Summary
Hier präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll für Homo- und Heterografts zwischen Wassermelone und Flaschenkürbis, zusätzlich zu den Methoden der Gewebe Probenahme, Datengenerierung und Datenanalyse, zur Untersuchung von Kälte auf eine geschlechtergerechte MicroRNAs effizient machen.
Abstract
Micro-RNAs (MiRNAs) sind endogen kleine nicht-kodierende RNAs von ca. 20-24 nt, eine wichtige Rolle in der Entwicklung und Anpassung spielen bekannt. Gibt es eine Anhäufung Beweise dafür, dass die Ausdrücke für bestimmte MiRNAs geändert werden, wenn aufpfropfen, eine landwirtschaftliche Praxis häufig von den Landwirten verwendet, um Ernte Toleranz gegenüber biotischen und abiotischen Stress zu verbessern. Flaschenkürbis ist ein von Natur aus klimaresistenten Ernte im Vergleich zu vielen anderen großen Kürbisgewächse, einschließlich der Wassermelone, wodurch es eines der am weitesten verbreitete Wurzelstöcke für Letzteres. Die jüngste Weiterentwicklung von Hochdurchsatz-Sequenzierung Technologien hat große Chancen, kalte reagierende MiRNAs und ihre Beiträge zum Heterograft Vorteile zu untersuchen; geeignete experimentelle Verfahren sind jedoch Voraussetzung für diesen Zweck. Hier präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll zur effizient Erzeugung von Homo- und Heterografts zwischen der Kälte-anfälligen Wassermelone und die Kälte-toleranten Flaschenkürbis, neben Gewebe Probenahmeverfahren, Datengenerierung und Datenanalyse. Die vorgestellten Methoden eignen sich auch für andere Pflanze-Pfropfen Systeme, MiRNA Vorschriften unter verschiedenen Umwelteinflüsse wie Hitze, Trockenheit und Salzgehalt zu befragen.
Introduction
Pfropfung wurde lange als eine landwirtschaftliche Technik eingesetzt, um pflanzliche Erzeugung und Toleranz gegenüber biotischen und abiotischen Stress1,2,3zu verbessern. In Heterografting Systemen können Elite Wurzelstöcke Wasser und Nährstoffe Aufnahme von Pflanzen erhöhen, verstärken Resistenz gegen pathogene Boden und Begrenzung die negativen Auswirkungen der Metall-Toxizität4,5, die die Transplantate eine erweiterte verleihen kann Wachstum, Vitalität und erhöhte Toleranz gegenüber Umweltbelastungen. In vielen Fällen kann Heterografting auch Obst Qualitäten im Gartenbau Pflanzen führt zu verbesserten Fruchtgeschmack und erhöhten Gehalt von gesundheitsbezogenen Verbindungen6,7auswirken. Es wurde festgestellt, dass der Fernverkehr Transfer von Phytohormonen, RNAs, Peptide und Proteine zwischen der Unterlage und dem Spross ein grundlegender Mechanismus modulieren das Wachstum und die Entwicklung Umprogrammierung der Spross Pflanzen8,9 ,10. Pfropfen hat in Studien der Fernverkehr Signal- und Transport in Bezug auf umweltgerechte Anpassung11verbreitet wurde. Pfropfen Experimente sind besonders leistungsfähig für eindeutige Erkennung der übertragenen Moleküle bei der Aufnahme von Gewebe oder vaskulären Sap und Aktivierung oder Unterdrückung von molekularen Zielstrukturen durch Signal Übertragung12.
Eine Rolle bei der Erleichterung der Anpassung der Anlage an abiotischem Stress13wurden nicht-kodierende RNAs, eine große Klasse von RNA, die wichtige regulatorische Funktionen in Zellen ausüben gemeldet. MiRNAs sind endogen kleine nicht-kodierende RNAs von ca. 20-24 nt. Untersuchungen ergaben die regulierende Rolle von MiRNAs in verschiedene Aspekte der Pflanze Aktivitäten, so wie Wachstum, schießen seitlich Wurzel Bildung14,15,16, Nährstoffaufnahme, Sulfat-Stoffwechsel und Homöostase17, und Antworten zu biotischen und abiotischen stress18. Vor kurzem, der Ausdruck von MiRNAs und ihre Zielgene betrafen Stresstoleranz heterografted Gurke Sämlinge19Salz. In der intervariety Transplantationen von Trauben die Reaktionen der MiRNA Ausdruck auf Trockenstress erwiesen sich Genotyp-abhängige20.
Die rasante Entwicklung und sinkenden Kosten der Hochdurchsatz-Sequenzierung Technik haben eine große Chance für das Studium der MiRNA Vorschriften in agronomische Anlagen zur Verfügung gestellt. Wassermelone (Citrullus Lanatus [Thunb.] Mansf.), eine wichtige Cucurbit Ernte angebaut wird überall auf der Welt ist anfällig für niedrige Temperaturen. Flaschenkürbis (Lagenaria Siceraria [Molina] (Standl.) ist ein widerstandsfähiger Klima Cucurbit üblicherweise von Landwirten mit Wassermelone zu verpflanzen. Das primäre Ziel der aktuellen Studie soll einen Standard, effiziente und bequeme Methode zur Herstellung von Heterografts zwischen Wassermelone (Citrullus Lanatus [Thunb.] Mansf.) und Flaschenkürbis (Lagenaria Siceraria [Molina] Standl). Dieses Protokoll bietet auch eine detaillierte Regelung experimentelle und analytische Verfahren für die Untersuchung der Regulierung von MiRNA Ausdrücke nach Transplantation, die eignet sich für die Entdeckung der Mechanismen, die Heterografting Vorteile.
In dieser Studie verwendeten Anlage gehören die Wassermelone Sorte und der Flaschenkürbis Landrasse. Wassermelone Sorte ist eine kommerzielle Sorte mit hohem Ertrag aber anfällig für niedrige Temperaturen. Flaschenkürbis Landrasse ist eine beliebte Unterlage für Pfropfen mit Wassermelone, Gurke und Flaschenkürbis, durch seine sehr gute Verträglichkeit von niedrigen Temperaturen21.
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Protocol
1. Samen Sie Sterilisation und Keimung
- Einweichen Sie Oberfläche Sterilisation der Flaschenkürbis Samen in einen 500-mL-Becherglas gefüllt mit Wasser bei 58 ° C mit gelegentlichen rühren, bis die Wassertemperatur auf 40 ° C sinkt.
- Unterdessen setzen 3 kg der Torfboden in einer Nylontasche und sterilisieren, Autoklaven es bei 120 ° C/0.5 MPa für 20 Minuten.
- Halten Sie Einweichen der Flaschenkürbis Samen für 4-5 Std. mehr mit nicht gerührt.
- Sobald das Wasser Zimmertemperatur erreicht, spülen Sie die Samen 2 x - 3 X mit destilliertem Wasser ab.
- Das überschüssige Wasser abgießen und die Samen sprießen in Gazebeutel bei 28 ° C in einer Kammer Wachstum im Dunkeln zu ermöglichen.
- Nach der Keimung die Saat in Kunststoff-Töpfe (6 cm Durchmesser) gefüllt mit sterilisierten Torfboden.
- Wenn die Sämlinge Flaschenkürbis zwei abgeflachten Keimblätter entwickelt haben, wiederholen Sie Schritte 1.1-1.3 mit Wassermelone Samen.
Hinweis: Diese Zeit-Management sorgt dafür, dass die Größen der Spross und Unterlage für erfolgreiche Transplantation übereinstimmen.
(2) Wachstum des Keimlings und Veredelung
- Wachsen Sie die Keimlinge in einer Wachstums-Kammer mit einem dunklen Zyklus von 16 h Licht /8-h halten die Temperatur bei 28 ° C tagsüber (Licht) und bei 22 ° C in der Nacht (dunkel). Spülen Sie die Sämlinge durch Zugabe von Wasser 1 x pro Tag am späten Nachmittag.
- Verwenden Sie die Schnitt-Pfropfen Methode22 , Heterografts zu machen, wenn die Sämlinge der Flaschenkürbis (Wurzelstock) auf einen True-Blatt-Stadium und die Keimblätter der Wassermelone (Spross) (noch nicht abgewickelten) entstanden.
- Schneiden Sie die Hypocotyle der Wassermelone Sämlinge an 2-3 cm unterhalb der Keimblätter und der Spitze der Flaschenkürbis Sämlinge am Standort unmittelbar über den wahren lässt.
- Verwenden Sie einen Zahnstocher, um ein Loch in der Spitze der getrimmte Flaschenkürbis Sämlinge bilden. Legen Sie die gestutzten Wassermelone Sämlinge in die Löcher der Flaschenkürbis Sämlinge, Heterografts zu machen.
- Verwenden Sie eine ähnliche Methode wie in Schritt 2.2 vorgestellt, um Homografts zu machen.
Hinweis: Homo- und Heterografting-Kombinationen sollte immer erfolgen gleichzeitig (Abbildung 1), die, in diesem Fall ergibt sich im folgenden: Wassermelone/Flaschenkürbis (WB, Heterograft), Watermelon/Wassermelone (WW, Homograft) und Flaschenkürbis /bottle Kürbis (BB, Homograft).
Abbildung 1: Abbildung der Transplantat-Kombinationen und die veredelten Pflanzenstrukturen. WB = Wassermelone/Flasche Kürbis Heterografting; WW = Watermelon/Wassermelone Homografting; BB = Flaschenkürbis/Flasche Kürbis Homo-Pfropfen; WB-S = Spross Blätter von der Wassermelone/Flasche Kürbis-Heterografts, die abgetastet wurden; WB-R = Wurzelstock Blätter von der Wassermelone/Flasche Kürbis-Heterografts, die abgetastet wurden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
3. Management, Kältebehandlung, postgrafting und Probenahme
- Versetzen die verpflanzte Sämlinge mit transparenten Polyethylen-Beutel zu halten eine relativ hohe Luftfeuchtigkeit und pflegen sie für 7D unter Umweltbedingungen von 16 h Licht/8-h dunkel Zyklen, wobei die Temperatur bei 28 ° C tagsüber (Licht) und bei 22 ° C während der Nacht (dunkel).
- Entdecken Sie die transparente Polyethylen-Beutel am 7. Tag. Lassen Sie die Pflanze für eine zusätzliche 7-10 Tage unter den gleichen Bedingungen.
- Teilen Sie die gesunde einheitliche Sämlinge in zwei Gruppen, eine für Kältebehandlung (betont) und eine für die Steuerung (betont). Verlassen Sie für die Kontrollgruppe die Sämlinge in derselben Kammer Wachstum (bei 28 ° C) für weitere 48 h, während für die Kälte-betonte Gruppe zu, übertragen Sie die Sämlinge zu einer Wachstums-Kammer mit einer konstanten Temperatur bei 6 ° C, hell/dunkel-Bedingungen zu, wie in Schritt beschrieben 2.1.
- Probieren Sie die Blätter der Scion und die Unterlage aus der Grafts (Abbildung 1). Die Proben sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei-70 ° C bis zur Verwendung aufbewahren.
(4) Bibliothek Vorbereitung und Hochdurchsatz-Sequenzierung
- Die gefrorenen Proben zu einem 2-mL Microcentrifuge Schlauch in flüssigem Stickstoff zu übertragen.
- Jedes Rohr mit den Geweben fügen Sie eine Perle aus rostfreiem Stahl (5 mm Durchmesser hinzu).
- Homogenisieren der Gewebe zu einem feinen Pulver mit einer Perle Mühle Homogenisator für 30 s.
- Nehmen Sie für jede Pfropfen Kombination gleiche Mengen (0,1 g) Boden-Probe von zehn Sämlinge und mischen sie in einer 10 mL Zentrifugenröhrchen. Hinzufügen einer entsprechenden Menge an Guanidium Hydrochlorid Reagenz (Table of Materials) auf der Grundlage des Herstellers Vorschläge, das Gewebe Gewicht entspricht.
- Entfernen von genomischer DNA-Kontaminationen durch Zugabe von RNA-freie DNase I bis 150 U/mL bei 37 ° C für 1 h.
- Entscheidung über die insgesamt RNA-Menge auf ein Microcapillary Elektrophorese System für die RNA-Integrität gewährleisten Nummer > 7.0.
Hinweis: RIN > 7.0 sorgt für eine hohe Integrität der RNA-Proben. - Bereiten Sie kleine RNA-Bibliotheken mithilfe eines kommerziellen Kits (Table of Materials) entsprechend den Anweisungen des Herstellers. Verwenden Sie 1 µg Gesamt-RNS pro Probe um zu initiieren.
- Tauwetter Bibliothek Normalisierung Reagenzien und Adapter nach den Richtlinien des Herstellers. Kleinen RNAs mit 5 ' und 3 '-Adapter verbinden und eluieren und sie zu reinigen. Dann umgekehrt die 5′ transkribieren und 3' ligiert kleinen RNAs, die nach den Richtlinien des Herstellers.
- Durchführen Sie PCR-Amplifikation gemäß Protokoll des Herstellers. Beurteilen Sie die Qualität und Quantität der cDNA-Bibliotheken, die mit einem Microcapillary-Elektrophorese-System.
- Laden 1 µL einer RNA-Bibliothek auf einem Microcapillary Elektrophorese System um sicherzustellen die RIN > 7.0.
- Die kleine RNA-Bibliotheken auf einem Instrument von Hochdurchsatz-Sequenzierung an anderer Stelle beschriebenen23-Sequenz.
5. MiRNA und Target Gen Vorhersage
- Verwenden Sie für jede Pfropfen Kombination die open-Source UEA sRNA Werkbank 2,4-Anlage Version24 , minderwertige Sequenzen zu entfernen und um Adapter Sequenzen aus der rohen liest zu trimmen. Sequenzen, die kleiner als 18 Jahre sind zu verwerfen nt oder größer als 32 nt.
- Die qualitativ hochwertigen "sauberen" Sequenzen auf die open-Source Rfam 11.0-Datenbank zu erkennen und zu entfernen, liest der rRNA, tRNA, SnoRNA und anderen SnRNAs zu vergleichen.
- Richten Sie die verbleibenden Lesezugriffe auf die Referenz-Genome mit einem kurzen lesende Sequenz Ausrichtung Tool25. In diesem Schritt darf keine stimmen nicht überein.
Hinweis: Die Wassermelone "97103" Genom Versammlung V126 für die Angleichung an die liest aus dem Spross verwendet wurde, und der Flaschenkürbis "HZ" Genom Versammlung V127 wurde für liest aus dem Wurzelstock verwendet. - Vergleichen Sie die restlichen liest gegen bekannte Reifen MiRNAs in der open-Source MiRBase 22,028. Lesevorgänge, die homolog zu bekannten MiRNAs sind werden als konservierte MiRNAs klassifiziert.
- Vergleichen Sie die Sequenzen, die nicht die bekannten MiRNA-Vorläufer mit der Genomsequenz überein. Verwenden Sie die MIREAP29 Algorithmus, um potenzielle neuartige MiRNAs bei Standardeinstellungen zu erkennen.
(6) differentielle Expression und Gene Ontology-Analyse
- Vergleichen Sie die Ausdruck-Ebenen der MiRNAs basierend auf ihre lesen Sie zählt. MiRNAs mit einem P-Wert (Fishers exakter Test) < 0,05 und eine absolute Log2 Wert > 2 gelten differenziell ausgedrückt werden.
- Verwenden Sie eine antisense-Oligonukleotid Ziel Website Auswahl Werkzeug (TargetFinder)30 mögliche ergänzende mRNAs (MiRNA Zielgene), die differentiell exprimierten MiRNAs unter Standardparameter vorherzusagen.
- Verwenden Sie die gen-Ontologie (gehen) Bereicherung analytisches Werkzeug31 , MiRNA Ziel Gene Ontology (gehen Sie) offenbaren Muster unter einer P- Schwellenwert von 0,05 für statistische Signifikanz.
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Representative Results
Abbildung 2: Phänotypen von verschiedenen Transplantate bei Raumtemperatur und kalten betonte Bedingungen. (ein) zeigt dieses Panel Homo- und heterografted Sämlinge bei Raumtemperatur als Kontrolle. (b) zeigt dieses Panel Homo- und heterografted Sämlinge nach 48 h der Kältebehandlung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Mit der beschriebenen Methode, erhalten wir eine hohe Erfolgsquote (überleben) von 98 % für die Pfropfung. Phänotypen von verschiedenen Transplantate bei Raumtemperatur und kalten betonte Bedingungen sind in Abbildung 2dargestellt. Nach 48 h der Kältebehandlung zeigte homografted Wassermelone Pflanzen offensichtlich Wachstumsretardierung mit Welke Blätter, während die homografted Flaschenkürbis Pflanzen und die Wassermelone/Flasche Kürbis Heterografts viel energischeres Wachstum ausgestellt. Keine Anzeichen von Schäden wurden in den Blättern der Heterografts beobachtet, die sogar die homografted Flaschenkürbis Pflanzen besser als wo die niedrigste Laubblätter beschädigt wurden. Diese Ergebnisse zeigen deutlich den Vorteil des Heterografts in Übertragung der Kältetoleranz.
Kleine RNA-Sequenzierung der acht Bibliotheken ergab insgesamt 258 Millionen roh liest. Nach der Qualitätskontrolle (QC) insgesamt 146 Millionen liest entspricht ungefähr 30 Millionen einzigartige Sequenzen wurden beibehalten (Tabelle 1). Basierend auf diesen Satz von sauberen sRNA Sequenzen, 323 MiRNAs, darunter 10 bekannt und 313 Roman MiRNAs, wurden aus dem Flaschenkürbis vorausgesagt und 20 bekannten und 802 Roman MiRNAs wurden aus der watermelon.sRNAs von 24 vorausgesagt nt besteht die größte Klasse der sRNAs in allen Pfropfen Kombinationen, unabhängig von der Raumtemperatur oder kalten betonte Bedingungen (Abbildung 3).
| Behandlung | Code | Nein. Mal gelesen | sRNA | |
| Insgesamt | Einzigartige | |||
| WW-CK | Rohe | 30612962 | ||
| Reinigen | 19727501 | 3858868 | ||
| Genomische zugeordnet | 19059359 | 3777952 | ||
| BB-CK | Rohe | 30845546 | ||
| CK | Reinigen | 16832061 | 3787866 | |
| Genomische zugeordnet | 16375142 | 3694388 | ||
| WB-CK-S | Rohe | 39492123 | ||
| Reinigen | 26783053 | 6319473 | ||
| Genomische zugeordnet | 25919944 | 6132389 | ||
| WB-CK-R | Rohe | 23763619 | ||
| Reinigen | 10187791 | 1784447 | ||
| Genomische zugeordnet | 8946929 | 1537867 | ||
| WW-CL | Rohe | 27557577 | ||
| Reinigen | 17879038 | 3336242 | ||
| Genomische zugeordnet | 17153763 | 3259960 | ||
| BB-CL | Rohe | 29780991 | ||
| Reinigen | 13342206 | 3235570 | ||
| Kälte | Genomische zugeordnet | 12949972 | 3164329 | |
| WB-CL-S | Rohe | 45708415 | ||
| Reinigen | 23071845 | 4310276 | ||
| Genomische zugeordnet | 22363113 | 4224166 | ||
| WB-CL-R | Rohe | 30585408 | ||
| Reinigen | 19029266 | 3541729 | ||
| Genomische zugeordnet | 17364239 | 3196106 | ||
Tabelle 1: Statistiken der kleinen RNAs in verschiedenen Transplantate bei Raumtemperatur oder unter Kältebehandlung.
Abbildung 3: Größenverteilung der sRNA liest in verschiedenen Transplantate. (ein) zeigt dieses Fenster die Größenverteilung der sRNA in Heterografts unter Kontrolle oder kaltem Wetter liest. (b) dieses Panel zeigt die Größenverteilung der sRNA in Homografts unter Kontrolle oder kaltem Wetter liest. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Auf einer 48-h der Kältebehandlung wurden 30 und 268 MiRNAs up- und herunterreguliert, jeweils in den Blättern des Scion in der Heterografts. Dies stand in scharfem Kontrast zu den Ergebnissen in den Blättern der Wurzelstock, wo 31 und nur 12 MiRNAs waren up- und herunterreguliert, beziehungsweise (Abbildung 4). In der Wassermelone/Wassermelone Homografts waren 64 und 83 MiRNAs up- und herunterreguliert. In der Flaschenkürbis/Flasche Kürbis Homografts waren diese Zahlen 30 und 28. Offenbar verursacht Heterografting eine tiefgreifende Neuprogrammierung der MiRNA Ausdrücke. GO-Anreicherung Analysen der vermeintlichen Zielgene differentiell exprimierten MiRNAs, die identifiziert 78 angereicherten GO Aufarbeitung in der Spross der Heterografts 40 in biologischen Prozessen, eingeteilt 2 in zellulären Komponenten und 36 in molekulare Funktionen (Abbildung 5). Wir fanden, dass mehrere bekannte GO Begriffe/Wege im Zusammenhang mit abiotische/biotische Stress Resistenz und Signal Transduction, zum Beispiel des Chitin katabolen Prozess (gehen: 0006030, gehen: 0006032), Ethylen-aktivierte Signalweg (gehen: 0009873), Polyamin biosynthetische Prozess (GO: 0006596) und Signaltransduktion durch Protein-Phosphorylierung (gehen: 0009755), waren beteiligt. Kombiniert, unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Herunterregulierung der MiRNAs, durch die Fülle der Abschriften ihrer Zielgene tuning einen wichtigen Mechanismus zugrunde liegende erhöhte Kältetoleranz darstellen kann. In der Wassermelone/Flasche Kürbis Grafts hat die Heterograft per se einen erheblichen Einfluss auf die MiRNA-Muster, die die Prothese Vorteile bilden.
Abbildung 4: Vergleich der Muster der up- und herunterreguliert MiRNAs als Reaktion auf Kältestress in verschiedenen Transplantate. WB-S = Spross Blätter von der Wassermelone/Flasche Kürbis-Heterografts, die abgetastet wurden; WB-R = Wurzelstock Blätter von der Wassermelone/Flasche Kürbis-Heterografts, die abgetastet wurden; WW = Watermelon/Wassermelone Homografts; BB = Flaschenkürbis/Flasche Kürbis Homografts. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: GO Bereicherung Analysen der vermeintlichen Zielgene differentiell exprimierten MiRNAs in der Spross Blätter des Heterografts auf Kältestress. WB-CL-S = Spross Blätter der Wassermelone/Flasche Kürbis Heterografts unter Kältebehandlung; WB-CK-S = Spross Blätter der Wassermelone/Flasche Kürbis Heterografts bei Raumtemperatur. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
In diesem Protokoll beschrieben wir eine hoch effiziente und reproduzierbare Methode um Homo- und Heterografts zwischen Wassermelone und Flaschenkürbis ausführlich. Diese Methode erfordert keine spezielle Ausrüstung ist sehr einfach zu bedienen und hat in der Regel eine sehr hohe Überlebensrate der Pfropfung. Die Methode kann auch verwendet werden, zu Transplantationen für andere Kürbisgewächse, wie z. B. zwischen Wassermelone, Gurke und Kürbis.
Es ist erwähnenswert, dass die relative Größe (Alter) von der Unterlage und Scion entscheidend ist für eine erfolgreiche Transplantation (Schritt 2.2 des Protokolls). Wir beobachteten, dass wenn der Wurzelstock verwendet zu groß im Vergleich zu den Spross war, die Transplantat-Union schwieriger zu bilden war, weil der Stamm des Scion etwas ausgehöhlt wurde. Basierend auf unseren bisherigen Proteomic Daten31, die Einbeziehung von selbst veredelten Spross und selbst veredelten Wurzelstock als Steuerelemente wird dringend empfohlen (Schritt 2.3 des Protokolls), weil dann die Auswirkungen der Pfropfung Verletzungen weitgehend eliminiert werden kann.
Dieses Protokoll bietet auch eine detaillierte experimentelle Schema und spezifische experimentelle Verfahren zur Untersuchung der Häufigkeiten von MiRNAs in das Heterografting-System. Diese Methode wird auch in anderen Pflanzen-Pfropfen Systemen, die Mechanismen der nah- und Fernverkehr MiRNA Regulierung zu offenbaren für Studien nützlich sein. In den Vertreter Ergebnisseberichten wir die Ausdruck Änderungen nur lokale MiRNAs in der Spross oder Wurzelstock als Reaktion auf eine niedrige Temperatur. Anfallende Berichte haben deutlich gemacht, dass die Einbeziehung der Fernverkehr kleine RNA-Übertragung bei Pfropfung phänotypischen Veränderungen. Das Protokoll, das hier vorgestellte verbindet die Methoden zur Analyse von Pfropfen und hohem Durchsatz kann auch für MiRNA Übertragung Analyse zwischen Spross und der Wurzelstock verwendet werden. Das Prinzip der Differenzierung übertragenen MiRNAs aus lokalen MiRNAs basiert auf ihre Reihenfolge Ähnlichkeit mit der Referenz-Genomen (d. h., eine MiRNA in der Spross, der mehr wie der Wurzelstock Genom betrachtet wird, aus dem Wurzelstock übertragen werden und vice versa).
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben. Die kleine RNA Sequenzierungsdaten lagert sich in der GenBank unter Zbl-Nummer SRP136842.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (31772191), das Forschungsprojekt für öffentliche Interesse in der Provinz Zhejiang (2017 C 32027), die Schlüssel Science Projekt der Pflanzenzüchtung in Zhejiang (2016 C 02051) und das nationale Programm für unterstützt. die Unterstützung von erstklassigen Young Professionals (zu P.X).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| RNA-free DNase I | Takara | D2270A | |
| Truseq Small RNA sample prep Kit | Illumina | RS-200-0012 | |
| 2100 Bionalyser | Agilent | 5067 | |
| DNA Polymerase | Thermo Fisher Scientific | F530S | |
| UEA sRNA workbench 2.4-plant version (software) | NA | NA | http://srna-workbench.cmp.uea.ac.uk/ |
| Rfam 11.0 database (website) | NA | NA | http://rfam.janelia.org |
| miRBase 22.0 (website) | NA | NA | http://www.mirbase.org/ |
| MIREAP(software) | NA | NA | https://sourceforge.net/projects/mireap/ |
| TargetFinder (software) | NA | NA | http://targetfinder.org/ |
References
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