Summary
Vi beskriver detaljerede protokollen til design, simulering, våd-lab eksperimenter og analyse for en omkonfigurerbare DNA harmonika rack af 6 af 6 masker.
Abstract
DNA nanostrukturer-baserede mekaniske systemer eller DNA nanomaskiner, der producerer komplekse nanoskala bevægelse i 2D og 3D i nanometer ångström beslutning, viser stort potentiale inden for forskellige områder af nanoteknologi som de molekylære reaktorer, medicinafgivelse, og nanoplasmonic systemer. Den omkonfigurerbare DNA harmonika rack, som kan kollektivt manipulere en 2D eller 3D nanoskala netværk af elementer, i flere stadier i svar til DNA input, er beskrevet. Platformen har potentiale til at øge antallet af elementer, der DNA nanomaskiner kan styre fra et par elementer til en netværk skala med flere faser af omkonfiguration.
I denne protokol beskriver vi hele eksperimentelle processen med omkonfigurerbare DNA harmonika rack af 6 af 6 masker. Protokollen indeholder en design regel og simulation procedure af strukturerne og en våd-lab eksperiment for syntese og rekonfiguration. Derudover er analyse af strukturen ved hjælp af TEM (transmissions elektron mikroskopi) og FRET (Fluorescens resonans energioverførsel) medtaget i protokollen. De nye design og simulering metoder er omfattet af denne protokol vil hjælpe forskere at bruge DNA harmonika rack for yderligere programmer.
Introduction
Mekaniske systemer baseret på DNA-nanostrukturer eller DNA nanomaskiner1,2,3,4,5 er unikke, fordi de producerer komplekse nanoskala bevægelse i 2D og 3D i nanometer til Ångström resolution, ifølge forskellige Biomolekylær stimuli2,3,6. Ved fastgørelse funktionelle materialer på disse strukturer og kontrollere deres positioner, kan disse strukturer anvendes på forskellige områder. For eksempel har DNA nanomaskiner været foreslået for en molekylær reaktor7, drug delivery8og nanoplasmonic systemer9,10.
Tidligere introducerede vi den omkonfigurerbare DNA harmonika rack, som kan manipulere en 2D eller 3D nanoskala netværk af elementer11 (figur 1A). I modsætning til andre DNA nanomaskiner, der kun et par betjeningselementer, kan platformen kollektivt manipulere regelmæssigt klædt 2D eller 3D elementer i forskellige stadier. Vi forventer, at en programmerbar kemiske og biologiske reaktion netværk eller en molekylær computing system kan bygges fra vores system, ved at øge antallet af kontrollerbare elementer. DNA harmonika rack er en struktur, hvor netværk af flere DNA bjælker er tilsluttet samlinger består af enkeltstrenget DNA (figur 1B). Harmonika rack genereret af DNA bjælker er omkonfigureres af DNA-låse, som krydse til den klæbende del af bjælker og ændre vinklen mellem bjælker efter længden af den "passerelle" del af låse (låst tilstand). Derudover er flertrins omkonfiguration påvist ved at tilføje nye låse efter dannelsen af den frie tilstand ved at fjerne DNA låse gennem fodfæste-baserede strand forskydning12,13.
I denne protokol beskriver vi hele design og syntese processen med omkonfigurerbare DNA harmonika rack. Protokollen omfatter design, simulering, våd-lab eksperimenter og analyse for syntesen af DNA harmonika rack af 6 af 6 masker og en rekonfigurering af disse. Strukturen er omfattet af protokollen er den grundlæggende model af den tidligere forskning11 og er 65 nm ved 65 nm i størrelse, bestående af 14 bjælker. Med hensyn til design og simulering er den strukturelle design af harmonika rack forskellige fra konventionelle DNA origami14,15 (dvs. stramt pakket). Derfor er design regel og molekylær simulation blevet ændret fra traditionelle metoder. For at demonstrere, viser vi den design teknik ved hjælp af den modificerede tilgang af caDNAno14 og simulering af harmonika rack med yderligere scripts oxDNA16,17 . Endelig, begge protokoller TEM og FRET for analyse af konfigurerede harmonika rack strukturer er beskrevet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. design af 6 af 6 DNA harmonika Rack med caDNAno14
- Hent og Installer caDNAno 2.0 software14 for at designe et DNA harmonika rack (caDNAno 2,5 er også tilgængelig på https://github.com/cadnano/cadnano2.5). Åbn caDNAno14 og klik på Pladsen værktøj for at tilføje en ny del med et firkantet gitter.
- Nummerere hver stråle af harmonika rack og trække på venstre gitter panel af caDNAno14 (figur 2).
- Klik på blyantværktøjet og tegner hver bom på den rigtige redigeringspanelet på caDNAno14. Pause bjælker hver 32 bp, som er for leddene mellem tilstødende bjælker. Placere korte delefiltre i den samme position som leddene. Bruge Indsæt værktøj og Blyantværktøj i caDNAno14 for at lade leddene har yderligere enkeltstrenget delefiltre.
- Klik på Værktøjet Blyant og forbinde leddene. Hver bom har syv leddene.
- Generere stillads delefiltre hen til sammenlægge stilladser i enkelt loop ved hjælp af den tidligere rapporteret stillads routing algoritme11. Lad ikke den mindst bindende domæne mellem stillads og korte tråde være mindre end 8 bp (figur 3).
- Placere de stilladser, der ikke anvendes i forsamlingen på vertices placeret på modsatte sider af harmonika rack, som vist i figur 3.
- Klik på den bryde værktøj. Bryde de tråde hvor korte tråde er cirkulære eller længere end 60 bp.
- Design DNA lock delområder.
- Klik på den bryde værktøj. Pause 8 bp af en korte DNA region til at foretage en klæbrig del og slette 8 bp i en korte DNA-regionen. Der er 18 sticky dele (figur 1) i 6 af 6 harmonika rack.
- Placer sekvenser, der er omvendt supplerer de klistrede dele i begge ender af lock delområder og forbinde dem ved en "passerelle" region, som består af poly T dele af den ønskede længde (figur 1B).
- For omkonfiguration, tilføje 8 bp fodfæste sekvenser i slutningen af DNA låser for strand forskydning. Den fodfæste sekvens anvendes er i tabel 2.
- Forberede poly A tråde, der er omvendt supplement til regionen "passerelle".
- Design dele, der er omvendt supplement til DNA låse til omkonfiguration eksperiment.
- Sekvens Tool og klik på stillads DNA. Vælg stillads som standard M13mp18. Klik Eksportværktøj og gemme sekvens i CSV-format (tabel 1).
2. Simuler struktur med oxDNA
- Hent og Installer oxDNA16,17. Den seneste kildekode er tilgængelig på https://sourceforge.net/projects/oxdna/files/.
- Gøre start konfigurationsfiler fra filen caDNAno14 ved hjælp af python script 'cadnano_interface.py', som er fastsat i pakken oxDNA16,17 . Brugen er som følger: 'python cadnano_interface.py cadnano_file.json sq'. Topologi fil og konfigurationsfilen er nu oprettet.
Bemærk: Filen topologi omfatter hvor mange tråde og nukleotider i struktur og oplysninger om backbone-rygraden obligationer mellem nukleotider. Konfigurationsfilen indeholder generelle oplysninger såsom timestep, energi og boksens størrelse. Orientering oplysninger som position vektor, backbone-base vektor, normal vektor, hastighed og vinkelhastighed af nukleotider er også inkluderet (figur 4). - Ændre oplysninger i filen topologi og konfiguration fra caDNAno14 så de afspejler de reelle strukturelle oplysninger af harmonika rack. Alle bjælker er arrangeret parallelt når topologi og konfiguration filerne fra caDNAno14 er visualiseret. Men den harmonika rack er en gitterstruktur så afstanden mellem agglomererede nukleotider er langt til simulation (figur 5).
- Rotere og flytte hver bjælke til den ønskede gitterstruktur. De ni kolonner til venstre i konfigurationsfilen er holdning vektor, backbone-base vektor og normal vektor (figur 4). Hvis du vil rotere en stråle, rotere alle holdning, backbone-base, og normal vektorer ved hjælp af roterende transformation. Derefter flytte en stråle ved at ændre holdning vektor for at finde det som vist i figur 5.
- Slappe af strukturen ved hjælp af scriptet i pakken oxDNA (se eksempel i $oxDNA/eksempler/RELAX_INITIAL_CONFIGURATION for yderligere oplysninger).
- Køre Molekylær dynamik simulering for ti millioner trin ved hjælp af den afslappede konfigurationsfil. Brugen er som følger:». / oxDNA < input >' gemme data hver 5000 eller 10000 skridt.
- Visualisering
Bemærk: Strukturerne blev visualiseret ved hjælp af cogli.- Hent og Installer den nyeste version af cogli (https://sourceforge.net/projects/cogli1/).
- Opstille cogli med topologi og konfiguration filer fra oxDNA simulering. Brugen er som følger:». / cogli1 -t < topologi fil >< konfigurationsfil >'.
- Skjule boksen ved at trykke på b.
3. Sammenfatning af strukturen
Bemærk: Metoden syntese er tilpasset fra den tidligere protokol15,18.
- Køb designet DNA hæfteklammer fra en oligonukleotid udbyder.
- Justere koncentrationen af disse DNA hæfteklammer til 100 μM bruger nukleasen-gratis vand.
- Pool hver DNA-streng, der udgør en 'free state' struktur ind i et rør og justere koncentrationen til 2 μM for hver linje.
- Pool DNA lås strenge af længden og antallet af låse sites i rør og justere koncentrationen til 2 μM for hver linje. 18, 9 og 4 lås websteder bruges. Tilføje poly A tråde, som supplerer passerelle regionen på den samme fusion.
- Pool-strenge, der er omvendt supplement til DNA låse strenge af længden i rør og justere koncentrationen til 2 μM for hver linje.
- Forberede MgCl2 løsning på 300 nM ved at blande 70 μL nukleasen-gratis vand og 30 μL af 1 μM MgCl2 løsning. Forbered en 5 x Tris EDTA-oploesning ved at blande 95 μL nukleasen-gratis vand og 5 μL 100 x Tris EDTA-oploesning.
- Tilsæt 2 μl af korte DNA, 1,1 μL MgCl2 løsning, 2 μl af Tris EDTA-oploesning, 7,6 μL nukleasen-gratis vand og 7,3 μL af stillads DNA som koncentrationen er 110 nM at gøre 20 μL af blandet materiel. Angiv den endelige koncentration af stillads DNA til 40 nM, hæfte DNA til 200 nM, MgCl2 til 16 mM og Tris EDTA-oploesning til 0,5 x.
- Hurtigt varme blandet stamopløsningen en termisk cycler til 80 ° C og kølig til 60 ° C med en hastighed på 4 min pr. ° C og cool fra 60 ° C til 4 ° C med en hastighed på 40 min. pr. ° C.
4. rensning af strukturen
Bemærk: Prøver af alle strukturer blev renset før analyse. I dette afsnit beskriver vi protokollen af PIND rensning, som er tilpasset fra tidligere litteratur19. Prøven kan også renses ved gelelektroforese, som beskrevet i tidligere litteratur15,18.
- Forberede 5 M af NaCl og 100 x Tris-EDTA.
- Forberede nedbør-buffer ved at blande 150 μl af PLØK 8000, 500 μL 100 x Tris EDTA og 101 μL af 5 M NaCl og 249 μL nukleasen-gratis vand.
- Forberede target-buffer ved at blande 5,5 μL af 300 nM MgCl2 løsning fra afsnit 3.3, 10 μL 5 x Tris EDTA-oploesning fra afsnit 3.3 og 84.5 μL nukleasen-gratis vand.
- Mix 20 μL af syntetiserede struktur fra afsnit 3 og 20 μL af nedbør-buffer fra afsnit 4.2. Derefter spin blandet bestanden på 16000 x g ved 4 ° C. Fjern supernatanten og opløse pellet i target-bufferen fra afsnit 4.3.
5. omkonfiguration af harmonika Rack fra en fri stat til en "låst tilstand"
- Syntetisere struktur uden DNA låse til konfiguration eksperiment.
- Forberede DNA lock delområder fra afsnit 3.
- Tilføj 2 μl DNA lock delområder af den ønskede længde ind i 20 μL af den syntetiserede struktur. DNA lock delområder koncentration er fem gange højere end struktur.
- Inkuber prøve for 0, 10, 25, 50 eller 100 minutter at se hvor hurtigt omkonfiguration opstår.
- Til 100 minutters inkubation, Inkuber sample ved 50 ° C i 30 minutter og langsomt køle ned til 25 ° C med en hastighed på 0,33 ° C/minut.
- Til 50 minutters inkubation, inkuberes sample ved 50 ° C i 15 minutter og langsomt køle ned til 25 ° C med en hastighed på 0,66 ° C/minut.
- For 25 minutters inkubation, inkuberes sample ved 50 ° C til 7,5 minutter og langsomt køle ned til 25 ° C med en hastighed på 1.32 ° C/minut.
- Til 10 minutters inkubation, inkuberes sample ved 50 ° C i 3 minutter og langsomt køle ned til 25 ° C med en hastighed på 3,3 ° C/minut.
- Til 0 minutters inkubation, store prøve på 4 ° C lige efter DNA låser tråde er tilføjet.
- Lige efter trinnet montering hurtigt afkøle prøven til 4 ° C for at forhindre uønskede denaturering.
6. omkonfiguration af harmonika Rack fra en "låst tilstand" til en fri stat
- Syntetisere struktur med DNA låser i den ønskede længde for konfiguration eksperiment.
- Forberede omvendt supplerende tråde fra afsnit 3.
- Tilføj 2 μl af tråde, der er omvendt supplerer lock delområder af den ønskede længde ind i 20 μL af den syntetiserede struktur. DNA lock delområder koncentration er fem gange højere end struktur.
- Inkuber prøve for 0, 12, 60, 120, 240 minutter at se hvor hurtigt omkonfiguration opstår.
- For 12, 60, 120, 240 minutters inkubation, hurtigt opvarmes prøven til 40 ° C og langsomt afkøles til 20 ° C for tiden svarer til hver. Lige efter fjernelse trin hurtigt afkøle prøven til 4 ° C for at forhindre uønskede denaturering.
- Til 0 minutters inkubation, gemme prøve 4 ° C til højre efter reverse supplerende tråde er tilføjet.
7. TEM Imaging
Bemærk: TEM imaging protokol var tilpasset fra tidligere litteratur18,20.
- Forberede 1,25 M NaOH-opløsning ved at blande 87,5 μL nukleasen-gratis vand og 12,5 μl 10 M NaOH-opløsning.
- Tilføje 1 μL af 1,25 M NaOH-opløsning til 50 μL af 2% uranyl formate løsning.
- Vortex løsning for 3 minutter, og der centrifugeres ved max hastighed i 3 minutter. Depositum 3 μL af den oprensede prøve på gitteret glød-udledes TEM i 3 minutter og hurtigt vaske ud med filtrerpapir.
- Indbetale 7 μL af rede uranyl formate løsning for 30 sekunder og hurtigt vaske ud med filtrerpapir.
- Måle længden og vinklen på harmonika struktur afbildet af TEM.
8. FRET analyse
- Bruge Atto 550 og Atto 647N farvestof, som Förster afstanden er 6,5 nm. Erstatte korte 58 og korte 117 i tabel 1 med fluorescently mærket tråde. Derefter syntetisere struktur med fluorescently mærket tråde af metoden beskrevet i afsnit 3.
- Mål koncentrationen af renset prøven.
- Normalisere 10 nM og belastning 50 μl til de 384 mikroplader prøven godt.
- Excite prøve med donor og acceptor farvestoffer på 550 nm og foranstaltning fluorescens spektrum fra 570 nm til 800 nm med en fluorometer.
- Måle fluorescens spektrum af donor-kun prøven på samme måde.
- Excite farvestoffer i eksemplet på 650 nm og fluorescens spektrum og foranstaltning fra 670 nm til 800 nm. Dette er at måle koncentrationen af acceptoren.
- Få standardafvigelser ved at gentage det samme eksperiment med tre prøver, der er syntetiseret og renset separat.
- Beregne FRET effektivitet med forholdet en metode, som beskrevet af ligning under21.
DA550: Acceptor peak fluorescens intensiteten af prøven med donor og acceptor på 550 nm excitation.
D550: fluorescens intensitet på rækken acceptor emission af donor-kun prøven på 550 nm excitation.
DA650: Acceptor peak fluorescens intensiteten af prøven med donor og acceptor på 650 nm excitation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Designet 6 af 6 DNA harmonika rack er simuleret fra oxDNA16,17 , og resultaterne er vist i figur 6. Fra simuleringen resultatet, blev det bekræftet, at den tilsigtede struktur er dannet uden forvrængning af strukturen.
TEM billeder i figur 7 er billeder af konfigurerede strukturer med en lås længde på 2, 8, 13 og 20 bp. På billedet, er vinklen af strukturer (figur 8A) faldt som længden af låsen bliver længere. For statistisk at analysere tendensen, blev gennemsnittet og standardafvigelse af vinkel (figur 8A) af flere konfigurerede strukturer indhentet (fig. 8B). Også, FRET måleresultater viser strukturændringer og dens hastighed, ud over den strukturelle tendens vist i TEM billede (fig. 8 c).
Fra disse analyse procedurer, karakterisering af DNA harmonika rack såsom hvor mange sluser der er behov for strukturelle konfiguration og rekonfiguration hastighed var fastsat.
Figur 1. En omkonfigurerbare DNA harmonika rack. A. The DNA harmonika rack er sammensat af stive DNA bjælker og flere fleksible leddene, som forbinde hver bom. Harmonika rack er konfigureret forskelligt efter længden af DNA låse. Forskellige 2D og 3D platforme kan designes ved at ændre platformen. B. omkonfiguration af DNA harmonika rack er opnået med hybridisering af DNA låse med forskellige længder. I 'fri form' strukturen, når ekstra nukleotider tilsættes til delefiltre (eller leddene, gul), kan på grund af en løs forbindelse mellem DNA bjælker (bestående af to helices), vinklen ændres (øverste del). Hybridisering af DNA låse med forskellige længder af broen del at den klæbende del af både tilstødende bjælker genererer "låst tilstand" (lavere del). Strand forskydning ved hjælp af fodfæste dele (blå) af DNA låse med brændstof strand løsrive DNA låse fra låste staten struktur og ændre tilstand til den gratis. Ved at gentage processen med forskellige biblioteker af DNA låse, omkonfigureres strukturen med forskellige vinkler. Dette tal er blevet ændret fra den tidligere forskning11. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. 6 af 6 harmonika rack er designet ved hjælp af caDNAno. De 14 stråler af DNA harmonika rack er nummereret og trukket på panelet gitter i caDNAno. Dette tal er blevet ændret fra den tidligere forskning11. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Stillads routing algoritme. A. stillads, ikke som anvendes i forsamlingen på vertices placeret på modsatte sider af harmonika rack. B. syv lukkede kredsløb flettes til en enkelt løkke ved at generere stillads delefiltre. Mindst seks stillads delefiltre point er nødvendige og placeringen af stillads delefiltre er tilpasset fra tidligere litteratur. Dette tal er blevet ændret fra den tidligere forskning11. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Eksempel på en konfigurationsfil. Konfigurationsfilen indeholder generelle oplysninger såsom timestep, energi og boks størrelsen og retningen oplysningerne. De ni kolonner til venstre i konfigurationsfilen er henholdsvis holdning vektor, backbone-base vektor og normal vektor. Seks kolonner til højre er hastigheder og kantede hastigheder. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Visualisering af konfigurationsfilen før og efter ændringen. Position, backbone-base, og normal vektor er blevet ændret ved hjælp af roterende transformation for at gøre oplysningerne i konfigurationsfilen afspejle den strukturelle oplysninger af harmonika rack. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. Simulering resultatet fra oxDNA. Harmonika rack med DNA låse, hvoraf længderne er 2, 8, 13 og 20 bp, blev simuleret. 18 låsning websteder blev brugt. En 6 af 6 harmonika rack med en DNA låse som længden er A 2 bp, B 8 bp, C 13 bp og D 20 bp simuleres ogvisualiseret ved cogil. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7. TEM billeder af konfigurerede 6 af 6 DNA harmonika stativer. Strukturer med lås længder A 2 bp, B 8 bp, C 13 bp og D 20 bp var afbildet. 18 låsning websteder blev anvendt til dette eksperiment. (skalalinjen: 100 nm). Dette tal er blevet ændret fra den tidligere forskning11. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8. Vinkel kontrol af 2D harmonika rack. Vinklen på harmonika rack består af 6 af 6 masker var kontrolleret af længden af DNA låse. A. ved at tilføje DNA låse med længder på 2, 8, 13 og 20 bp til de 18 låsning steder af harmonika rack, vinkel (blå) er konfigureret som det ses i de repræsentative TEM billeder. Dye par, Atto647N og Atto550 er knyttet til strukturen for FRET effektivitetsanalyse. (skalalinjen: 100 nm) B. fordelingen af de konfigurerede vinkler. Overlejres tendenslinje (grey) er fra grafen for den 1 Lås pr. 2 masker. Derudover svarer gitter af x-aksen til det samme gitter på grafen for den 1 Lås pr. 2 masker. Søjler repræsenterer én standardafvigelse fra den gennemsnitlige vinkel. C. fordelingen af FRET effektivitetsgevinster. Søjler repræsenterer én standardafvigelse fra den gennemsnitlige effektivitet. D. ÆRGRE effektivitet ændring, mens staten skiftet fra gratis til låst eller omvendt blev målt efter forskellige inkuberingstider. DNA-lås med længden af 2 bp blev brugt. Søjler repræsenterer én standardafvigelse fra den gennemsnitlige effektivitet. Dette tal er blevet ændret fra den tidligere forskning11. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Navn | Sekvens | Længde | |||
| Hæfte 1 | ATAAGAGGTCATTTTTGCGGATGGATGTTACT | 32 | |||
| Hæfte 2 | CAAAGTTACCAGAAGGAAACCGAGACATCGGG | 32 | |||
| Hæfte 3 | ACAATGAAATAGCAATAGCTATCTCAAATAAA | 32 | |||
| Korte 4 | CGCTAATATGAACGGTGTACAGACCAGGCGCATAGGCTGGGAACAAAGTCAGAGGG | 56 | |||
| Korte 5 | CAGAAAACCCGGAATAGGTGTATCACCGTACTCAGGAGGTCCCCCTCAAATGCTTT | 56 | |||
| Korte 6 | AGTGAGAATAGAAAGGTATGATATTCAACCGTTCTAGCTGATAAATTATCAACAGT | 56 | |||
| Hæfte 7 | ATTTGGGGCGCGAGCTATATGGTT | 24 | |||
| Korte 8 | GCCTTTATTTCAACGCAAGGATAATTAATGGA | 32 | |||
| Korte 9 | TCAATTACCCACTACGAAGGCACCGGTAAAAT | 32 | |||
| Korte 10 | ATTCAGTGAATAAGGCTTGCCCTGAAAACAGA | 32 | |||
| Korte 11 | AGAAACAATAACGGATTCGCCTGATAGCCGAA | 32 | |||
| Korte 12 | ATCAATATCTGGTCAGTTGGCAAAAGTAACAA | 32 | |||
| Korte 13 | CGGAGACAGTCAAATCACCATCAAGGGTTAGA | 32 | |||
| Korte 14 | GAGAATTAACTGAACACGAAACAAAGTACAACGGAGATTTGTATCATCGAAGCGCA | 56 | |||
| Korte 15 | CGAGAGGGTTGATATAAGTATAGCATAGGAAC | 32 | |||
| Korte 16 | CCCTTATTAGCGTTTGCCATCTTTTGGTGCCG | 32 | |||
| Korte 17 | GTTTTCATCGGCATTTATGCCGGA | 24 | |||
| Korte 18 | GTAGCAACTTCCAGTAAGCGTCATGTCTCTGA | 32 | |||
| Korte 19 | AGCTAATGCAGAACGCAATAAACA | 24 | |||
| Korte 20 | CCGTAATGGGATAGGTCACGTTGGGCCTATTT | 32 | |||
| Korte 21 | ACCAGAGCCACCACCGCGAGAGGC | 24 | |||
| Korte 22 | AGGCTCCAAAAGGAGCCGTTTACCAGACGACGATAAAAACCAAAATAGAAAATCTC | 56 | |||
| Korte 23 | GCCGGAAGGAAACGCAATAATAACGGAATACCCAAAAGAACTCACAATTCCACACA | 56 | |||
| Korte 24 | TTTTTCACCGGTGTCTGGAAGTTTCATTCCATATAACAGTACTAAAGGAATTGCGA | 56 | |||
| Korte 25 | ATCAGGTCTTTACCCTCGCATTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTGACCATA | 56 | |||
| Korte 26 | TGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTGACATTCA | 32 | |||
| Korte 27 | AATAAAGAAATTGCGTAGATTTTCAGCTGCTC | 32 | |||
| Korte 28 | CCCAATCCTCGCACTCCAGCCAGCTTTCCGGCACCGCTTCAAAATAAACAGCCATA | 56 | |||
| Korte 29 | AAAGACTTCAAATATCATCAAAAGAATAGCCCGAGATAGGGTTGAGTGATTAAGAG | 56 | |||
| Korte 30 | GTAGCGACAGAATCAAGTTTGCCTGATTTAGA | 32 | |||
| Korte 31 | GCCACCCTCAGAACCGCCACCCTCAACAAGAG | 32 | |||
| Korte 32 | AAGCAAGCCGTTTTTATTTTCATCTCCTGATT | 32 | |||
| Korte 33 | GAGGGTAGCTATTTTTGAGAGATCCGTCAGAC | 32 | |||
| Korte 34 | TATGACCCTGTAATACTCCCATCCTAATTTACGAGCATGTAGAAACCAGTTGTACC | 56 | |||
| Korte 35 | GATTAGAGAGTACCTTAACAGTGCCCGTATAAACAGTTAATGCCCCCTAACTCCAA | 56 | |||
| Korte 36 | CGTCTTTCCAGACGTTGTAGGAATCATTACCGCGCCCAATAGCAAGCACGATCTAA | 56 | |||
| Korte 37 | TTTAACGTCAAAAATGAGTGAGACGGGCAACAGCTGATTGCCCTTCACAAGAAACG | 56 | |||
| Korte 38 | TTTAACGGGGTCAGTGCCTTGAGTATAAGGGA | 32 | |||
| Korte 39 | AATTGTGTGCAAAATCCCTTATAAGGTGGTTC | 32 | |||
| Korte 40 | ACCAGTAGCACCATTACCATTAGCTTTCAGGG | 32 | |||
| Korte 41 | AAACATCAAGAAAACAAAATTAATTCACATTA | 32 | |||
| Korte 42 | TTGGCCTTGATATTCATCATCTTT | 24 | |||
| Korte 43 | TGCATCAATCAACAGTTGAAAGGAATTGAGGAAGGTTATCATTATAGTCAGAAGCA | 56 | |||
| Korte 44 | GCCCCAGCAGGCGAAAATCCTGTTAGGGGACG | 32 | |||
| Korte 45 | TCCTCATTAAAGCCAGAATGGAAAAGCAAGAA | 32 | |||
| Korte 46 | GAGCCTAATTTGCCAGGGGGGTAATAGTAAAATGTTTAGACTGGATAGAACGAGCG | 56 | |||
| Korte 47 | TAAGAGCAACACTATCATAACCCTTTAACGTC | 32 | |||
| Korte 48 | ATAGCAAGCCCAATAGGAACCCATGCAAAATC | 32 | |||
| Korte 49 | CATAAAAACTTAGAGCTTAATTGCTGAATATAATGCTGTATAGCAGCCTTTACAGA | 56 | |||
| Korte 50 | ATTTACCGGGCTACAGAGGCTTTGGAACGAGG | 32 | |||
| Korte 51 | GTGCCTAATGAGTGAGAATGCAGATACATAACGCCAAAAGGAATTACGAAGTGTAA | 56 | |||
| Korte 52 | ATACCGATAGTTGCGCATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTTTCTTAA | 56 | |||
| Korte 53 | ATAACCGATACCGAAGCCCTTTTTAAGAAAAGTAAGCAGAAATGACAACAACCATC | 56 | |||
| Korte 54 | TCAGAGCCGCCACCCTCAGAACCGGCTCAACA | 32 | |||
| Korte 55 | TTTTGCAAAAGAAGTTTTGCCAGAAATCAAAA | 32 | |||
| Korte 56 | GGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTAAGAAACC | 32 | |||
| Korte 57 | ACATGTTCAAAGACACCACGGAATCATATAAA | 32 | |||
| Korte 58 | CTGTGTGAAATTGTTAGAGTAATGTGTAGGTAAAGATTCAAAAGGGTGTGGTCATA | 56 | |||
| Korte 59 | TTTCGAGGCCGGATATTCATTACCCAAATCAACGTAACAAAATTGTATCGGTTTAT | 56 | |||
| Korte 60 | CTTTAGGAGCACTAACAACTAATAAGCCCCAA | 32 | |||
| Korte 61 | AGATTAGTTGCTATTTTACAAAGGCTATCAGGTCATTGCCTGAGAGTCTTGAAGCC | 56 | |||
| Korte 62 | GAGCCGCCGCCAGCATTGACAGGACTGACCTT | 32 | |||
| Korte 63 | GAAACCAGGCAAAGCGCCATTCGCTCATAGCC | 32 | |||
| Korte 64 | CATCAAGAGTAATCTTGACAAGAACACCACCA | 32 | |||
| Korte 65 | AACCTTGCTTCTGTAAATCGTCGCTTATCAAC | 32 | |||
| Korte 66 | TAGTTAGCGACAACTCGTATTAAATCCTTTGCCCGAACGTGTAGCATTCCACAGAC | 56 | |||
| Korte 67 | ACCGATTGAGGGAGGGAAGGTAAAGGGGGATG | 32 | |||
| Korte 68 | TACCAGCGCCAAAGACAAAAGGGCGTTTAGCT | 32 | |||
| Korte 69 | TCATATATTTTAAATGCAATGCCTAAAACGAA | 32 | |||
| Korte 70 | ACATTATCATTTTGCGTATTGACG | 24 | |||
| Korte 71 | CGGAACCTATTATTCTGAAACATGCGGATTGA | 32 | |||
| Korte 72 | CCTGAGAGATATTTTGTTAAAATTTAAATTGT | 32 | |||
| Korte 73 | GAAACCATCGATAGCAAATCAGAT | 24 | |||
| Korte 74 | CTCAGAGCCGCCACCATATTGGGC | 24 | |||
| Korte 75 | CACCGACTTGAGCCATTTGGGAATACACTGAG | 32 | |||
| Korte 76 | TCATGAGGAAGTTTCCATTAAACGTTTGCGGG | 32 | |||
| Korte 77 | AAACAGGAAGATTGTATAAGCAAATAAAATAT | 32 | |||
| Korte 78 | ATCGTCACCCTCAGCAGCGAAAGAAGACTTTT | 32 | |||
| Korte 79 | ATCAACATTAAATGTGTTGTTCCA | 24 | |||
| Korte 80 | TGCAGGGAGTTAAAGGAACGAAAGAGGCAAAAGAATACACTAAAACACTTCGGTCG | 56 | |||
| Korte 81 | ACGTAATGCTGAGCAAAAGAAGATTATTCATT | 32 | |||
| Korte 82 | AATCGATGAACGGTAATCGTAAAATTAGTACC | 32 | |||
| Korte 83 | GACCCCCAGCGATTATACCAAGCGGAGGCAGG | 32 | |||
| Korte 84 | CGAAATCCGCGACCTGGCCTGATA | 24 | |||
| Korte 85 | GCCATCAAAAATAATTCGCGTCTGAGTGCCGT | 32 | |||
| Korte 86 | TCGGCTGTCTTTCCTTATCATTCCATTACCTT | 32 | |||
| Korte 87 | CAGACCGGGGGCGCATCGTAACCGTGCATCTGCCAGTTTGTTTAATTCGAGCTTCA | 56 | |||
| Korte 88 | GTTTGGAACAAGAGTCCACTATTACCTGTAGC | 32 | |||
| Korte 89 | AACAGTACATAAATCAATATATGTCGGGAGAA | 32 | |||
| Korte 90 | GACGTTGGGAAGAAAAATCTACGTCTGGCATG | 32 | |||
| Korte 91 | CAAAATCGCGCAGAGGCGGGAAAC | 24 | |||
| Korte 92 | ATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTGATGAAAC | 32 | |||
| Korte 93 | CCCCGGTTGATAATCACGTCCAAT | 24 | |||
| Korte 94 | ATGCCTGCAGGTCGACAAGAACGGGTATTAAACCAAGTACCGCACTCACCAGTGCC | 56 | |||
| Korte 95 | GTTTGGATTATACTTCTGAATAATTGATTCCC | 32 | |||
| Korte 96 | ACCGAACTGACCAACTTTGAAAGATAATAAGT | 32 | |||
| Korte 97 | GCCAGGGTGGTTTTTCTTTTCACCCCTCAGAG | 32 | |||
| Korte 98 | CAGTTGAGATTTAGGAATACCACATACATTTA | 32 | |||
| Korte 99 | TAGCCGGAACGAGGCGCAGACGGTTCCTTTTG | 32 | |||
| Korte 100 | AGTATTAGACTTTACAAACAATTCCGTAATCA | 32 | |||
| Korte 101 | CTTGCGGGAGAACCGCCACCCTCAGAGCCACCACCCTCATGAGGCGTTTTAGCGAA | 56 | |||
| Korte 102 | TTAAGAACTGGCTCATATCAATAA | 24 | |||
| Korte 103 | CATACAGGCAAGGCAAAGAATTAGAAGTTTAT | 32 | |||
| Korte 104 | ATTGAGTTAAGCCCAAACATGGCTTTTGATGATACAGGAGTGTACTGGGAGATAAC | 56 | |||
| Korte 105 | ATAGAAGGCTTATCCGGTATTCTACGGAAACG | 32 | |||
| Korte 106 | CTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGATTTGAATA | 32 | |||
| Korte 107 | CTTACCAAGATTAGAGCCGTCAATAGATAATACATTTGAGCCCAGCTACAATTTTA | 56 | |||
| Korte 108 | ACCTTGCTGAACCTCAAAAGTATTAAGAGGCTGAGACTCCTCAAGAGAAAAAATCT | 56 | |||
| Korte 109 | TTTGTCACAATCAATAGAAAATTCCAATAAAT | 32 | |||
| Korte 110 | CAATTCTATTCAACTTTAATCATTCTTGAGAT | 32 | |||
| Korte 111 | ACGACAGTATCGGCCTCAGGAAGAGCTGGTTT | 32 | |||
| Korte 112 | ACTGCGGAATCGTCATAAATATTCATGTCAAT | 32 | |||
| Korte 113 | TTTCGTCACCAGTACAAACTACAAATCACCGT | 32 | |||
| Korte 114 | AATTCTGCGAACGAGTAGATTTAGTCCTGATT | 32 | |||
| Korte 115 | GAAATTATTCATTAAAGGTGAATTTTTAAAAG | 32 | |||
| Korte 116 | ACCAGAAGGAGCGGAATTATCATCTCGGTGCG | 32 | |||
| Korte 117 | AATTCGTAACGAGAAACACCAGAACGAGTAGTAAATTGGGGAGGATCCCCGGGTAC | 56 | |||
| Korte 118 | ATTAAGACTCCTTATTACGCAGTACCAGTCAG | 32 | |||
| Korte 119 | GGTTTAATCTAATAGTAGTAGCATGGTGGCAT | 32 | |||
| Korte 120 | AAACCGTCTTAGCGGGGTTTTGCTCAGTACCAGGCGGATATGGACTCCAACGTCAA | 56 | |||
| Korte 121 | TATCAAAATTATTTGCAGAAAGGC | 24 | |||
| Korte 122 | ACAACATTATTACAGGTAGAACCC | 24 | |||
| Korte 123 | CCCGTCGGATTCTCCGTGGGAACAAACCCTCA | 32 | |||
| Korte 124 | ACAATTTCATTTGAATTACCTTTTAGATTCAT | 32 | |||
| Korte 125 | GCTAAACACATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGAAATGAATTTTCTGTAT | 56 | |||
| Korte 126 | AATAGATAAGTCCTGAACAAGAAAGAGTGAAT | 32 | |||
| Korte 127 | AAAGCTAATGTTAGCAAACGTAGAAAATACATACATAAAGTTAAGCAATAAAGCCT | 56 | |||
| Korte 128 | TGTTTTAAATATGCAACTAAAGTACGCCTCCC | 32 | |||
| Korte 129 | ATACAGTAACAGTACCAGGCATAG | 24 | |||
| Korte 130 | GTAAAACGTTTGACCATTAGATACATTTCGCAAATGGTCACAGGGTTTTCCCAGTC | 56 | |||
| Korte 131 | AGTTGCAGCAAGCGGTCGCCTGGC | 24 | |||
| Korte 132 | ATGGCAATTCATCAATTCGAGAAC | 24 | |||
Tabel 1. Sekvens af korte tråde
| Navn | Sekvens |
| Toehold_1 | AGAAGTCG |
| Toehold_2 | AGGTATGG |
| Toehold_3 | CTCCACTC |
| Toehold_4 | GTGTCCGA |
| Toehold_5 | AAGTAGAC |
| Toehold_6 | GAGTCGCT |
| Toehold_7 | AGTGTCTA |
| Toehold_8 | GTATCGTG |
| Toehold_9 | CATCACAG |
| Toehold_10 | CGAGACTT |
| Toehold_11 | ACGGACGA |
| Toehold_12 | GCCTACTC |
| Toehold_13 | GATGTGGA |
| Toehold_14 | GCGTGCGT |
| Toehold_15 | GTGGACAA |
| Toehold_16 | TACGACTG |
| Toehold_17 | CAGCCGTG |
| Toehold_18 | TGCCGCAT |
Tabel 2. Fodfæste sekvens for strand forskydning eksperiment
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol indfører hele processen fra design, simulering, syntese og analyse af den grundlæggende 2D DNA harmonika rack. Den modificerede design og simulering regler er blevet beskrevet fordi design reglen adskiller sig fra standard DNA origami, DNA harmonika rack har yderligere nukleotider på delefiltre for fleksibilitet14,15. Fra dette forventer vi, at protokollen kan accelerere forskellige forsker ved hjælp af DNA harmonika stativer. Derudover kan beskrives protokollen også anvendes til andre forskning ved hjælp af DNA-nanostrukturer i stedet for standard DNA-origami.
For strukturer end 2D grundstruktur demonstreret i den oprindelige forskning papir, kan design gøres med ændringer af den beskrevne protokol. Kort sagt, er en boksning-handske-foråret struktur designet af skiftende beam antallet og længden af den grundlæggende model. 3D nanotubular strukturer kan også skabes ved at forbinde begge ender af en 2D harmonika rack struktur. Dog til simulering af 3D strukturer, den oprindelige holdning af bjælker bør overvejes i 3D-rum og bjælker starttilstand formodes at være bøjet. Derfor er mere beregningsmæssige forandring nødvendig. Design og simulering af forskellige 2D og 3D DNA harmonika rack strukturer vil blive gennemført ved at udvikle programmet computerstøttet fremover forskning.
Hastighed og repeterbarhed af aktivering er også vigtige faktorer inden for dynamic DNA-nanoteknologi. Seneste dynamisk DNA strukturer, der reagerer på eksterne elektriske eller magnetiske felt er foreslået og drives med høj hastighed22,23. Mens DNA harmonika rack har aktiveret kollektive aktivering af flere DNA bjælker, var omkonfiguration hastighed ikke væsentligt forbedret siden aktivering er baseret på DNA streng forskydning. For yderligere programmer, bør svar på eksterne stimuli forbedres ved at optimere DNA lås design eller bruge en anden ydre stimuli.
Som en ansøgning undersøgelse for omkonfigurerbare harmonika struktur, forskellige funktionelle materialer såsom drug molekyler, kan nanopartikler eller proteiner knyttes til strukturen. For dette, kan molekyler tilsluttes til de korte, der findes ved den ønskede position. Samlet set kan en bred vifte af ansøgning undersøgelser gennemføres via denne protokol og dens ændringer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at videregive
Acknowledgments
Denne forskning blev delvist støttet af den globale forskning Development Center Program gennem den nationale forskning fundament af Korea(NRF) finansieret af Ministeriet for videnskab og IKT (MSIT) (2015K1A4A3047345) og Nano· Materielle teknologi Development Program gennem National Research Foundation af Korea (NRF) finansieret af Ministeriet for videnskab og IKT (MSIT) (2012M3A7A9671610). Institute of Engineering Research på Seoul National University forudsat forskningsfaciliteter til dette arbejde. Forfatterne anerkender taknemmelighed mod Tae-unge Yoon (biologiske videnskaber, Seoul National University) vedrørende fluorescens spektroskopi til FRET analyse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| M13mp18 Single-stranded DNA | NEB | N4040s | |
| 1M MgCl2 Solution | Biosesang | M2001 | |
| Tris-EDTA buffer | Biosesang | T2142 | |
| Nuclease-Free Water | Qiagen | 129114 | |
| 5M Sodium Chloride solution | Biosesang | s2007 | |
| PEG 8000 | Sigma Aldrich | 1546605 | |
| 10N NaOH | Biosesang | S2038 | |
| Uranyl formate | Thomas Science | C993L42 | |
| Thermal cycler C1000 | Biorad | ||
| Nanodropic 2000 | Thermo Fisher Scientific | ||
| TEM (LIBRA 120) | Carl Zeiss | ||
| Fluorometer Enspire 2300 | Perkin-Elmer | ||
| Centrifuge | Labogene | LZ-1580 |
References
- Andersen, E. S., et al. Self-assembly of a nanoscale DNA box with a controllable lid. Nature. 459 (7243), 73-76 (2009).
- Cha, T. -G., et al. Design principles of DNA enzyme based walkers: Translocation kinetics and photo-regulation. Journal of the American Chemical Society. 137 (29), 9429-9437 (2015).
- Gerling, T., Wagenbauer, K. F., Neuner, A. M., Dietz, H. Dynamic DNA devices and assemblies formed by shape-complementary, non-base pairing 3D components. Science. 347 (6229), 1446-1452 (2015).
- Pinheiro, A. V., Han, D., Shih, W. M., Yan, H. Challenges and opportunities for structural DNA nanotechnology. Nature nanotechnology. 6 (12), 763-772 (2011).
- Li, J., et al. Exploring the speed limit of toehold exchange with a cartwheeling DNA acrobat. Nature Nanotechnology. 1, (2018).
- Krishnan, Y., Simmel, F. C. Nucleic acid based molecular devices. Angewandte Chemie International Edition. 50 (14), 3124-3156 (2011).
- Liu, M., et al. A DNA tweezer-actuated enzyme nanoreactor. Nature communications. 4, 2127 (2013).
- Douglas, S. M., Bachelet, I., Church, G. M. A logic-gated nanorobot for targeted transport of molecular payloads. Science. 335 (6070), New York, N.Y. 831-834 (2012).
- Kuzyk, A., et al. Reconfigurable 3D plasmonic metamolecules. Nature Materials. 13 (9), 862-866 (2014).
- Zhou, C., Duan, X., Liu, N. A plasmonic nanorod that walks on DNA origami. Nature communications. 6, 8102 (2015).
- Choi, Y., Choi, H., Lee, A. C., Lee, H., Kwon, S. A Reconfigurable DNA Accordion Rack. Angewandte Chemie International Edition. 57 (11), 2811-2815 (2018).
- Chen, H., et al. Understanding the Mechanical Properties of DNA Origami Tiles and Controlling the Kinetics of their Folding and Unfolding Reconfiguration. Journal of the American Chemical Society. 136 (19), 6995-7005 (2014).
- Han, D., Pal, S., Liu, Y., Yan, H. Folding and cutting DNA into reconfigurable topological nanostructures. Nature Nanotechnology. 5 (10), 712-717 (2010).
- Douglas, S. M., et al. Rapid prototyping of 3D DNA-origami shapes with caDNAno. Nucleic Acids Research. 37 (15), 5001-5006 (2009).
- Castro, C. E., et al. A primer to scaffolded DNA origami. Nature methods. 8 (3), 221-229 (2011).
- Ouldridge, T. E., Louis, A. A., Doye, J. P. K. DNA Nanotweezers Studied with a Coarse-Grained Model of DNA. Physical Review Letters. 104 (17), 178101 (2010).
- Snodin, B. E. K., et al. Direct Simulation of the Self-Assembly of a Small DNA Origami. ACS Nano. 10 (2), 1724-1737 (2016).
- Amir, Y., Abu-Horowitz, A., Bachelet, I. Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami. Journal of Visualized Experiments. (106), e51272 (2015).
- Stahl, E., Martin, T. G., Praetorius, F., Dietz, H. Facile and Scalable Preparation of Pure and Dense DNA Origami Solutions. Angewandte Chemie International Edition. 53 (47), 12735-12740 (2014).
- Wei, B., Vhudzijena, M. K., Robaszewski, J., Yin, P. Self-assembly of Complex Two-dimensional Shapes from Single-stranded DNA Tiles. Journal of Visualized Experiments. (99), e52486 (2015).
- Clegg, R. M. Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids. Methods in enzymology. 211, 353-388 (1992).
- Kopperger, E., et al. A self-assembled nanoscale robotic arm controlled by electric fields. Science. 359 (6373), New York, N.Y. 296-301 (2018).
- Lauback, S., et al. Real-time magnetic actuation of DNA nanodevices via modular integration with stiff micro-levers. Nature Communications. 9 (1), 1446 (2018).
