Generere Homo- og Heterografts mellom vannmelon og flaske Gourd for studier av kalde svarer MicroRNAs
Summary
Her presenterer vi en detaljert protokoll for effektivt å gjøre homo- og heterografts mellom vannmelon og flasken gourd, i tillegg til metodene i vev prøvetaking data generasjon og dataanalyse for etterforskningen av kalde svarer microRNAs.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) er endogene små ikke-koding RNAs på ca 20-24 nt, kjent for å spille viktige roller i anlegget utvikling og tilpasning. Det er en samler bevis viser at av visse miRNAs endres når pode, en landbruk praksis vanligvis anvendt av gårdbruker for å forbedre avling toleranse biotiske og abiotiske påkjenninger. Flaske gourd er en iboende klima-elastiske avling sammenlignet med mange andre store cucurbits, inkludert vannmelon, gjengi det en av de mest brukte grunnstammer sistnevnte. Siste fremme av høy gjennomstrømming sekvensering teknologi har gitt gode muligheter til å undersøke kalde svarer miRNAs og deres bidrag til heterograft fordeler; Likevel er tilstrekkelig eksperimentelle prosedyrer en forutsetning for dette formålet. Her presenterer vi en detaljert protokoll for effektivt generere homo- og heterografts mellom kalde-følsomme vannmelon og kalde-tolerant flasken gourd, i tillegg til vev prøvetaking, data generasjon og dataanalyse. Presentert metodene er også nyttig for andre plante-pode systemer, avhøre miRNA retningslinjer under ulike miljømessige påkjenninger, som varme, tørke og saltholdighet.
Introduction
Pode har lenge vært ansatt som en landbruket teknikk å forbedre planteproduksjon og toleranse biotiske og abiotiske understreker1,2,3. I heterografting systemer, kan elite grunnstammer forbedre vann og næringsstoffer opptak av planter, styrke motstanden mot jord patogener og begrense de negative effektene av metall toksisitet4,5, som kan gi graftene en forbedret vekst kraft og økt toleranse mot miljømessige belastninger. I mange tilfeller kan heterografting også påvirke frukt kvaliteter i hagebruk planter, fører til økt frukt smaken og økt innhold helsemessige forbindelser6,7. Det har blitt funnet at langdistanse overføring av phyto-hormoner, RNAs, peptider og proteiner mellom rootstock og scion er en fundamental mekanisme modulerende vekst og utvikling omprogrammering scion planter8,9 ,10. Pode har vært mye brukt i studier av langdistanse signalering og transport i forhold til miljømessige tilpasning11. Pode eksperimenter er spesielt kraftig entydig deteksjon av overførte molekyler motta vev eller vaskulær sap, og aktivisering eller undertrykkelse av molekylære mål på grunn av signalet overføring12.
Non-koding RNAs, en stor klasse av at viktige forskrifter funksjoner i cellene, har blitt rapportert å spille en rolle i tilrettelegge anlegget tilpasning til abiotiske stress13. miRNAs er endogene små ikke-koding RNAs på ca 20-24 nt. undersøkelser avdekket regulatoriske rollen som miRNAs i forskjellige aspekter av anlegget aktiviteter, slik som skyte vekst, lateral rot formasjon14,15,16: nærings-opptak, sulfate metabolisme og homeostase17og Svar å biotiske og abiotiske stress18. Nylig uttrykk for miRNAs og sine mål gener var knyttet til salt stress toleranse i heterografted agurk seedlings19. I intervariety graftene av drue, ble svarene på miRNA uttrykk til tørke stress funnet for å være genotype-avhengige20.
Den raske utviklingen og redusere kostnadene for høy gjennomstrømming sekvensering teknologi har gitt en stor mulighet for studiet av miRNA forskrifter agronomical planter. Vannmelon (Citrullus lanatus [Thunb.] Mansf.), en viktig cucurbit avling dyrkes over hele verden, er utsatt for lave temperaturer. Flasken gourd (Lagenaria siceraria [Molina] Standl.) er en mer klima-elastiske cucurbit brukt av bønder pode med vannmelon. Hovedmålet med denne studien er å etablere en standard, effektiv og praktisk metode for å gjøre heterografts mellom vannmelon (Citrullus lanatus [Thunb.] Mansf.) og flasken gourd (Lagenaria siceraria [Molina] Standl). Denne protokollen gir også en detaljert eksperimentelle ordningen og analytisk prosedyrer for studiet av regulering av miRNA uttrykk etter pode, noe som er nyttig for å avsløre mekanismene bak heterografting fordeler.
Anlegget materialene som brukes i denne studien omfatter vannmelon sorten og flaske gourd landrace. Vannmelon kultivaren er en kommersiell kultivar med høy avkastning men utsatt for lave temperaturer. Flaske gourd landrace er en populær rootstock for pode med vannmelon og agurk flasken gourd, på grunn av sin utmerkede toleranse for lave temperaturer21.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne protokollen beskrevet vi i detalj en svært effektiv og reproduserbar metode homo – og heterografts mellom vannmelon og flaske gourd. Denne metoden krever ingen bestemt utstyr, er svært enkel å betjene og vanligvis har en meget høy overlevelse av pode. Metoden kan også brukes til å lage grafts for andre cucurbits, som mellom vannmelon, agurk og gresskar.
Det er verdt å merke seg at den relative størrelsen (alder) rootstock og scion er kritisk til å gjøre en vellykket pode (tri…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av den nasjonale Natural Science Foundation i Kina (31772191), prosjektet for offentlig interesse i Zhejiang-provinsen (2017C 32027), nøkkel vitenskap prosjekt av anlegget oppdrett i Zhejiang (2016C 02051) og nasjonale programmet for Støtte fra topp unge fagfolk (til P.X.).
Materials
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| RNA-free DNase I | Takara | D2270A | |
| Truseq Small RNA sample prep Kit | Illumina | RS-200-0012 | |
| 2100 Bionalyser | Agilent | 5067 | |
| DNA Polymerase | Thermo Fisher Scientific | F530S | |
| UEA sRNA workbench 2.4-plant version (software) | NA | NA | http://srna-workbench.cmp.uea.ac.uk/ |
| Rfam 11.0 database (website) | NA | NA | http://rfam.janelia.org |
| miRBase 22.0 (website) | NA | NA | http://www.mirbase.org/ |
| MIREAP(software) | NA | NA | https://sourceforge.net/projects/mireap/ |
| TargetFinder (software) | NA | NA | http://targetfinder.org/ |
References
- Schwarz, D., Rouphael, Y., Colla, G., Venema, J. H. Grafting as a tool to improve tolerance of vegetables to abiotic stresses: Thermal stress, water stress and organic pollutants. Scientia Horticulturae. 127, 162-171 (2010).
- Li, Y., et al. Mechanisms of tolerance differences in cucumber seedlings grafted on rootstocks with different tolerance to low temperature and weak light stresses. Turkish Journal of Botany. 39 (4), 606-614 (2015).
- Li, C. H., Li, Y. S., Bai, L. Q., He, C. X., Yu, X. C. Dynamic Expression of miRNAs and Their Targets in the Response to Drought Stress of Grafted Cucumber Seedlings. Horticultural Plant Journal. 2 (1), 41-49 (2016).
- Rouphael, Y., Cardarelli, M., Colla, G., Rea, E. Yield, mineral composition, water relations, and water use efficiency of grafted mini-watermelon plants under deficit irrigation. HortScience. 43 (3), 730-736 (2008).
- Savvas, D., et al. Interactive effects of grafting and manganese supply on growth, yield, and nutrient uptake by tomato. HortScience. 44 (7), 1978-1982 (2009).
- Aloni, B., Cohen, R., Karni, L., Aktas, H., Edelstein, M. Hormonal signaling in rootstock-scion interactions. Scientia Horticulturae. 127, 119-126 (2010).
- Rouphael, Y., Caradrelli, M., Rea, E., Colla, G. Improving melon and cucumber photosynthetic activity, mineral composition, and growth performance under salinity stress by grafting onto Cucurbita hybrid rootstocks. Photosynthetica. 50 (2), 180-188 (2012).
- Louws, F. J., Rivard, C. L., Kubota, C. Grafting fruiting vegetables to manage soilborne pathogens, foliar pathogens, arthropods and weeds. Scientia Horticulturae. 127 (2), 127-146 (2010).
- Asins, M. J., et al. Genetic analysis of rootstock-mediated nitrogen (N) uptake and root-to-shoot signalling at contrasting N availabilities in tomato. Plant Science. 263, 94-106 (2017).
- Yin, L. K., et al. Role of protective enzymes in tomato rootstocks to resist root knot nematodes. Acta Horticulturae. 1086 (1086), 213-218 (2015).
- Gaion, L. A., Carvalho, R. F. Long-Distance Signaling: what grafting has revealed?. Journal of Plant Growth Regulation. 37 (2), 694-704 (2018).
- Turnbull, C. G., Hennig, L., Köhler, C. Grafting as a research tool. Plant Developmental Biology. , 11-26 (2010).
- Li, C., et al. Grafting-responsive miRNAs in cucumber and pumpkin seedlings identified by high-throughput sequencing at whole genome level. Physiologia Plantarum. 151 (4), 406-422 (2014).
- Lakhotia, N., et al. Identification and characterization of miRNAome in root, stem, leaf and tuber developmental stages of potato (Solanum tuberosum L.) by high-throughput sequencing. BMC Plant Biology. 14 (1), 6 (2014).
- Jones-Rhoades, M. W., Bartel, D. P., Bartel, B. MicroRNAs and their regulatory roles in plants. Annual Review of Plant Biology. 57, 19-53 (2006).
- Puzey, J. R., Kramer, E. M. Identification of conserved Aquilegia coerulea microRNAs and their targets. Genetic. 448 (1), 46-56 (2009).
- Matthewman, C. A., et al. miR395 is a general component of the sulfate assimilation regulatory network in Arabidopsis. FEBS Letters. 586 (19), 3242-3248 (2012).
- Ali, E. M., et al. Transmission of RNA silencing signal through grafting confers virus resistance from transgenically silenced tobacco rootstocks to non-transgenic tomato and tobacco scions. Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology. 25 (3), 245-252 (2016).
- Li, Y. S., Li, C. H., Bai, L. Q., He, C. X., Yu, X. C. MicroRNA and target gene responses to salt stress in grafted cucumber seedlings. Acta Physiologiae Plantarum. 38 (2), 1-12 (2016).
- Pagliarani, C., et al. The accumulation of miRNAs differentially modulated by drought stress is affected by grafting in grapevine. Plant Physiology. 173 (4), 2180-2195 (2017).
- Liu, N., Yang, J. H., Guo, S. G., Xu, Y., Zhang, M. F. Genome-wide identification and comparative analysis of conserved and novel microRNAs in grafted watermelon by high-throughput sequencing. PLoS One. 8 (2), e57359 (2013).
- Song, G. Development of 2JC-350 automatic grafting machine with cut grafting method for vegetable seedling. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering. 22 (12), 103-106 (2006).
- Kumar, D., et al. Uncovering leaf rust responsive miRNAs in wheat (triticum aestivum l.) using high-throughput sequencing and prediction of their targets through degradome analysis. Planta. 245 (1), 1-22 (2016).
- Kohli, D., et al. Identification and characterization of wilt and salt stress-responsive microRNAs in chickpea through high-throughput sequencing. PLoS One. 9 (10), e108851 (2014).
- Salzberg, S. L. Computational challenges in next-generation genomics. International Conference on Scientific and Statistical Database Management. ACM. 2, (2013).
- Guo, S. G., et al. The draft genome of watermelon (Citrullus lanatus) and resequencing of 20 diverse accessions. Nature Genetics. 45, 51-58 (2013).
- Wang, Y., et al. Gourdbase: a genome-centered multi-omics database for the bottle gourd (lagenaria siceraria), an economically important cucurbit crop. Scientific Reports. 8 (1), 306 (2018).
- Wang, X. F., Liu, X. S. Systematic Curation of miRBase Annotation Using Integrated Small RNA High-Throughput Sequencing Data for C. elegans and Drosophila. Frontiers in Genetics. 2, 25 (2011).
- Bo, X. C., Wang, S. Q. TargetFinder: a software for antisense oligonucleotide target site selection based on MAST and secondary structures of target mRNA. Bioinformatics. 21 (8), 1401-1402 (2005).
- . GOATOOLS: Tools for Gene Ontology Available from: https://doi.org/10.5281/zenodo.31628 (2015)
- Wang, L. P., Li, G. J., Wu, X. H., Xu, P. Comparative proteomic analyses provide novel insights into the effects of grafting wound and hetero-grafting per se on bottle gourd. Scientia Horticulturae. 200 (8), 1-6 (2016).
