच लाने के लिए और 2 एच के लिए मिश्रण करने के लिए अनुमति देते हैं । समाधान बैंगनी हो जाएगा ।
  6. 5 मिमी की एकाग्रता के लिए HPLC ग्रेड पानी में chloroauric एसिड भंग.
  7. प्रतिक्रिया शीशी के लिए जलीय chloroauric एसिड की ०.५ मिलीलीटर जोड़ें और पीएच 1 मीटर NaOH का उपयोग कर वापस 12 को समायोजित करें ।
  8. 2 एच के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण हिलाओ ।
    नोट: समाधान एक भूरे रंग के लिए विकसित करना चाहिए ।

3. BSA का संश्लेषण-Ni (II)-Au (III)

  1. HPLC ग्रेड पानी की 1 मिलीलीटर में BSA के 25 मिलीग्राम भंग । समाधान स्पष्ट दिखाई देना चाहिए ।
  2. निकल भंग (द्वितीय) क्लोराइड 5 मिमी की एकाग्रता के लिए HPLC ग्रेड पानी में hexahydrate । समाधान हल्के हरे रंग का दिखाई देना चाहिए ।
  3. एक 5 मिलीलीटर प्रतिक्रिया शीशी और ३७ में एक पानी स्नान में जगह के लिए जलीय BSA समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें oC. ७५० rpm पर मिश्रण हलचल ।
  4. तुरंत निकल के ०.५ मिलीलीटर जोड़ें (द्वितीय) hexahydrate समाधान की प्रतिक्रिया शीशी और मिश्रण के लिए 2 मिनट क्लोराइड ।
    नोट: समाधान हल्के हरे रंग का रहेगा ।
  5. 1 मीटर NaOH के ७५ μL जोड़ें 12 के लिए पीएच लाने के लिए और 2 एच के लिए मिश्रण करने के लिए अनुमति देते हैं ।
    नोट: समाधान डार्क येलो बन जाएगा ।
  6. 5 मिमी की एकाग्रता के लिए HPLC ग्रेड पानी में chloroauric एसिड भंग.
  7. प्रतिक्रिया शीशी के लिए जलीय chloroauric एसिड की ०.५ मिलीलीटर जोड़ें और पीएच वापस 12 को समायोजित करें ।
  8. 2 एच के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण हिलाओ ।
    नोट: समाधान एक भूरे रंग के लिए विकसित करना चाहिए ।

4. का संश्लेषण [Cys34-ढकी-BSA]-Au (III)

  1. भंग 2 एन के मिलीग्राम-ethylmaleimide (NEM) में 1 फॉस्फेट के मिलीलीटर बफर (पंजाब, पीएच ७.४) ।
  2. विच्छेदन 2 पंजाबियों के 1 मिलीलीटर में BSA के मिलीग्राम-NEM समाधान ।
  3. एक 5 मिलीलीटर प्रतिक्रिया शीशी के समाधान स्थानांतरण और 20 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए ५०० rpm पर हलचल ।
  4. Dialyze के ५०० मिलीलीटर में 12 केडीए डायलिसिस ट्यूबिंग का उपयोग कर समाधान, एक चुंबकीय सरगर्मी के साथ ५० rpm पर क्रियाशीलता NEM को दूर करने के लिए सरगर्मी ।
  5. ०.४ मिमी की एकाग्रता के लिए पंजाब में chloroauric एसिड भंग.
    नोट: समाधान एक बेहोश पीला हो जाएगा ।
  6. ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक जल स्नान के लिए प्रतिक्रिया शीशी स्थानांतरण । ७५० rpm पर हिलाओ ।
  7. तुरंत प्रतिक्रिया शीशी के लिए chloroauric एसिड समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ने और 2 मिनट के लिए मिश्रण करने के लिए अनुमति देते हैं ।
  8. 12 के लिए पीएच लाने और 2 एच के लिए मिश्रण करने के लिए अनुमति देने के लिए 1 मीटर NaOH की प्रतिक्रिया शीशी के लिए ७५ μL जोड़ें ।

5. का संश्लेषण [all-thiol-ढकी-BSA]-Au (III)

  1. HPLC ग्रेड के पानी में 2 मीटर यूरिया और ५० एमएम अमोनियम बिकारबोनिट (NH4HCO3, पीएच ८.०) का सॉल्यूशन तैयार करें ।
  2. भंग ३.३ उपरोक्त समाधान के 1 मिलीलीटर में BSA के मिलीग्राम और एक 5 मिलीलीटर प्रतिक्रिया शीशी को हस्तांतरण ।
  3. ०.२५ एम tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) का एक शेयर समाधान करें ६२.५ मिलीग्राम TCEP के 1 मिलीलीटर HPLC पानी में भंग करके ।
  4. TCEP के अंतिम एकाग्रता 8 मिमी है जब तक प्रतिक्रिया शीशी TCEP के शेयर समाधान जोड़ें ।
  5. ५० डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए एक पानी स्नान में समाधान की मशीन । ५०० rpm पर हिलाओ एक चुंबकीय सरगर्मी का उपयोग कर ।
  6. कमरे के तापमान को पूरी तरह से शांत करने के लिए समाधान की अनुमति दें ।
  7. HPLC ग्रेड पानी की 1 मिलीलीटर में NEM के १२.५ मिलीग्राम भंग करके १०० mM NEM के शेयर समाधान तैयार करें ।
  8. NEM की अंतिम एकाग्रता 16 मिमी है जब तक NEM के शेयर समाधान प्रतिक्रिया शीशी में जोड़ें ।
  9. 20 डिग्री सेल्सियस पर 2 एच के लिए गठबंधन करने के लिए समाधान की अनुमति दें । ५०० rpm पर हिलाओ ।
  10. एक 12 केडीए डायलिसिस ट्यूबिंग का उपयोग कर समाधान Dialyze, ५० rpm पर एक चुंबकीय सरगर्मी के साथ रात भर में समाधान सरगर्मी ५० mM एनएच4HCO3 के ५०० मिलीलीटर में अतिरिक्त TCEP, NEM, और यूरिया को दूर करने के लिए ।
  11. ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक जल स्नान के लिए प्रतिक्रिया शीशी हटो और ७५० rpm पर हलचल ।
  12. ०.६६ मिमी की एकाग्रता के लिए HPLC ग्रेड पानी में chloroauric एसिड भंग.
  13. तुरंत प्रतिक्रिया शीशी के लिए chloroauric एसिड समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ने और 2 मिनट के लिए मिश्रण करने के लिए अनुमति देते हैं ।
  14. समाधान के पीएच 12 है जब तक 1 मीटर NaOH जोड़ें और समाधान 2 एच के लिए मिश्रण करने के लिए जारी रखने के लिए अनुमति देते हैं ।

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Representative Results

BSA-Au (III) परिसर के प्रतिदीप्ति से, यह देखा गया है कि आंतरिक ब्लू प्रतिदीप्ति के BSA के रूपांतरण (λem = ४०० एनएम) लाल प्रतिदीप्ति (λem = ६४० एनएम) के बारे में पीएच ९.७ में एक संतुलन के माध्यम से होता है संक्रमण (1 चित्रा) । EEM BSA-au (III) के विभिंन BSA पर au दाढ़ अनुपात में दिखाया गया है चित्रा 2, और इस डेटा से पता चलता है कि कैसे दाढ़ अनुपात में फेरबदल अलग उत्तेजना तरंग दैर्ध्य पर एक ही उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य पैदावार । घन (द्वितीय), एनआई (द्वितीय), और Au (III) प्रतिस्पर्धी BSA (चित्रा 3) में एक ज्ञात साइट (Asp टुकड़ा) के लिए बाइंड । Cys34-छाया हुआ BSA Au पर EEM पीक पैटर्न में परिवर्तन (III) बंधन से पता चलता है, और इन परिणामों को दिखाने के विशिष्ट बाध्यकारी साइटों के फेरबदल कैसे प्रतिदीप्ति पैटर्न बदल । सभी thiol-छाया BSA कोई लाल प्रतिदीप्ति से पता चलता है और संभव बंधन साइटों के रूप में Cys Cys डाइसल्फ़ाइड बांड को लाल fluorophore (चित्रा 4) का उत्पादन करने के लिए प्रकट होता है ।

Figure 1
चित्र 1. BSA-Au (III) और प्रतिदीप्ति के गठन के लिए लाल रंग से प्रेरित परिवर्तन । (क) BSA-Au (III) के अवशोषण और प्रतिदीप्ति (λex = ३६५ एनएम) । (ख) लाल प्रतिदीप्ति प्राणियों के आसपास पीएच ९.७ में उभरने, जिस पर BSA के अनुरूप परिवर्तन । (ग) नीली प्रतिदीप्ति क्षय के रूप में लाल प्रतिदीप्ति उभर आती है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2. अनुपात-मैट्रिक उत्तेजना-उत्सर्जन मानचित्र (EEM) मापन BSA-Au (III) । EEM के BSA-Au (III) जटिल मानक प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए BSA के अनुपात को समायोजित करने के लिए सोने की संश्लेषित । (A) BSA पर पीएच 12, (B) BSA: au = 1:1, (C) BSA: au = 1:7, (D) BSA: au = 1:13, (E) BSA: au = 1:26, (F) BSA: au = 1:30, (G) BSA: au = 1:40, (H) BSA: au = 1:52 । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3. EEM of BSA-घन (ii)/Ni (ii)-Au (III) परिसर । उत्तेजना-उत्सर्जन मानचित्र (उत्तेजना: २९०-५०० एनएम; उत्सर्जन: ३००-८५० एनएम) घन (ii)/Ni (ii) पीएच 12 (ए और बी), BSA घन (ii)/Ni (ii) के साथ और फिर BSA (III) पीएच 12 में (सी और डी), और अवशोषण के साथ परिसर के साथ परिसर में । स्पेक्ट्रा की तुलना BSA, BSA-au, BSA-घन (ii)/Ni (ii) और BSA-घन (ii)/Ni (ii)-Au (III) (E and F) । वक्र 4 curves 2 और 3 के superposition के साथ तुलना में है । इस आंकड़े को डिक्सन, जे. एम. एंड Egusa, एस. जे. के. रसायन. समाज से संशोधित किया गया है । १४० 2265-2271, (२०१८) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4. EEM का Cys34 छाया हुआ और सब thiols छाया रहा. EEM (उत्तेजना: ३००-५०० एनएम; उत्सर्जन: ३००-७०० एनएम) के (क) Cys34 छाया हुआ BSA 12 पीएच पर Au के साथ प्रतिक्रिया व्यक्त की । (ख) में, BSA में सभी Cys-Cys डाइसल्फ़ाइड बांडों से सट गए और फिर सभी thiol-छाया-BSA पर Au के साथ पीएच 12 में प्रतिक्रिया व्यक्त की गई । इस आंकड़े को डिक्सन, जे. एम. एंड Egusa, एस. जे. के. रसायन. समाज से संशोधित किया गया है । १४० 2265-2271, (२०१८) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

BSA-Au (III) पर तैयार यौगिकों पीएच 12 प्रदर्शन लाल प्रतिदीप्ति के एक उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य λem= ६४० एनएम जब पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश λex= ३६५ एनएम (आंकड़ा 1a) के साथ उत्साहित । लाल प्रतिदीप्ति के उद्भव एक धीमी प्रक्रिया है और एक अधिकतम तीव्रता को बढ़ाने के लिए कमरे के तापमान पर कुछ दिनों में ले जाएगा । ३७ डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया रनिंग इष्टतम परिणाम निकलेगा, हालांकि उच्च तापमान लाल प्रतिदीप्ति तेजी से उत्पादन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । प्रोटीन की अपरिवर्तनीय गिरावट ४५ ° c23से ऊपर तापमान पर हो सकता है । ph का समायोजन जिससे BSA अपने वृद्ध (ph > 10) क्षेऽ21 ("A-form") में रूपांतरित होता है, लाल प्रतिदीप्ति के लिए महत्वपूर्ण है; पीएच पतले तटस्थ से लाल प्रतिदीप्ति (आंकड़ा 1b, सी) की घटना की दहलीज निर्धारित करने के लिए बुनियादी समायोजित है । अधिकतम लाल फ्लोरोसेंट तीव्रता के लिए, पीएच 11 से ऊपर समायोजित किया जाना चाहिए । लाल प्रतिदीप्ति के लिए, पीएच 11 से परे समायोजित किया जा सकता है, हालांकि अत्यंत बुनियादी (पीएच > 13) शर्तों BSA स्वभाव कर सकते है और लाल प्रतिदीप्ति के कारण गायब हो ।

BSA और au के stoichiometric अनुपात अलग BSA के लिए au के बंधन वर्णन कर सकते हैं । BSA के प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा-au (III) यौगिकों (चित्रा 2) au के लिए BSA के stoichiometric अनुपात के आधार पर बदलती हैं । सोने के अनुपात के लिए BSA 1:26 करने के लिए समायोजित किया जाता है के रूप में, लाल प्रतिदीप्ति तीव्रता में एक अधिकतम λex= ५०० एनएम पर मनाया जाता है । दूसरी ओर, के रूप में BSA: सोने के अनुपात 1:7 के लिए समायोजित किया जाता है, लाल प्रतिदीप्ति मुख्य रूप से λex= ३६५ एनएम पर मनाया जाता है । कोई लाल प्रतिदीप्ति 1:7 या 1:52 से ऊपर कम Au के लिए BSA के अनुपात में पता लगाया जा सकता है । लाल प्रतिदीप्ति का उत्पादन करने के लिए आवश्यक गोल्ड cations की न्यूनतम संख्या 7 से कम और 1 से अधिक है, और लाल प्रतिदीप्ति के नुकसान के लिए अधिकतम संख्या ५२ (चित्रा 2 बी, सी) से अधिक है । इसके अतिरिक्त, सभी aforementioned नमूनों की कमी अतिरिक्त सोडियम borohydride के तहत हो जाएगा, elucidating कि सभी नमूनों अभी भी शामिल cationic Au (III) । इसके अलावा, 20 मिमी से परे सोने की अधिक मात्रा के अतिरिक्त समाधान के कारण भी अंलीय हो सकता है और प्रोटीन स्वभाव । यदि प्रोटीन विकार उच्च अम्लता के कारण होता है, BSA की एकाग्रता को कम करने और इस मुद्दे मध्यस्थता करने के लिए अपेक्षाकृत Au.

BSA के लिए Au और अंय धातु cations के प्रतिस्पर्धी बंधन BSA में बाध्यकारी साइटों को उदाहरण देकर स्पष्ट कर सकते हैं । ज्ञात हो कि घन (ii) और Ni (ii) दोनों ने Asp अंश को BSA24,25,26,27के N-टर्मिनस पर बाइंड कर दि या है । घन के अलावा के माध्यम से (II), Asp-टुकड़ा करने के लिए एक मजबूत बांधने की मशीन, au (iii) के अलावा के बाद, BSA के अवशोषक स्पेक्ट्रा-घन (द्वितीय)-au (iii) और BSA के अवशोषक स्पेक्ट्रा-au (iii) और BSA-घन (द्वितीय) एक ही संकेत है कि सोने और तांबे नहीं कर रहे है Asp-अंश (चित्रा 3सी) पर एक ही बाइंडिंग साइट के लिए प्रतिस्पर्धा । एनआई (द्वितीय) Asp-टुकड़ा करने के लिए कमजोर से बांधता है और इसलिए Au (III) एनआई के साथ प्रतिस्पर्धा (द्वितीय) सोने के रूप में जोड़ा जाता है; यह देखा गया है कि BSA-ni (ii) और BSA-au (iii) के अवशोषण स्पेक्ट्रा BSA-ni (ii)-au (iii) (चित्रा 3F) के साथ सहसंबंधी नहीं है । इसके बाद के संस्करण प्रोटोकॉल के माध्यम से, एक दिखा सकते है कैसे Au (III) BSA के ज्ञात बंधन साइट को बांधता है । इस तकनीक भी 11 से ऊपर पीएच के समायोजन की आवश्यकता है और तकनीक BSA को दो बार एकाग्रता जोड़कर संशोधित है, लेकिन आधी मात्रा में, इस प्रकार यह कम BSA पर प्रदर्शन किया जाना चाहिए करने के लिए प्रोटीन अनुरूपता बनाए रखने के अनुपात ।

BSA में Cysteine अवशेषों को संशोधित कर आगे Au बाइंडिंग साइट्स को स्पष्ट कर सकते हैं । सोना28 thiol के लिए एक उच्च समानता है और BSA (Cys34)21पर एक सतह सुलभ thiol के पास जाना जाता है । इस thiol के अवरुद्ध होने से माध्यमिक बाइंडिंग स्थलों का आविर्भाव हो सकता है । इस cysteine के अवरुद्ध बाहर किया जाता है au (iii) के नमूने के अलावा करने से पहले और BSA के एक बदल प्रतिदीप्ति पैटर्न से पता चलता है-Au (iii), एक संभव हस्तांतरण लाल प्रतिदीप्ति (चित्रा 4a) के तंत्र में शामिल मार्ग का संकेत है । यह thiol अवरुद्ध एजेंट जोड़ने के लिए आवश्यक है, इस मामले में NEM, एक तटस्थ पीएच में । सभी डाइसल्फ़ाइड बांड और उनके नि: शुल्क thiol समूहों के बाद कैपिंग से सट कोई लाल प्रतिदीप्ति (चित्रा 4B) का पता चलता है । इन परिणामों से संकेत मिलता है कि एक डाइसल्फ़ाइड बांड एक लाल फ्लोरोसेंट जटिल उत्पादन की आवश्यकता है ।

हम विभिंन प्रोटोकॉल में प्रदर्शन किया है, स्पेक्ट्रोस्कोपी और प्रोटीन रसायन विज्ञान तकनीक, एक विधि के उपयोग के माध्यम से BSA-Au (III) परिसरों का विश्लेषण । प्रोटीन रसायन विज्ञान तकनीक यहां प्रस्तुत व्यापक रूप से प्रोटीन आधारित नैनो-सामग्री अनुसंधान14में नहीं किया गया है । इन तकनीकों को आम तौर पर लागू किया जा सकता है और धातु बाध्यकारी प्रक्रिया और अंय में संभव बाध्यकारी साइटों को समझने के लिए मूल्यवान हो, नहीं तो सब, प्रोटीन जैसे trypsin, पेप्सिन, lysozyme, और कैल्सीटोनिन17,29। प्रोटीन गतिशील हैं, फिर भी बहुत सटीक "नैनो-सामग्री" । धातु बंधन साइट की विस्तृत समझ के संभावित अनुप्रयोगों के असंख्य के साथ नियंत्रित ऑप्टिकल संपत्तियों के साथ नए प्रोटीन आधारित सामग्री की ओर मार्ग प्रशस्त सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

एसई ड्यूक बंदोबस्ती विशेष पहल कोष, वेल्स फारगो फंड, PhRMA फाउंडेशन, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से उत्तरी कैरोलिना, Charlotte विश्वविद्यालय से स्टार्टअप कोष से समर्थन स्वीकार करता है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine Serum Albumin (BSA), 96% Sigma-Aldrich A5611
gold (III) chloride trihydrate, 99.9% Sigma-Aldrich 520918
Copper (II) chloride dihydrate, 99.999% Sigma-Aldrich 459097
Nickel (II) chloride hexahydrate, 99.9% Sigma-Aldrich 654507
N-Ethylmaleimide (NEM), >99.0% Sigma-Aldrich 4259
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP), >98.0% Sigma-Aldrich C4706
Sodium hydroxide, >98.0% Sigma-Aldrich S8045
Urea, 99.5% Chem-Implex Int'l 30142
Phospate buffered saline (PBS) Corning MT21040CV
Ammonium bicarbonate, 99.5% Sigma-Aldrich 9830

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References

  1. Xie, J., Zheng, Y., Ying, J. Y. Protein-Directed Synthesis of Highly Fluorescent Gold Nanoparticles. Journal of the American Chemical Society. 131, 888-889 (2009).
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रसायन विज्ञान अंक १३८ संश्लेषण गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन BSA सोना Au प्रतिदीप्ति पीएच अनुरूपता
गोल्ड (III) के बंधन द्वारा गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन के विभिन्न संरचनाओं में Luminophore गठन
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Dixon, J. M., Egusa, S. Luminophore… More

Dixon, J. M., Egusa, S. Luminophore Formation in Various Conformations of Bovine Serum Albumin by Binding of Gold(III). J. Vis. Exp. (138), e58141, doi:10.3791/58141 (2018).

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