Geração de Homo - e Heterografts entre melancia e cabaça para o estudo de MicroRNAs frio-responsivo
Summary
Aqui nós apresentamos um protocolo detalhado para eficientemente tornando homo – e heterografts entre melancia e cabaça, além de métodos de amostragem de tecido, geração de dados e análise de dados, para a investigação de microRNAs frio-responsivo.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) são endógenos pequeno não-codificantes RNAs de cerca 20-24 nt, conhecida por desempenhar um papel importante no desenvolvimento da planta e adaptação. Há uma acumular evidências mostrando que as expressões de determinados miRNAs são alteradas quando o enxerto, uma prática agrícola comumente utilizada pelos agricultores para melhorar a tolerância das culturas a estresses bióticos e abióticos. Cabaça é uma colheita inerentemente resistentes às alterações climáticas, em comparação com muitos outras abóboras grandes, incluindo melancia, tornando-o um dos porta-enxertos mais utilizados para o último. O recente avanço das tecnologias de sequenciamento de alto rendimento tem proporcionado grandes oportunidades para investigar os miRNAs frio-responsivo e suas contribuições para vantagens heterotópico; ainda, os procedimentos experimentais adequados são um pré-requisito para esta finalidade. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para a geração eficiente de homo e heterografts entre o frio-suscetíveis de melancia e a cabaça tolerante ao frio, além de métodos de amostragem de tecido, geração de dados e análise de dados. Os métodos apresentados são também úteis para outros sistemas de planta-enxerto, para interrogar miRNA regulamentos sob vários estresses ambientais, tais como calor, seca e salinidade.
Introduction
Enxertia tempo foi empregado como uma técnica agrícola para melhorar a produção agrícola e tolerância a estresses bióticos e abióticos1,2,3. Em sistemas de heterografting, porta-enxertos elite podem aumentar a absorção de água e nutrientes das plantas, reforçar a resistência a patógenos de solo e limitar os efeitos negativos da toxicidade do metal4,5, que podem conferir os enxertos uma reforçada vigor de crescimento e maior tolerância a estresses ambientais. Em muitos casos, heterografting também pode afetar as qualidades de frutos em plantas hortícolas, levando ao sabor da fruta melhorada e maior conteúdo de compostos relacionados com a saúde6,7. Verificou-se que a transferência de longa distância de fitohormônios, RNAs, peptídeos e proteínas entre o porta-enxerto e o scion é um mecanismo fundamental de modulação do crescimento e desenvolvimento reprogramação de scion plantas8,9 ,10. Enxertia tem sido amplamente utilizada em estudos de longa distância de sinalização e transporte em relação à adaptação ambiental11. Experimentos de enxerto são especialmente poderosos para a deteção inequívoca de moléculas transmitidas em tecido ou seiva vascular e ativação ou supressão de alvos moleculares devido ao sinal de transmissão12a receber.
RNAs não-codificantes, uma grande classe de RNA que exercem funções reguladoras importantes nas células, têm sido relatados para desempenhar um papel em facilitar a adaptação da planta ao estresse abiótico13. os miRNAs são endógenos pequeno não-codificantes RNAs de cerca 20-24 nt. estudos revelaram o papel regulador dos miRNAs em vários aspectos das atividades da planta, tais como atirar em crescimento, lateral raiz formação14,15,16, absorção de nutrientes, metabolismo de sulfato e homeostase17e respostas bióticos e abióticos stress18. Recentemente, a expressão de miRNAs e seus genes-alvo foram relacionados com tolerância de estresse em mudas de pepino heterografted19de sal. Nos enxertos intervariety de uva, as respostas de miRNA expressão ao estresse de seca foram encontradas para ser dependente do genótipo20.
O desenvolvimento rápido e diminuindo o custo da tecnologia de sequenciamento do elevado-throughput forneceram uma grande oportunidade para o estudo dos regulamentos de miRNA em plantas agrárias. Melancia (Citrullus lanatus [Thunb.] Mansf.), uma colheita importante Cucurbitácea crescido em todo o mundo, é suscetível a baixas temperaturas. Cabaça (Lagenaria siceraria [Molina] Cuatrec.) é uma Cucurbitácea mais clima-resistente comumente usada pelos agricultores para enxertar com melancia. O objetivo principal do estudo atual é estabelecer um padrão, eficiente e um método conveniente para fazer heterografts entre melancia (Citrullus lanatus [Thunb.] Mansf.) e cabaça (Lagenaria siceraria [Molina] Cuatrec). Este protocolo também fornece um esquema experimental detalhado e procedimentos analíticos para o estudo do Regulamento de miRNA expressões após a enxertia, que é útil para revelar os mecanismos subjacentes vantagens heterografting.
Os materiais de planta utilizados neste estudo incluem a cultivar de melancia e a cabaça landrace. Cultivar de melancia é um cultivar comercial com alto rendimento, mas suscetível a baixas temperaturas. Cabaça landrace é um popular porta-enxertos para enxertia com melancia, pepino e cabaça, devido à sua excelente tolerância de temperaturas baixas21.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste protocolo, descrevemos em detalhe um método altamente eficiente e reprodutível para tornar homo e heterografts entre melancia e cabaça. Esse método, que exige nenhum equipamento específico, é muito fácil de operar e normalmente tem uma taxa de sobrevivência muito alta de enxertia. O método também pode ser usado para fazer enxertos para outras abóboras, tais como entre melancia, pepino e abóbora.
É interessante notar que o tamanho relativo (idade) do porta-enxerto e descenden…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de ciências naturais da China (31772191), o projeto de pesquisa para o interesse público na província de Zhejiang (2017C 32027), a chave de ciência projeto de melhoramento de plantas em Zhejiang (2016C 02051) e o programa nacional de o apoio de top-notch jovens profissionais (para lojas).
Materials
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| RNA-free DNase I | Takara | D2270A | |
| Truseq Small RNA sample prep Kit | Illumina | RS-200-0012 | |
| 2100 Bionalyser | Agilent | 5067 | |
| DNA Polymerase | Thermo Fisher Scientific | F530S | |
| UEA sRNA workbench 2.4-plant version (software) | NA | NA | http://srna-workbench.cmp.uea.ac.uk/ |
| Rfam 11.0 database (website) | NA | NA | http://rfam.janelia.org |
| miRBase 22.0 (website) | NA | NA | http://www.mirbase.org/ |
| MIREAP(software) | NA | NA | https://sourceforge.net/projects/mireap/ |
| TargetFinder (software) | NA | NA | http://targetfinder.org/ |
References
- Schwarz, D., Rouphael, Y., Colla, G., Venema, J. H. Grafting as a tool to improve tolerance of vegetables to abiotic stresses: Thermal stress, water stress and organic pollutants. Scientia Horticulturae. 127, 162-171 (2010).
- Li, Y., et al. Mechanisms of tolerance differences in cucumber seedlings grafted on rootstocks with different tolerance to low temperature and weak light stresses. Turkish Journal of Botany. 39 (4), 606-614 (2015).
- Li, C. H., Li, Y. S., Bai, L. Q., He, C. X., Yu, X. C. Dynamic Expression of miRNAs and Their Targets in the Response to Drought Stress of Grafted Cucumber Seedlings. Horticultural Plant Journal. 2 (1), 41-49 (2016).
- Rouphael, Y., Cardarelli, M., Colla, G., Rea, E. Yield, mineral composition, water relations, and water use efficiency of grafted mini-watermelon plants under deficit irrigation. HortScience. 43 (3), 730-736 (2008).
- Savvas, D., et al. Interactive effects of grafting and manganese supply on growth, yield, and nutrient uptake by tomato. HortScience. 44 (7), 1978-1982 (2009).
- Aloni, B., Cohen, R., Karni, L., Aktas, H., Edelstein, M. Hormonal signaling in rootstock-scion interactions. Scientia Horticulturae. 127, 119-126 (2010).
- Rouphael, Y., Caradrelli, M., Rea, E., Colla, G. Improving melon and cucumber photosynthetic activity, mineral composition, and growth performance under salinity stress by grafting onto Cucurbita hybrid rootstocks. Photosynthetica. 50 (2), 180-188 (2012).
- Louws, F. J., Rivard, C. L., Kubota, C. Grafting fruiting vegetables to manage soilborne pathogens, foliar pathogens, arthropods and weeds. Scientia Horticulturae. 127 (2), 127-146 (2010).
- Asins, M. J., et al. Genetic analysis of rootstock-mediated nitrogen (N) uptake and root-to-shoot signalling at contrasting N availabilities in tomato. Plant Science. 263, 94-106 (2017).
- Yin, L. K., et al. Role of protective enzymes in tomato rootstocks to resist root knot nematodes. Acta Horticulturae. 1086 (1086), 213-218 (2015).
- Gaion, L. A., Carvalho, R. F. Long-Distance Signaling: what grafting has revealed?. Journal of Plant Growth Regulation. 37 (2), 694-704 (2018).
- Turnbull, C. G., Hennig, L., Köhler, C. Grafting as a research tool. Plant Developmental Biology. , 11-26 (2010).
- Li, C., et al. Grafting-responsive miRNAs in cucumber and pumpkin seedlings identified by high-throughput sequencing at whole genome level. Physiologia Plantarum. 151 (4), 406-422 (2014).
- Lakhotia, N., et al. Identification and characterization of miRNAome in root, stem, leaf and tuber developmental stages of potato (Solanum tuberosum L.) by high-throughput sequencing. BMC Plant Biology. 14 (1), 6 (2014).
- Jones-Rhoades, M. W., Bartel, D. P., Bartel, B. MicroRNAs and their regulatory roles in plants. Annual Review of Plant Biology. 57, 19-53 (2006).
- Puzey, J. R., Kramer, E. M. Identification of conserved Aquilegia coerulea microRNAs and their targets. Genetic. 448 (1), 46-56 (2009).
- Matthewman, C. A., et al. miR395 is a general component of the sulfate assimilation regulatory network in Arabidopsis. FEBS Letters. 586 (19), 3242-3248 (2012).
- Ali, E. M., et al. Transmission of RNA silencing signal through grafting confers virus resistance from transgenically silenced tobacco rootstocks to non-transgenic tomato and tobacco scions. Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology. 25 (3), 245-252 (2016).
- Li, Y. S., Li, C. H., Bai, L. Q., He, C. X., Yu, X. C. MicroRNA and target gene responses to salt stress in grafted cucumber seedlings. Acta Physiologiae Plantarum. 38 (2), 1-12 (2016).
- Pagliarani, C., et al. The accumulation of miRNAs differentially modulated by drought stress is affected by grafting in grapevine. Plant Physiology. 173 (4), 2180-2195 (2017).
- Liu, N., Yang, J. H., Guo, S. G., Xu, Y., Zhang, M. F. Genome-wide identification and comparative analysis of conserved and novel microRNAs in grafted watermelon by high-throughput sequencing. PLoS One. 8 (2), e57359 (2013).
- Song, G. Development of 2JC-350 automatic grafting machine with cut grafting method for vegetable seedling. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering. 22 (12), 103-106 (2006).
- Kumar, D., et al. Uncovering leaf rust responsive miRNAs in wheat (triticum aestivum l.) using high-throughput sequencing and prediction of their targets through degradome analysis. Planta. 245 (1), 1-22 (2016).
- Kohli, D., et al. Identification and characterization of wilt and salt stress-responsive microRNAs in chickpea through high-throughput sequencing. PLoS One. 9 (10), e108851 (2014).
- Salzberg, S. L. Computational challenges in next-generation genomics. International Conference on Scientific and Statistical Database Management. ACM. 2, (2013).
- Guo, S. G., et al. The draft genome of watermelon (Citrullus lanatus) and resequencing of 20 diverse accessions. Nature Genetics. 45, 51-58 (2013).
- Wang, Y., et al. Gourdbase: a genome-centered multi-omics database for the bottle gourd (lagenaria siceraria), an economically important cucurbit crop. Scientific Reports. 8 (1), 306 (2018).
- Wang, X. F., Liu, X. S. Systematic Curation of miRBase Annotation Using Integrated Small RNA High-Throughput Sequencing Data for C. elegans and Drosophila. Frontiers in Genetics. 2, 25 (2011).
- Bo, X. C., Wang, S. Q. TargetFinder: a software for antisense oligonucleotide target site selection based on MAST and secondary structures of target mRNA. Bioinformatics. 21 (8), 1401-1402 (2005).
- . GOATOOLS: Tools for Gene Ontology Available from: https://doi.org/10.5281/zenodo.31628 (2015)
- Wang, L. P., Li, G. J., Wu, X. H., Xu, P. Comparative proteomic analyses provide novel insights into the effects of grafting wound and hetero-grafting per se on bottle gourd. Scientia Horticulturae. 200 (8), 1-6 (2016).
