Genereren van Homo- en Heterografts tussen watermeloen en fles pompoen voor de studie van koude-responsieve MicroRNAs
Summary
Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor het efficiënt maken van homo- en heterografts tussen watermeloen en fles kalebas, naast de methoden van bemonstering van weefsel, generatie van de gegevens en data-analyse, voor het onderzoek van koude-responsieve microRNAs.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) zijn endogene klein niet-coderende RNAs van ongeveer 20-24 nt, bekend om te spelen een belangrijke rol in de ontwikkeling van planten en aanpassing. Er is een accumulatie bewijsmateriaal waaruit blijkt dat de uitingen van bepaalde miRNAs worden gewijzigd wanneer enten, een vaak gebruikt door landbouwers voor het verbeteren van gewas tolerantie voor biotische en abiotische stress landbouwpraktijken. Fles kalebas is een inherent klimaat-veerkrachtig gewas in vergelijking met vele andere belangrijke Cucurbitaceae met niet, met inbegrip van watermeloen, waardoor het een van de meest gebruikte onderstammen voor het laatste. De recente vooruitgang van high-throughput sequencing technologieën heeft grote kansen te onderzoeken van koude-responsieve miRNAs en hun bijdragen aan heterograft voordelen; Toch zijn voldoende experimentele procedures een voorwaarde voor dit doel. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor het efficiënt genereren van homo- en heterografts tussen de koud-gevoelige watermeloen en de koude-tolerante fles kalebas, naast weefsel bemonsteringswijzen, gegevens generatie, en data-analyse. De gepresenteerde methoden zijn ook handig voor andere systemen met plant-enten, te ondervragen miRNA verordeningen onder verschillende milieu benadrukt, zoals warmte, droogte en zoutgehalte.
Introduction
Enten is lang werkzaam als een agrarische techniek om plantaardige productie en tolerantie aan biotische en abiotische stress1,2,3te verbeteren. In heterografting systemen, kunnen elite wijnstokdelen onder de grond betere opname van water en voedingsstoffen voor planten, versterken van weerstand tegen ziekteverwekkers van de bodem en beperken van de negatieve effecten van metalen toxiciteit4,5, waarin de protheses een verbeterde kan verlenen kracht van de groei en verhoogde tolerantie voor het milieu benadrukt. In veel gevallen, heterografting kan ook gevolgen hebben vrucht kwaliteiten in tuinbouw planten, wat leidt tot verbeterde fruit smaak en meer inhoud van gezondheidsgerelateerde verbindingen6,7. Het is gebleken dat de interlokale overdracht van fytohormonen, RNAs peptides en proteïnen tussen de onderstam en de scion is een fundamenteel mechanisme moduleren van de groei en ontwikkeling herprogrammering van scion planten8,9 ,10. Enten wijd gebruikt in studies van interlokale signalering en vervoer in verband met milieu aanpassing11. Praktijk experimenten zijn vooral krachtig voor ondubbelzinnige detectie van overdraagbare moleculen in het ontvangen van weefsel of vasculaire sap, en activering of onderdrukking van moleculaire targets te wijten aan de signaal overdracht12.
Non-codering RNAs, een grote klasse van RNA die uitoefenen van belangrijke regelgevende functies in cellen, zijn bij het spelen een rol bij het vergemakkelijken van de aanpassing van de plant aan de abiotische stress13gemeld. miRNAs zijn endogene klein niet-coderende RNAs van ongeveer 20-24 nt. Studies is gebleken dat de regelgevende rol van miRNAs in verschillende aspecten van de activiteiten van de plant, zulke zoals groei, schieten lateraal wortel vorming14,15,16, opname van voedingsstoffen, sulfaat metabolisme en homeostase17en reacties op biotische en abiotische stress18. Onlangs, is de uitdrukking van miRNAs en hun doelgenen hielden verband met zout stress tolerantie in heterografted komkommer zaailingen19. In de intervariety transplantaties van druivenmost, de reacties van miRNA expressie aan droogte stress bleken genotype-afhankelijke20.
De snelle ontwikkeling en het verminderen van de kosten van high-throughput sequencing technologie hebben een grote kans voor de studie van miRNA verordeningen in landbouwkundige planten verstrekt. Watermeloen (Citrullus lanatus [Thunb.] Mansf.), een belangrijk cucurbit gewas geteeld over de hele wereld, is gevoelig voor lage temperaturen. Fles kalebas (Lagenaria siceraria [Molina] Standl.) is een klimaat-veerkrachtiger cucurbit vaak door boeren gebruikt om te enten met watermeloen. Het primaire doel van de huidige studie is om een standaard, efficiënt, en handige methode voor het maken van heterografts tussen watermeloen (Citrullus lanatus [Thunb.] Mansf.) en fles kalebas (Lagenaria siceraria [Molina] Standl). Dit protocol biedt ook een gedetailleerde regeling van experimentele en analytische procedures voor de studie van het Reglement van miRNA expressies na enten, die is handig voor het openbaren van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de voordelen van de heterografting.
De materialen van de plant gebruikt in deze studie omvatten de cultivar watermeloen en de fles kalebas landras. Watermeloen cultivar is een commerciële cultivar met hoge opbrengst maar gevoelig voor lage temperaturen. Fles kalebas landras is een populaire onderstam voor enten met watermeloen, komkommer en fles kalebas, vanwege zijn uitstekende tolerantie van lage temperaturen21.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit protocol beschreven we in detail een zeer efficiënte en reproduceerbare methode om homo- en heterografts tussen watermeloen en fles kalebas te maken. Deze methode, waarvoor geen specifieke apparatuur, is zeer eenvoudig te bedienen en heeft doorgaans een zeer hoge overlevingskansen enten. De methode kan ook worden gebruikt om de protheses voor andere Cucurbitaceae met niet, zoals tussen watermeloen, komkommer en pompoen.
Het is vermeldenswaard dat de relatieve grootte (leeftijd) van de …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de nationale Natural Science Foundation van China (31772191), het onderzoeksproject voor algemeen belang in de provincie Zhejiang (2017C 32027), de sleutel Science Project van de plantenveredeling in Zhejiang (2016C 02051) en het nationale programma voor de steun van Top-notch jonge Professionals (P.X.).
Materials
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| RNA-free DNase I | Takara | D2270A | |
| Truseq Small RNA sample prep Kit | Illumina | RS-200-0012 | |
| 2100 Bionalyser | Agilent | 5067 | |
| DNA Polymerase | Thermo Fisher Scientific | F530S | |
| UEA sRNA workbench 2.4-plant version (software) | NA | NA | http://srna-workbench.cmp.uea.ac.uk/ |
| Rfam 11.0 database (website) | NA | NA | http://rfam.janelia.org |
| miRBase 22.0 (website) | NA | NA | http://www.mirbase.org/ |
| MIREAP(software) | NA | NA | https://sourceforge.net/projects/mireap/ |
| TargetFinder (software) | NA | NA | http://targetfinder.org/ |
References
- Schwarz, D., Rouphael, Y., Colla, G., Venema, J. H. Grafting as a tool to improve tolerance of vegetables to abiotic stresses: Thermal stress, water stress and organic pollutants. Scientia Horticulturae. 127, 162-171 (2010).
- Li, Y., et al. Mechanisms of tolerance differences in cucumber seedlings grafted on rootstocks with different tolerance to low temperature and weak light stresses. Turkish Journal of Botany. 39 (4), 606-614 (2015).
- Li, C. H., Li, Y. S., Bai, L. Q., He, C. X., Yu, X. C. Dynamic Expression of miRNAs and Their Targets in the Response to Drought Stress of Grafted Cucumber Seedlings. Horticultural Plant Journal. 2 (1), 41-49 (2016).
- Rouphael, Y., Cardarelli, M., Colla, G., Rea, E. Yield, mineral composition, water relations, and water use efficiency of grafted mini-watermelon plants under deficit irrigation. HortScience. 43 (3), 730-736 (2008).
- Savvas, D., et al. Interactive effects of grafting and manganese supply on growth, yield, and nutrient uptake by tomato. HortScience. 44 (7), 1978-1982 (2009).
- Aloni, B., Cohen, R., Karni, L., Aktas, H., Edelstein, M. Hormonal signaling in rootstock-scion interactions. Scientia Horticulturae. 127, 119-126 (2010).
- Rouphael, Y., Caradrelli, M., Rea, E., Colla, G. Improving melon and cucumber photosynthetic activity, mineral composition, and growth performance under salinity stress by grafting onto Cucurbita hybrid rootstocks. Photosynthetica. 50 (2), 180-188 (2012).
- Louws, F. J., Rivard, C. L., Kubota, C. Grafting fruiting vegetables to manage soilborne pathogens, foliar pathogens, arthropods and weeds. Scientia Horticulturae. 127 (2), 127-146 (2010).
- Asins, M. J., et al. Genetic analysis of rootstock-mediated nitrogen (N) uptake and root-to-shoot signalling at contrasting N availabilities in tomato. Plant Science. 263, 94-106 (2017).
- Yin, L. K., et al. Role of protective enzymes in tomato rootstocks to resist root knot nematodes. Acta Horticulturae. 1086 (1086), 213-218 (2015).
- Gaion, L. A., Carvalho, R. F. Long-Distance Signaling: what grafting has revealed?. Journal of Plant Growth Regulation. 37 (2), 694-704 (2018).
- Turnbull, C. G., Hennig, L., Köhler, C. Grafting as a research tool. Plant Developmental Biology. , 11-26 (2010).
- Li, C., et al. Grafting-responsive miRNAs in cucumber and pumpkin seedlings identified by high-throughput sequencing at whole genome level. Physiologia Plantarum. 151 (4), 406-422 (2014).
- Lakhotia, N., et al. Identification and characterization of miRNAome in root, stem, leaf and tuber developmental stages of potato (Solanum tuberosum L.) by high-throughput sequencing. BMC Plant Biology. 14 (1), 6 (2014).
- Jones-Rhoades, M. W., Bartel, D. P., Bartel, B. MicroRNAs and their regulatory roles in plants. Annual Review of Plant Biology. 57, 19-53 (2006).
- Puzey, J. R., Kramer, E. M. Identification of conserved Aquilegia coerulea microRNAs and their targets. Genetic. 448 (1), 46-56 (2009).
- Matthewman, C. A., et al. miR395 is a general component of the sulfate assimilation regulatory network in Arabidopsis. FEBS Letters. 586 (19), 3242-3248 (2012).
- Ali, E. M., et al. Transmission of RNA silencing signal through grafting confers virus resistance from transgenically silenced tobacco rootstocks to non-transgenic tomato and tobacco scions. Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology. 25 (3), 245-252 (2016).
- Li, Y. S., Li, C. H., Bai, L. Q., He, C. X., Yu, X. C. MicroRNA and target gene responses to salt stress in grafted cucumber seedlings. Acta Physiologiae Plantarum. 38 (2), 1-12 (2016).
- Pagliarani, C., et al. The accumulation of miRNAs differentially modulated by drought stress is affected by grafting in grapevine. Plant Physiology. 173 (4), 2180-2195 (2017).
- Liu, N., Yang, J. H., Guo, S. G., Xu, Y., Zhang, M. F. Genome-wide identification and comparative analysis of conserved and novel microRNAs in grafted watermelon by high-throughput sequencing. PLoS One. 8 (2), e57359 (2013).
- Song, G. Development of 2JC-350 automatic grafting machine with cut grafting method for vegetable seedling. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering. 22 (12), 103-106 (2006).
- Kumar, D., et al. Uncovering leaf rust responsive miRNAs in wheat (triticum aestivum l.) using high-throughput sequencing and prediction of their targets through degradome analysis. Planta. 245 (1), 1-22 (2016).
- Kohli, D., et al. Identification and characterization of wilt and salt stress-responsive microRNAs in chickpea through high-throughput sequencing. PLoS One. 9 (10), e108851 (2014).
- Salzberg, S. L. Computational challenges in next-generation genomics. International Conference on Scientific and Statistical Database Management. ACM. 2, (2013).
- Guo, S. G., et al. The draft genome of watermelon (Citrullus lanatus) and resequencing of 20 diverse accessions. Nature Genetics. 45, 51-58 (2013).
- Wang, Y., et al. Gourdbase: a genome-centered multi-omics database for the bottle gourd (lagenaria siceraria), an economically important cucurbit crop. Scientific Reports. 8 (1), 306 (2018).
- Wang, X. F., Liu, X. S. Systematic Curation of miRBase Annotation Using Integrated Small RNA High-Throughput Sequencing Data for C. elegans and Drosophila. Frontiers in Genetics. 2, 25 (2011).
- Bo, X. C., Wang, S. Q. TargetFinder: a software for antisense oligonucleotide target site selection based on MAST and secondary structures of target mRNA. Bioinformatics. 21 (8), 1401-1402 (2005).
- . GOATOOLS: Tools for Gene Ontology Available from: https://doi.org/10.5281/zenodo.31628 (2015)
- Wang, L. P., Li, G. J., Wu, X. H., Xu, P. Comparative proteomic analyses provide novel insights into the effects of grafting wound and hetero-grafting per se on bottle gourd. Scientia Horticulturae. 200 (8), 1-6 (2016).
