יצירת הומו - ו Heterografts בין אבטיח דלעת הבקבוק לחקר מיקרו Rna קר-תגובה
Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט להכנת ביעילות הומו – ו heterografts בין אבטיח דלעת הבקבוק, בנוסף לשיטות של דגימה רקמה, דור נתונים, ניתוח נתונים, עבור החקירה של הקור מגיבים מיקרו Rna.
Abstract
Rna (miRNAs) הם אנדוגני קטן ללא קידוד RNAs של בערך 20-24 nt, ידוע תפקיד חשוב ב מפעל פיתוח והתאמה. ראיות המצטבר מראה כי הביטויים של miRNAs מסוימים הם שינו בעת השתלת עור, תרגול החקלאי בשימוש נפוץ על ידי חקלאים לשיפור יבול עמידות בפני לחצים ביוטיים, והאביוטיים. דלעת הבקבוק הוא חיתוך גמיש מטבעו האקלים לעומת רבים אחרים הגדולות cucurbits, לרבות אבטיח, טיוח זה לאחד כנות הנפוצה ביותר עבור האחרון. לקידום טכנולוגיות רצף תפוקה גבוהה האחרונות סיפקה הזדמנויות גדולות לחקור miRNAs קר מגיב ותרומתם יתרונות heterograft; ובכל זאת, שגרות ניסיוני נאותה הן תנאי הכרחי למטרה זו. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט ליצירת ביעילות הומו – ו heterografts בין אבטיח קר, רגישים את הדלעת בקבוק קר-סובלנית, בנוסף לשיטות של דגימה רקמה, דור נתונים, ניתוח נתונים. השיטות הציג שימושיים גם למערכות אחרות מפעל הרכבה, לחקור miRNA תקנות תחת לחצים סביבתיים שונים, כגון חום, יובש, מליחות.
Introduction
הרכבה זמן כבר מועסקים כ טכניקה חקלאית כדי לשפר את ייצור יבול, עמידות בפני לחצים ביוטיים, והאביוטיים1,2,3. במערכות heterografting, כנות האליטה יכול לשפר את ספיגת מים וחומרים מזינים של צמחים לחיזוק עמידות בפני פתוגנים בקרקע, להגביל את ההשפעות השליליות של מתכות רעילות4,5, אשר עשויה לתת השתלים משופרת מרץ צמיחה, עמידות מוגברת בפני לחצים סביבתיים. במקרים רבים, heterografting יכול גם להשפיע איכויות פרי בצמחים הגננות, שמוביל בטעם פירות משופרת ותכניה מוגברת תרכובות הקשורים לבריאות6,7. זה נמצא כי העברת הבינעירוניים phytohormones, RNAs, פפטידים וחלבונים בין את כנות הנצר הוא מנגנון בסיסי להתכוונן את הצמיחה ואת פיתוח התכנות של נצר צמחים8,9 ,10. הרכבה כבר בשימוש נרחב במחקרים של איתות הבינעירוניים ואמצעי התחבורה ביחס הסתגלות סביבתית11. ניסויים הרכבה חזקים במיוחד לצורך זיהוי ברורה וחד משמעית של מולקולות המשודרת בקבלת רקמות או sap כלי הדם, ואת ההפעלה או דיכוי של מטרות מולקולריות עקב אות שידור12.
Non-קידוד RNAs, מחזור גדול של RNA להפעיל פונקציות חשובות תקינה בתאים, דווחו לשחק תפקיד בקידום הצמח ההסתגלות מתח והאביוטיים13. miRNAs הם אנדוגני קטן ללא קידוד RNAs של בערך 20-24 nt. מחקרים גילו תפקיד miRNAs בהיבטים שונים של הצמח פעילות תקינה, כגון כמו יורה צמיחה, לרוחב שורש היווצרות14,15,16, ספיגת התזונתי, סולפט מטבוליזם הומאוסטזיס17, ואת התגובות ביוטיים, והאביוטיים להדגיש18. לאחרונה, הביטוי של miRNAs ואת הגנים היעד שלהם היו קשורות מלח מתח סובלנות שתילי מלפפון heterografted19. השתלים intervariety ענבים, התגובות של miRNA ביטוי למתח הבצורת נמצאו תלויי-גנוטיפ20.
ההתפתחות המהירה של הפחתת העלות של הטכנולוגיה תפוקה גבוהה רצף סיפקו הזדמנות גדולה עבור המחקר לתקנות miRNA בצמחים אגרונומיים תחת פיקוח הדוק. אבטיח (אבטיח צמיר [Thunb]. Mansf.), של cucurbit חשוב הגידול ברחבי העולם, היא חשופה בטמפרטורות נמוכות. דלעת הבקבוק (Lagenaria siceraria [מולינה] Standl..) כאכארביט יותר. האקלים-גמישים בשימוש נפוץ על ידי חקלאים כדי להשתיל עם אבטיח. המטרה העיקרית של המחקר הנוכחי הוא לבסס סטנדרט, יעיל, ושיטת נוח להכנת heterografts בין אבטיח (אבטיח צמיר [Thunb]. Mansf.) דלעת הבקבוק (StandlLagenaria siceraria [מולינה]). פרוטוקול זה מספק גם ערכה ניסוי מפורט נהלים אנליטיים לחקר ברגולציה של ביטויים miRNA בעקבות השתלת עור, אשר הוא שימושי עבור חשיפת המנגנונים heterografting יתרונות.
החומרים הצמח השתמשו במחקר זה כוללים את הזן אבטיח את צמחי תרבות מסורתיים דלעת הבקבוק. לדבורי אבטיח הוא זנים מסחריים עם תשואה גבוהה אבל רגישים בטמפרטורה נמוכה. צמחי תרבות מסורתיים דלעת הבקבוק הוא ככנה פופולרי עבור הרכבה עם אבטיח, מלפפון, דלעת, עקב שלה עמידות מעולה של טמפרטורות נמוכות21.
Protocol
Representative Results
Discussion
ב פרוטוקול זה, אנחנו תיאר בפירוט שיטה יעילה מאוד לשחזור כדי להפוך הומו – heterografts בין אבטיח דלעת הבקבוק. שיטה זו, הדורשים אין ציוד ספציפי, קל מאוד לתפעול וכוללת בדרך כלל שיעור הישרדות מאוד גבוהה של הרכבה. השיטה גם ניתן לבצע שתלים לקבלת cucurbits אחרים, כגון בין אבטיח, מלפפון, דלעת.
רא?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי נבחרת מדעי הטבע קרן של סין (31772191), פרויקט מחקר ענין לציבור, ג’ה-ג’יאנג (2017C 32027), מפתח המדע הפרוייקט של נעשו בג’ה-ג’יאנג (2016C 02051), התכנית הלאומית התמיכה של אנשי עסקים צעירים מעולה (אל P.X.).
Materials
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| RNA-free DNase I | Takara | D2270A | |
| Truseq Small RNA sample prep Kit | Illumina | RS-200-0012 | |
| 2100 Bionalyser | Agilent | 5067 | |
| DNA Polymerase | Thermo Fisher Scientific | F530S | |
| UEA sRNA workbench 2.4-plant version (software) | NA | NA | http://srna-workbench.cmp.uea.ac.uk/ |
| Rfam 11.0 database (website) | NA | NA | http://rfam.janelia.org |
| miRBase 22.0 (website) | NA | NA | http://www.mirbase.org/ |
| MIREAP(software) | NA | NA | https://sourceforge.net/projects/mireap/ |
| TargetFinder (software) | NA | NA | http://targetfinder.org/ |
References
- Schwarz, D., Rouphael, Y., Colla, G., Venema, J. H. Grafting as a tool to improve tolerance of vegetables to abiotic stresses: Thermal stress, water stress and organic pollutants. Scientia Horticulturae. 127, 162-171 (2010).
- Li, Y., et al. Mechanisms of tolerance differences in cucumber seedlings grafted on rootstocks with different tolerance to low temperature and weak light stresses. Turkish Journal of Botany. 39 (4), 606-614 (2015).
- Li, C. H., Li, Y. S., Bai, L. Q., He, C. X., Yu, X. C. Dynamic Expression of miRNAs and Their Targets in the Response to Drought Stress of Grafted Cucumber Seedlings. Horticultural Plant Journal. 2 (1), 41-49 (2016).
- Rouphael, Y., Cardarelli, M., Colla, G., Rea, E. Yield, mineral composition, water relations, and water use efficiency of grafted mini-watermelon plants under deficit irrigation. HortScience. 43 (3), 730-736 (2008).
- Savvas, D., et al. Interactive effects of grafting and manganese supply on growth, yield, and nutrient uptake by tomato. HortScience. 44 (7), 1978-1982 (2009).
- Aloni, B., Cohen, R., Karni, L., Aktas, H., Edelstein, M. Hormonal signaling in rootstock-scion interactions. Scientia Horticulturae. 127, 119-126 (2010).
- Rouphael, Y., Caradrelli, M., Rea, E., Colla, G. Improving melon and cucumber photosynthetic activity, mineral composition, and growth performance under salinity stress by grafting onto Cucurbita hybrid rootstocks. Photosynthetica. 50 (2), 180-188 (2012).
- Louws, F. J., Rivard, C. L., Kubota, C. Grafting fruiting vegetables to manage soilborne pathogens, foliar pathogens, arthropods and weeds. Scientia Horticulturae. 127 (2), 127-146 (2010).
- Asins, M. J., et al. Genetic analysis of rootstock-mediated nitrogen (N) uptake and root-to-shoot signalling at contrasting N availabilities in tomato. Plant Science. 263, 94-106 (2017).
- Yin, L. K., et al. Role of protective enzymes in tomato rootstocks to resist root knot nematodes. Acta Horticulturae. 1086 (1086), 213-218 (2015).
- Gaion, L. A., Carvalho, R. F. Long-Distance Signaling: what grafting has revealed?. Journal of Plant Growth Regulation. 37 (2), 694-704 (2018).
- Turnbull, C. G., Hennig, L., Köhler, C. Grafting as a research tool. Plant Developmental Biology. , 11-26 (2010).
- Li, C., et al. Grafting-responsive miRNAs in cucumber and pumpkin seedlings identified by high-throughput sequencing at whole genome level. Physiologia Plantarum. 151 (4), 406-422 (2014).
- Lakhotia, N., et al. Identification and characterization of miRNAome in root, stem, leaf and tuber developmental stages of potato (Solanum tuberosum L.) by high-throughput sequencing. BMC Plant Biology. 14 (1), 6 (2014).
- Jones-Rhoades, M. W., Bartel, D. P., Bartel, B. MicroRNAs and their regulatory roles in plants. Annual Review of Plant Biology. 57, 19-53 (2006).
- Puzey, J. R., Kramer, E. M. Identification of conserved Aquilegia coerulea microRNAs and their targets. Genetic. 448 (1), 46-56 (2009).
- Matthewman, C. A., et al. miR395 is a general component of the sulfate assimilation regulatory network in Arabidopsis. FEBS Letters. 586 (19), 3242-3248 (2012).
- Ali, E. M., et al. Transmission of RNA silencing signal through grafting confers virus resistance from transgenically silenced tobacco rootstocks to non-transgenic tomato and tobacco scions. Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology. 25 (3), 245-252 (2016).
- Li, Y. S., Li, C. H., Bai, L. Q., He, C. X., Yu, X. C. MicroRNA and target gene responses to salt stress in grafted cucumber seedlings. Acta Physiologiae Plantarum. 38 (2), 1-12 (2016).
- Pagliarani, C., et al. The accumulation of miRNAs differentially modulated by drought stress is affected by grafting in grapevine. Plant Physiology. 173 (4), 2180-2195 (2017).
- Liu, N., Yang, J. H., Guo, S. G., Xu, Y., Zhang, M. F. Genome-wide identification and comparative analysis of conserved and novel microRNAs in grafted watermelon by high-throughput sequencing. PLoS One. 8 (2), e57359 (2013).
- Song, G. Development of 2JC-350 automatic grafting machine with cut grafting method for vegetable seedling. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering. 22 (12), 103-106 (2006).
- Kumar, D., et al. Uncovering leaf rust responsive miRNAs in wheat (triticum aestivum l.) using high-throughput sequencing and prediction of their targets through degradome analysis. Planta. 245 (1), 1-22 (2016).
- Kohli, D., et al. Identification and characterization of wilt and salt stress-responsive microRNAs in chickpea through high-throughput sequencing. PLoS One. 9 (10), e108851 (2014).
- Salzberg, S. L. Computational challenges in next-generation genomics. International Conference on Scientific and Statistical Database Management. ACM. 2, (2013).
- Guo, S. G., et al. The draft genome of watermelon (Citrullus lanatus) and resequencing of 20 diverse accessions. Nature Genetics. 45, 51-58 (2013).
- Wang, Y., et al. Gourdbase: a genome-centered multi-omics database for the bottle gourd (lagenaria siceraria), an economically important cucurbit crop. Scientific Reports. 8 (1), 306 (2018).
- Wang, X. F., Liu, X. S. Systematic Curation of miRBase Annotation Using Integrated Small RNA High-Throughput Sequencing Data for C. elegans and Drosophila. Frontiers in Genetics. 2, 25 (2011).
- Bo, X. C., Wang, S. Q. TargetFinder: a software for antisense oligonucleotide target site selection based on MAST and secondary structures of target mRNA. Bioinformatics. 21 (8), 1401-1402 (2005).
- . GOATOOLS: Tools for Gene Ontology Available from: https://doi.org/10.5281/zenodo.31628 (2015)
- Wang, L. P., Li, G. J., Wu, X. H., Xu, P. Comparative proteomic analyses provide novel insights into the effects of grafting wound and hetero-grafting per se on bottle gourd. Scientia Horticulturae. 200 (8), 1-6 (2016).
