Generera Homo- och Heterografts mellan vattenmelon och flaska kalebass för studien av kalla-lyhörd mikroRNA
Summary
Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för att effektivt göra homo- och heterografts mellan vattenmelon och flaska kalebass, utöver metoder för vävnad provtagning, data generation och dataanalys, för utredning av kalla-lyhörd mikroRNA.
Abstract
MikroRNA (Mirna) är endogena liten icke-kodande RNAs av omkring 20-24 nt, känd för att spela viktiga roller i växten utveckling och anpassning. Det finns en ackumulerande bevis visar att uttrycken för vissa MicroRNA ändras när ympning, en jordbrukspraxis som vanligen används av jordbrukare för att förbättra gröda tolerans mot biotiska och abiotiska påfrestningar. Flaska kalebass är en inneboende klimattålig gröda jämfört med många andra stora gurkväxter, inklusive vattenmelon, gör den en av de mest använda grundstammar för den senare. Senaste befordran av hög genomströmning sekvensering teknik har gett stora möjligheter att undersöka kallt-lyhörd MicroRNA och deras bidrag till heterograft fördelar; men är tillräckliga experimentella rutiner en förutsättning för detta ändamål. Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för att effektivt generera homo- och heterografts mellan kall-mottagliga vattenmelon och kalla-tolerant flaskan kalebass, utöver metoder för vävnad provtagning, data generation och dataanalys. Metoderna som presenteras är också användbara för andra växt-ympning system, att förhöra miRNA föreskrifter enligt olika miljöpåfrestningar, såsom värme, torka och salthalt.
Introduction
Ympning har länge använts som en jordbruks teknik att förbättra vegetabilieproduktion och tolerans mot biotiska och abiotiska betonar1,2,3. I heterografting system, kan elite grundstammar förbättra vatten och näringsämnen upptag av växter, stärka motstånd till jord patogener och begränsa de negativa effekterna av metal toxicitet4,5, som kan ge grafterna en förbättrad tillväxt vigor och ökad tolerans mot miljöpåfrestningar. I många fall kan heterografting också påverka frukt kvaliteter i trädgårds-växter, vilket leder till förbättrad fruktsmak och ökat innehåll av hälsorelaterade föreningar6,7. Det har konstaterats att långväga överföring av fytohormoner, RNAs, peptider och proteiner mellan grundstammen och scion är en grundläggande mekanism modulerande tillväxt och utveckling omprogrammering av scion växter8,9 ,10. Ympning har använts i studier av långdistans signalering och transporter i förhållande till miljöanpassning11. Ympning experiment är särskilt kraftfull för entydig identifiering av överförda molekyler i mottagande vävnad eller vaskulär sap, och aktiveringen eller undertryckande av molekylära mål på grund av signal transmission12.
Icke-kodande RNAs, en stor klass av RNA som utöva viktiga reglerande funktioner i celler, har rapporterats att spela en roll i att underlätta växt anpassning till abiotisk stress13. MicroRNA är endogena liten icke-kodande RNAs av omkring 20-24 nt. studier har visat reglerande roll av MicroRNA i olika aspekter av anläggningen aktiviteter, sådan som skjuter tillväxt, lateral rot bildandet14,15,16, näringsupptag, sulfat metabolism och homeostas17och Svaren till biotiska och abiotiska betona18. Nyligen, uttryck för MicroRNA och deras målgener var relaterade till salt stresstålighet i heterografted gurka plantor19. I intervariety grafterna av druvmust befanns svaren från miRNA uttryck till torkstress vara genotyp beroende20.
Den snabba utvecklingen och minskar kostnaden för hög genomströmning sekvenseringsteknologi har gett en stor möjlighet för studier av miRNA förordningar i agronomiska växter. Vattenmelon (Citrullus lanatus [Thunb.] Mansf.), en viktig cucurbit gröda som odlas över hela världen, är mottagliga för låga temperaturer. Flaska kalebass (Lagenaria siceraria [Molina] Standl.) är ett mer klimattåligt cucurbit som ofta används av jordbrukare för att ympa med vattenmelon. Det primära målet för den aktuella studien är att fastställa en standard, effektiv och bekväm metod för att göra heterografts mellan vattenmelon (Citrullus lanatus [Thunb.] Mansf.) och flaskan kalebass (Lagenaria siceraria [Molina] Standl). Detta protokoll ger också en detaljerad experimentella system och analytiska förfaranden för studiet av regleringen av miRNA uttryck efter ympning, vilket är användbart för att avslöja de mekanismerna bakom heterografting fördelar.
De växtmaterial som används i denna studie inkluderar vattenmelon sorten och flaskan kalebass lantras. Vattenmelon sorten är en kommersiell sort med hög kapacitet men mottagliga för låga temperaturer. Flaska kalebass lantras är en populär grundstamssticklingar för ympning med vattenmelon, gurka och flaska kalebass, på grund av dess utmärkta tolerans av låga temperaturer21.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll beskriver vi i detalj en högeffektiv och reproducerbar metod för att göra homo- och heterografts mellan vattenmelon och flaska kalebass. Denna metod, som kräver ingen särskild utrustning, är mycket lätt att använda och har vanligtvis en mycket hög överlevnad av ympning. Metoden kan också användas för att göra grafts för andra gurkväxter, som mellan vattenmelon, gurka och pumpa.
Det är värt att notera att den relativa storleken (år) av rotstock och scion är a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete fick stöd av den nationella naturvetenskap Foundation i Kina (31772191), forskningsprojektet för allmänintresset i Zhejiang-provinsen (2017C 32027), det nyckel vetenskap projekt av växtförädling i Zhejiang (2016C 02051) och det nationella programmet för Stöd av Top-notch unga yrkesverksamma (till P.X.).
Materials
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| RNA-free DNase I | Takara | D2270A | |
| Truseq Small RNA sample prep Kit | Illumina | RS-200-0012 | |
| 2100 Bionalyser | Agilent | 5067 | |
| DNA Polymerase | Thermo Fisher Scientific | F530S | |
| UEA sRNA workbench 2.4-plant version (software) | NA | NA | http://srna-workbench.cmp.uea.ac.uk/ |
| Rfam 11.0 database (website) | NA | NA | http://rfam.janelia.org |
| miRBase 22.0 (website) | NA | NA | http://www.mirbase.org/ |
| MIREAP(software) | NA | NA | https://sourceforge.net/projects/mireap/ |
| TargetFinder (software) | NA | NA | http://targetfinder.org/ |
References
- Schwarz, D., Rouphael, Y., Colla, G., Venema, J. H. Grafting as a tool to improve tolerance of vegetables to abiotic stresses: Thermal stress, water stress and organic pollutants. Scientia Horticulturae. 127, 162-171 (2010).
- Li, Y., et al. Mechanisms of tolerance differences in cucumber seedlings grafted on rootstocks with different tolerance to low temperature and weak light stresses. Turkish Journal of Botany. 39 (4), 606-614 (2015).
- Li, C. H., Li, Y. S., Bai, L. Q., He, C. X., Yu, X. C. Dynamic Expression of miRNAs and Their Targets in the Response to Drought Stress of Grafted Cucumber Seedlings. Horticultural Plant Journal. 2 (1), 41-49 (2016).
- Rouphael, Y., Cardarelli, M., Colla, G., Rea, E. Yield, mineral composition, water relations, and water use efficiency of grafted mini-watermelon plants under deficit irrigation. HortScience. 43 (3), 730-736 (2008).
- Savvas, D., et al. Interactive effects of grafting and manganese supply on growth, yield, and nutrient uptake by tomato. HortScience. 44 (7), 1978-1982 (2009).
- Aloni, B., Cohen, R., Karni, L., Aktas, H., Edelstein, M. Hormonal signaling in rootstock-scion interactions. Scientia Horticulturae. 127, 119-126 (2010).
- Rouphael, Y., Caradrelli, M., Rea, E., Colla, G. Improving melon and cucumber photosynthetic activity, mineral composition, and growth performance under salinity stress by grafting onto Cucurbita hybrid rootstocks. Photosynthetica. 50 (2), 180-188 (2012).
- Louws, F. J., Rivard, C. L., Kubota, C. Grafting fruiting vegetables to manage soilborne pathogens, foliar pathogens, arthropods and weeds. Scientia Horticulturae. 127 (2), 127-146 (2010).
- Asins, M. J., et al. Genetic analysis of rootstock-mediated nitrogen (N) uptake and root-to-shoot signalling at contrasting N availabilities in tomato. Plant Science. 263, 94-106 (2017).
- Yin, L. K., et al. Role of protective enzymes in tomato rootstocks to resist root knot nematodes. Acta Horticulturae. 1086 (1086), 213-218 (2015).
- Gaion, L. A., Carvalho, R. F. Long-Distance Signaling: what grafting has revealed?. Journal of Plant Growth Regulation. 37 (2), 694-704 (2018).
- Turnbull, C. G., Hennig, L., Köhler, C. Grafting as a research tool. Plant Developmental Biology. , 11-26 (2010).
- Li, C., et al. Grafting-responsive miRNAs in cucumber and pumpkin seedlings identified by high-throughput sequencing at whole genome level. Physiologia Plantarum. 151 (4), 406-422 (2014).
- Lakhotia, N., et al. Identification and characterization of miRNAome in root, stem, leaf and tuber developmental stages of potato (Solanum tuberosum L.) by high-throughput sequencing. BMC Plant Biology. 14 (1), 6 (2014).
- Jones-Rhoades, M. W., Bartel, D. P., Bartel, B. MicroRNAs and their regulatory roles in plants. Annual Review of Plant Biology. 57, 19-53 (2006).
- Puzey, J. R., Kramer, E. M. Identification of conserved Aquilegia coerulea microRNAs and their targets. Genetic. 448 (1), 46-56 (2009).
- Matthewman, C. A., et al. miR395 is a general component of the sulfate assimilation regulatory network in Arabidopsis. FEBS Letters. 586 (19), 3242-3248 (2012).
- Ali, E. M., et al. Transmission of RNA silencing signal through grafting confers virus resistance from transgenically silenced tobacco rootstocks to non-transgenic tomato and tobacco scions. Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology. 25 (3), 245-252 (2016).
- Li, Y. S., Li, C. H., Bai, L. Q., He, C. X., Yu, X. C. MicroRNA and target gene responses to salt stress in grafted cucumber seedlings. Acta Physiologiae Plantarum. 38 (2), 1-12 (2016).
- Pagliarani, C., et al. The accumulation of miRNAs differentially modulated by drought stress is affected by grafting in grapevine. Plant Physiology. 173 (4), 2180-2195 (2017).
- Liu, N., Yang, J. H., Guo, S. G., Xu, Y., Zhang, M. F. Genome-wide identification and comparative analysis of conserved and novel microRNAs in grafted watermelon by high-throughput sequencing. PLoS One. 8 (2), e57359 (2013).
- Song, G. Development of 2JC-350 automatic grafting machine with cut grafting method for vegetable seedling. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering. 22 (12), 103-106 (2006).
- Kumar, D., et al. Uncovering leaf rust responsive miRNAs in wheat (triticum aestivum l.) using high-throughput sequencing and prediction of their targets through degradome analysis. Planta. 245 (1), 1-22 (2016).
- Kohli, D., et al. Identification and characterization of wilt and salt stress-responsive microRNAs in chickpea through high-throughput sequencing. PLoS One. 9 (10), e108851 (2014).
- Salzberg, S. L. Computational challenges in next-generation genomics. International Conference on Scientific and Statistical Database Management. ACM. 2, (2013).
- Guo, S. G., et al. The draft genome of watermelon (Citrullus lanatus) and resequencing of 20 diverse accessions. Nature Genetics. 45, 51-58 (2013).
- Wang, Y., et al. Gourdbase: a genome-centered multi-omics database for the bottle gourd (lagenaria siceraria), an economically important cucurbit crop. Scientific Reports. 8 (1), 306 (2018).
- Wang, X. F., Liu, X. S. Systematic Curation of miRBase Annotation Using Integrated Small RNA High-Throughput Sequencing Data for C. elegans and Drosophila. Frontiers in Genetics. 2, 25 (2011).
- Bo, X. C., Wang, S. Q. TargetFinder: a software for antisense oligonucleotide target site selection based on MAST and secondary structures of target mRNA. Bioinformatics. 21 (8), 1401-1402 (2005).
- . GOATOOLS: Tools for Gene Ontology Available from: https://doi.org/10.5281/zenodo.31628 (2015)
- Wang, L. P., Li, G. J., Wu, X. H., Xu, P. Comparative proteomic analyses provide novel insights into the effects of grafting wound and hetero-grafting per se on bottle gourd. Scientia Horticulturae. 200 (8), 1-6 (2016).
