Generering af Homo- og Heterografts mellem vandmelon og flasken centnergræskar for studiet af kolde-responderende MicroRNA
Summary
Her præsenterer vi en detaljeret protokol for effektivt at homo- og heterografts mellem vandmelon og flasken centnergræskar, ud over metoder til væv prøveudtagning, data generation og dataanalyse, for undersøgelse af kolde-responderende MicroRNA.
Abstract
MicroRNA (miRNAs) er endogene lille ikke-kodende RNA’er på omkring 20-24 nt, kendt for at spille en vigtig rolle i anlægget udvikling og tilpasning. Der er en akkumulerende beviser for, at udtrykkene for visse miRNAs, ændres når podning, en landbrugspraksis, der almindeligvis anvendes af landmænd til at forbedre afgrøde tolerance over for biotisk og abiotisk understreger. Flaske centnergræskar er en iboende klima-modstandsdygtige afgrøde i forhold til mange andre store Cucurbitæ, herunder vandmelon, gør det en af de mest udbredte grundstammer til sidstnævnte. De seneste fremskridt inden for høj overførselshastighed sekventering teknologier har givet store muligheder for at undersøge kolde-responderende miRNAs og deres bidrag til heterograft fordele; passende eksperimentelle procedurer er dog en forudsætning for dette formål. Vi præsenterer her, en detaljeret protokol for effektivt generere homo- og heterografts mellem den kolde-modtagelige vandmelon og kolde-tolerant flasken centnergræskar, ud over metoder til væv prøveudtagning, data generation og dataanalyse. De præsenterede metoder er også nyttige for andre plante-podning systemer, afhøre miRNA forordninger under forskellige miljøbelastninger, såsom varme, tørke og saltholdighed.
Introduction
Podning har længe været ansat som en landbrugs teknik til at forbedre afgrødeproduktionen og tolerance over for biotisk og abiotisk understreger1,2,3. I heterografting systemer, kan elite grundstammer forbedre vand og næringsstoffer optagelsen af planter, styrke modstand mod jord patogener, og begrænse de negative virkninger af metal toksicitet4,5, som kan give podninger en forbedret vækst vigor og øget tolerance over for miljøbelastninger. I mange tilfælde, heterografting kan også have indflydelse på frugt kvaliteter i gartneri planter, fører til forbedret frugtsmag og øget indhold af sundheds-relaterede forbindelser6,7. Det er blevet konstateret, at langdistance overførsel af Phytohormoner, RNA’er, peptider og proteiner mellem Rodstokken og scion er en grundlæggende mekanisme modulerende vækst og udvikling omprogrammering af scion planter8,9 ,10. Podning har været meget anvendt i undersøgelser af langdistance signalering og transport i forbindelse med miljømæssig tilpasning11. Podning eksperimenter er navnlig kraftfulde til entydig påvisning af overførte molekyler i modtagelse af væv eller vaskulær sap, og aktivering eller undertrykkelse af molekylære mål på grund af signal transmission12.
Ikke-kodende RNA’er, en stor klasse af RNA, der udøver vigtige regulerende funktioner i celler, der er rapporteret til at spille en rolle i at lette plante tilpasning til abiotisk stress13. miRNAs er endogene lille ikke-kodende RNA’er på omkring 20-24 nt. undersøgelser har afsløret miRNAs i forskellige aspekter af anlægget aktiviteter regulerende rolle, sådan som skyde vækst, lateral rod dannelsen14,15,16, næringsstof optagelse, sulfat metabolisme og homøostase17og svar til biotiske og abiotiske stress18. For nylig, var udtryk for miRNAs og deres mål gener relateret til salt stresstolerance i heterografted agurk frøplanter19. I de intervariety grafts druemost fandtes svarene fra miRNA udtryk for tørkestress for at være genotype-afhængige20.
Den hurtige udvikling og mindske omkostningerne ved høj overførselshastighed sekventering teknologi har givet en stor mulighed for undersøgelse af miRNA forordninger i agronomiske planter. Vandmelon (Citrullus lanatus [Thunb.] Mansf.), en vigtig cucurbit afgrøde dyrkes på verdensplan, er modtagelige for lave temperaturer. Flasken græskar (Lagenaria siceraria [Molina] Standl.) er en mere klima-robust cucurbit, der almindeligvis anvendes af landmænd til at pode med vandmelon. Det primære mål for den aktuelle undersøgelse er at etablere en standard, effektiv, og bekvem metode til at gøre heterografts mellem vandmelon (Citrullus lanatus [Thunb.] Mansf.) og flasken græskar (Lagenaria siceraria [Molina] Standl). Denne protokol giver også en detaljeret eksperimentelle ordning og analytiske procedurer for undersøgelse af reguleringen af miRNA udtryk efter podning, hvilket er nyttigt for at afsløre de underliggende heterografting fordele mekanismer.
Vegetabilske materialer i denne undersøgelse omfatter vandmelon kultivar og flasken centnergræskar landrace. Vandmelon kultivar er en kommerciel sort med højt udbytte men modtagelige for lave temperaturer. Flaske centnergræskar landrace er en populær grundstammer til podning med vandmelon, agurk og flasken centnergræskar, på grund af sin fremragende tolerance over for lave temperaturer21.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne protokol beskrev vi i detaljer en yderst effektiv og reproducerbar metode til at gøre homo- og heterografts mellem vandmelon og flasken centnergræskar. Denne metode, der kræver ingen særlige udstyr, er meget nem at betjene og typisk har en meget høj overlevelsesraten for podning. Metoden kan også bruges til at gøre grafts for andre Cucurbitæ, såsom mellem vandmelon, agurk og græskar.
Det er værd at bemærke, at den relative størrelse (alder) rodstok og scion er afgørende f…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (31772191), forskningsprojekt for offentlighedens interesse i Zhejiang provinsen (2017C 32027), den nøglen videnskab projekt af planteavl i Zhejiang (2016C 02051) og det nationale Program for Understøttelse af Top-notch unge fagfolk (til P.X.).
Materials
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| RNA-free DNase I | Takara | D2270A | |
| Truseq Small RNA sample prep Kit | Illumina | RS-200-0012 | |
| 2100 Bionalyser | Agilent | 5067 | |
| DNA Polymerase | Thermo Fisher Scientific | F530S | |
| UEA sRNA workbench 2.4-plant version (software) | NA | NA | http://srna-workbench.cmp.uea.ac.uk/ |
| Rfam 11.0 database (website) | NA | NA | http://rfam.janelia.org |
| miRBase 22.0 (website) | NA | NA | http://www.mirbase.org/ |
| MIREAP(software) | NA | NA | https://sourceforge.net/projects/mireap/ |
| TargetFinder (software) | NA | NA | http://targetfinder.org/ |
References
- Schwarz, D., Rouphael, Y., Colla, G., Venema, J. H. Grafting as a tool to improve tolerance of vegetables to abiotic stresses: Thermal stress, water stress and organic pollutants. Scientia Horticulturae. 127, 162-171 (2010).
- Li, Y., et al. Mechanisms of tolerance differences in cucumber seedlings grafted on rootstocks with different tolerance to low temperature and weak light stresses. Turkish Journal of Botany. 39 (4), 606-614 (2015).
- Li, C. H., Li, Y. S., Bai, L. Q., He, C. X., Yu, X. C. Dynamic Expression of miRNAs and Their Targets in the Response to Drought Stress of Grafted Cucumber Seedlings. Horticultural Plant Journal. 2 (1), 41-49 (2016).
- Rouphael, Y., Cardarelli, M., Colla, G., Rea, E. Yield, mineral composition, water relations, and water use efficiency of grafted mini-watermelon plants under deficit irrigation. HortScience. 43 (3), 730-736 (2008).
- Savvas, D., et al. Interactive effects of grafting and manganese supply on growth, yield, and nutrient uptake by tomato. HortScience. 44 (7), 1978-1982 (2009).
- Aloni, B., Cohen, R., Karni, L., Aktas, H., Edelstein, M. Hormonal signaling in rootstock-scion interactions. Scientia Horticulturae. 127, 119-126 (2010).
- Rouphael, Y., Caradrelli, M., Rea, E., Colla, G. Improving melon and cucumber photosynthetic activity, mineral composition, and growth performance under salinity stress by grafting onto Cucurbita hybrid rootstocks. Photosynthetica. 50 (2), 180-188 (2012).
- Louws, F. J., Rivard, C. L., Kubota, C. Grafting fruiting vegetables to manage soilborne pathogens, foliar pathogens, arthropods and weeds. Scientia Horticulturae. 127 (2), 127-146 (2010).
- Asins, M. J., et al. Genetic analysis of rootstock-mediated nitrogen (N) uptake and root-to-shoot signalling at contrasting N availabilities in tomato. Plant Science. 263, 94-106 (2017).
- Yin, L. K., et al. Role of protective enzymes in tomato rootstocks to resist root knot nematodes. Acta Horticulturae. 1086 (1086), 213-218 (2015).
- Gaion, L. A., Carvalho, R. F. Long-Distance Signaling: what grafting has revealed?. Journal of Plant Growth Regulation. 37 (2), 694-704 (2018).
- Turnbull, C. G., Hennig, L., Köhler, C. Grafting as a research tool. Plant Developmental Biology. , 11-26 (2010).
- Li, C., et al. Grafting-responsive miRNAs in cucumber and pumpkin seedlings identified by high-throughput sequencing at whole genome level. Physiologia Plantarum. 151 (4), 406-422 (2014).
- Lakhotia, N., et al. Identification and characterization of miRNAome in root, stem, leaf and tuber developmental stages of potato (Solanum tuberosum L.) by high-throughput sequencing. BMC Plant Biology. 14 (1), 6 (2014).
- Jones-Rhoades, M. W., Bartel, D. P., Bartel, B. MicroRNAs and their regulatory roles in plants. Annual Review of Plant Biology. 57, 19-53 (2006).
- Puzey, J. R., Kramer, E. M. Identification of conserved Aquilegia coerulea microRNAs and their targets. Genetic. 448 (1), 46-56 (2009).
- Matthewman, C. A., et al. miR395 is a general component of the sulfate assimilation regulatory network in Arabidopsis. FEBS Letters. 586 (19), 3242-3248 (2012).
- Ali, E. M., et al. Transmission of RNA silencing signal through grafting confers virus resistance from transgenically silenced tobacco rootstocks to non-transgenic tomato and tobacco scions. Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology. 25 (3), 245-252 (2016).
- Li, Y. S., Li, C. H., Bai, L. Q., He, C. X., Yu, X. C. MicroRNA and target gene responses to salt stress in grafted cucumber seedlings. Acta Physiologiae Plantarum. 38 (2), 1-12 (2016).
- Pagliarani, C., et al. The accumulation of miRNAs differentially modulated by drought stress is affected by grafting in grapevine. Plant Physiology. 173 (4), 2180-2195 (2017).
- Liu, N., Yang, J. H., Guo, S. G., Xu, Y., Zhang, M. F. Genome-wide identification and comparative analysis of conserved and novel microRNAs in grafted watermelon by high-throughput sequencing. PLoS One. 8 (2), e57359 (2013).
- Song, G. Development of 2JC-350 automatic grafting machine with cut grafting method for vegetable seedling. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering. 22 (12), 103-106 (2006).
- Kumar, D., et al. Uncovering leaf rust responsive miRNAs in wheat (triticum aestivum l.) using high-throughput sequencing and prediction of their targets through degradome analysis. Planta. 245 (1), 1-22 (2016).
- Kohli, D., et al. Identification and characterization of wilt and salt stress-responsive microRNAs in chickpea through high-throughput sequencing. PLoS One. 9 (10), e108851 (2014).
- Salzberg, S. L. Computational challenges in next-generation genomics. International Conference on Scientific and Statistical Database Management. ACM. 2, (2013).
- Guo, S. G., et al. The draft genome of watermelon (Citrullus lanatus) and resequencing of 20 diverse accessions. Nature Genetics. 45, 51-58 (2013).
- Wang, Y., et al. Gourdbase: a genome-centered multi-omics database for the bottle gourd (lagenaria siceraria), an economically important cucurbit crop. Scientific Reports. 8 (1), 306 (2018).
- Wang, X. F., Liu, X. S. Systematic Curation of miRBase Annotation Using Integrated Small RNA High-Throughput Sequencing Data for C. elegans and Drosophila. Frontiers in Genetics. 2, 25 (2011).
- Bo, X. C., Wang, S. Q. TargetFinder: a software for antisense oligonucleotide target site selection based on MAST and secondary structures of target mRNA. Bioinformatics. 21 (8), 1401-1402 (2005).
- . GOATOOLS: Tools for Gene Ontology Available from: https://doi.org/10.5281/zenodo.31628 (2015)
- Wang, L. P., Li, G. J., Wu, X. H., Xu, P. Comparative proteomic analyses provide novel insights into the effects of grafting wound and hetero-grafting per se on bottle gourd. Scientia Horticulturae. 200 (8), 1-6 (2016).
