Summary
Vi beskriver det detaljerade protokollet för design, simulering, våt-lab experiment och analys för en omkonfigurerbara DNA dragspel rack av 6 av 6 maskor.
Abstract
DNA nanostruktur-baserade mekaniska system eller DNA nanomaskiner, som producerar komplex nanoskala motion i 2D och 3D i nanometer till ångström upplösning, visar stor potential inom olika områden av nanoteknik såsom molekylär reaktorerna, drogen leverans, och nanoplasmonic system. Omkonfigurerbara DNA dragspel rack, som kan kollektivt att manipulera ett 2D eller 3D nanoskala nätverk av element, i flera etapper i svar till DNA-ingångarna, beskrivs. Plattformen har potential att öka antalet element som DNA nanomaskiner kan styra från några element till en nätverk skala med flera etapper av omkonfigurering.
I detta protokoll beskriver vi hela experimentella processen med omkonfigurerbar DNA dragspel racket av 6 av 6 maskor. Protokollet innehåller en design regel och simulering förfarande av strukturerna och en våt-labb experiment för syntes och omkonfigurering. Dessutom ingår analys av strukturen med TEM (transmissionselektronmikroskopi) och bandet (fluorescens resonans energiöverföring) i protokollet. De nya design och simulering metoder som omfattas av detta protokoll kommer att hjälpa forskare att använda DNA dragspel racket för ytterligare program.
Introduction
Mekaniska system baserat på DNA nanostrukturer eller DNA nanomaskiner1,2,3,4,5 är unika eftersom de producerar komplex nanoskala motion i 2D och 3D i nanometer till Ångström resolution, enligt olika Biomolekylär stimuli2,3,6. Genom att fästa funktionella material på dessa strukturer och kontrollera sina positioner, kan dessa strukturer tillämpas på olika områden. Exempelvis har DNA nanomaskiner föreslagits för en molekylär reaktorn7, drogen leverans8och nanoplasmonic system9,10.
Tidigare har infört vi omkonfigurerbara DNA dragspel rack, som kan manipulera en 2D- eller 3D nanoskala nätverk av elements11 (figur 1A). Till skillnad från andra DNA-nanomaskiner som bara styr några element, kan plattformen kollektivt manipulera regelbundet klädd 2D eller 3D element i olika etapper. Vi räknar med att en programmerbar kemiska och biologiska reaktion nätverk eller en molekylär computing system kan byggas från vårt system, genom att öka antalet kontrollerbar element. DNA dragspel racket är en struktur, där nätverket av flera DNA balkar är ansluten till lederna består av enkelsträngat DNA (figur 1B). Dragspel racket genereras av DNA balkar konfigureras av DNA slussarna, som hybridiserar till den klibbiga delen av balkar och ändra vinkeln mellan balkar enligt längden på den överbryggande delen av lås (låst tillstånd). Dessutom demonstreras flera steg omkonfigurering genom att lägga till nya Lås efter bildandet av det fria påstår av demontering DNA lås genom fotfäste-baserade strand deplacement12,13.
I detta protokoll beskriver vi hela design och syntes processen av omkonfigurerbara DNA dragspel racket. Protokollet omfattar design, simulering, våt-lab experiment och analys för syntesen av DNA dragspel racket av 6 av 6 maskor och en omkonfigurering av dessa. Strukturen täcks i protokollet är den grundläggande modellen för tidigare forskning11 och 65 nm med 65 nm storlek, bestående av 14 balkar. När det gäller design och simulering är strukturella utformningen av dragspel racket skiljer sig från konventionella DNA origami14,15 (dvs tätt packat). Därför har design regel och molekylär simulering ändrats från traditionella metoder. För att demonstrera, visar vi design tekniken med caDNAno14 ändrade strategi och simulering av dragspel racket med oxDNA16,17 med ytterligare skript. Slutligen beskrivs båda protokollen TEM och bandet för analys av konfigurerade dragspel rack strukturer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. design av 6 av 6 DNA dragspel Rack med caDNAno14
- Hämta och installera caDNAno 2.0 programvara14 för att designa en DNA dragspel rack (caDNAno 2.5 finns också på https://github.com/cadnano/cadnano2.5). Öppna caDNAno14 och klicka på Torget verktyg för att lägga till en ny del med en fyrkantig galler.
- Numrera varje stråle av dragspel racket och rita på panelen vänster galler av caDNAno14 (figur 2).
- Klicka på verktyget penna och rita varje bom på rätt redigeringsrutan på caDNAno14. Break balkar varje 32 bp, som är för fogar mellan angränsande balkar. Placera krampa delningsfilter i samma position som lederna. Använd Infoga verktyg och Pennverktyget i caDNAno14 för att låta lederna har ytterligare enkelsträngat delningsfilter.
- Klicka på Pennverktyget och ansluta lederna. Varje bom har sju lederna.
- Generera byggnadsställning delningsfilter för att sammanfoga ställningar till den enda slingan med hjälp av tidigare rapporterade schavotten routning algoritmen11. Låt inte den minsta bindande domänen mellan byggnadsställning och häftning trådar vara mindre än 8 bp (figur 3).
- Placera de ställningar som inte används i församlingen på de hörn som ligger på motsatta sidor av dragspel rack, som visas i figur 3.
- Klicka på att bryta verktyg. Bryta de delarna där krampa är cirkulära eller längre än 60 bp.
- Design DNA låsa trådar.
- Klicka på att bryta verktyg. Break 8 bp en krampa DNA-regionen att göra en klibbig del och ta bort 8 bp en krampa DNA-region. Det finns 18 klibbiga delar (figur 1) i 6 av 6 dragspel rack.
- Placera sekvenser som är omvänd kompletterar de klibbiga delarna i båda ändar av låsa trådar och ansluta dem med en överbryggande region, som består av poly T strängar av önskad längd (figur 1B).
- För att konfigurera, lägga till 8 bp fotfäste sekvenser i slutet av DNA låser för strand förskjutning. Fotfäste sekvensen används är i tabell 2.
- Förbereda poly A trådar som är vända komplement till regionen överbryggande.
- Design trådar som är omvänd komplement till DNA lås för omkonfigurering experimentet.
- Sekvens-verktyget och klicka på byggnadsställning DNA. Välj byggnadsställningen som standard M13mp18. Klicka på Exportera verktyg och rädda sekvens i CSV-format (tabell 1).
2. simulera strukturen med oxDNA
- Hämta och installera den oxDNA16,17. Senaste källkoden är tillgänglig på https://sourceforge.net/projects/oxdna/files/.
- Gör start konfigurationsfiler från caDNAno14 filen med python skript 'cadnano_interface.py', som tillhandahålls i oxDNA16,17 paketet. Användning är följande: 'python cadnano_interface.py cadnano_file.json sq'. Topologi filen och konfigurationsfilen genereras nu.
Obs: Topologi filen innehåller hur många trådar och nukleotider i struktur och information om ryggraden-ryggraden obligationer mellan nukleotider. Konfigurationsfilen innehåller allmän information såsom tidssteget, energi och rutans storlek. Läggning information såsom position vektor, ryggraden-base vektor, normala vektor, hastighet och vinkelformig hastighet av nukleotider är också inkluderade (figur 4). - Ändra informationen i den topologi och konfiguration filen från caDNAno14 så att de återspeglar verkliga strukturella informationen av dragspel racket. Alla balkar arrangeras parallellt när filerna topologi och konfiguration från caDNAno14 visualiseras. Dragspel racket är dock en gitterstrukturen så avståndet mellan bundna nukleotider är långt för simulering (figur 5).
- Rotera och flytta varje bom till den önskade gitterstrukturen. De nio kolumnerna till vänster i konfigurationsfilen är position vektor, ryggraden-base vektor och normala vektor (figur 4). Om du vill rotera en balk, rotera alla ställning, ryggraden-base och normal vektorer med hjälp av roterande omvandling. Flytta sedan en stråle genom att ändra position vektorn för att hitta det som visas i figur 5.
- Koppla av struktur med hjälp av skriptet som medföljer i oxDNA (se exempel i $oxDNA/exempel/RELAX_INITIAL_CONFIGURATION för ytterligare information).
- Köra Molekyldynamik simulering för tio miljoner stegen med avslappnad konfigurationsfilen. Användning är följande: '. / oxDNA < input >' Spara data varje 5000 eller 10000 steg.
- Visualisering
Obs: Strukturer var visualiserat med cogli.- Hämta och installera den senaste versionen av cogli (https://sourceforge.net/projects/cogli1/).
- Kör cogli med topologi och konfiguration filer från oxDNA simuleringen. Användning är följande: '. / cogli1 -t < topologi fil >< konfigurationsfilen >'.
- Dölja rutan genom att trycka på b.
3. Sammanfattning av strukturen
Obs: Syntesmetod är anpassad från tidigare protokoll15,18.
- Köp designade DNA häftklamrar från en oligonukleotid-provider.
- Justera koncentrationen av dessa DNA klammer till 100 μM med nuclease-gratis vatten.
- Pool varje DNA-strängen som utgör en 'fri stat' struktur i en tub och justera koncentrationen till 2 μM för varje hårstrå.
- Pool DNA lås strandar av längd och antal lås platser in rören och justera koncentration till 2 μM för varje hårstrå. 18, 9 och 4 Lås webbplatser används. Lägg till poly A kardeler som kompletterar regionen överbryggande vid samma koncentration.
- Pool-trådar som är omvänd komplement till DNA låsa trådar genom längd in rören och justera koncentrationen till 2 μM för varje hårstrå.
- Bered MgCl2 300 nM genom att blanda 70 μL nuclease-gratis vatten och 30 μL av 1 μM MgCl2 lösningen. Förbered en 5 x Tris EDTA-lösning genom att blanda 95 μL nuclease-gratis vatten och 5 μL 100 x Tris EDTA-lösning.
- Tillsätt 2 μL av stapelvara DNA, 1.1 μL MgCl2 lösning, 2 μL Tris EDTA-lösning, 7,6 μL nuclease-gratis vatten och 7,3 μL av byggnadsställning DNA där koncentrationen är 110 nM att göra 20 μL av blandade lager. Ställa in ställningen DNA slutliga koncentration till 40 nM, häfta DNA till 200 nM, MgCl2 till 16 mM och Tris-EDTA lösning 0,5 x.
- Snabbt värma blandade stamlösning i en termocykel till 80 ° C och cool till 60 ° C med en hastighet på 4 min per ° C och cool från 60 ° C till 4 ° C med en hastighet på 40 min per ° C.
4. rening av strukturen
Obs: Prover av alla strukturer var renas före analys. I det här avsnittet beskriver vi protokollet av PEG rening, som anpassas från tidigare litteratur19. Provet kan också renas genom gelelektrofores som beskrivs i tidigare litteratur15,18.
- Förbereda 5 M NaCl och 100 x Tris-EDTA.
- Förbered nederbörd-buffert genom att blanda 150 μL av PEG 8000, 500 μL av 100 x Tris EDTA och 101 μL 5 M NaCl och 249 μL nuclease-gratis vatten.
- Förbereda mål-buffert genom att blanda 5,5 μL av 300 nM MgCl2 lösning från avsnitt 3.3, 10 μL 5 x Tris EDTA-lösning från avsnitt 3.3 och 84,5 μL nuclease-gratis vatten.
- Blanda 20 μL av syntetiserade struktur från avsnitt 3 och 20 μL av nederbörd-buffert från avsnitt 4.2. Sedan snurra blandade beståndet vid 16000 x g vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten och lös pelleten i mål-bufferten från avsnitt 4.3.
5. omkonfigurering av dragspel racket från en 'fri stat' en 'låst tillstånd ”
- Syntetisera struktur utan DNA lås för konfiguration experimentet.
- Förbereda DNA lås-strängar från avsnitt 3.
- Tillsätt 2 μL av DNA lås strängar av önskad längd i 20 μL av syntetiserade struktur. De delarna med DNA i lås koncentration är fem gånger högre än strukturen.
- Inkubera provet för 0, 10, 25, 50 eller 100 minuter för att se hur snabb omkonfigurering sker.
- För 100 minuters inkubering, inkubera provet vid 50 ° C i 30 minuter och långsamt kyla ner till 25 ° C i en takt på 0,33 ° C per minut.
- För 50 minuters inkubering, inkubera provet vid 50 ° C i 15 minuter och långsamt kyla ner till 25 ° C i en takt på 0,66 ° C per minut.
- För 25 minuters inkubering, inkubera provet vid 50 ° C i 7,5 minuter och långsamt kyla ner till 25 ° C i en takt på 1,32 ° C per minut.
- För 10 minuters inkubering, inkubera provet vid 50 ° C i 3 minuter och långsamt kyla ner till 25 ° C i en takt på 3,3 ° C per minut.
- För 0 minuters inkubering, förvara provet vid 4 ° C höger efter DNA lås-strängar läggs.
- Direkt efter steget fästa snabbt kyla ner provet till 4 ° C att förhindra oönskade denaturering.
6. omkonfigurering av dragspel racket från en 'Locked stat' till en' gratis'
- Syntetisera strukturen med DNA lås av önskad längd för konfiguration experimentet.
- Förbereda omvänd kompletterande delar från avsnitt 3.
- Tillsätt 2 μL av trådar som är omvänd kompletterar de låsa trådar av önskad längd till 20 μL av syntetiserade struktur. De delarna med DNA i lås koncentration är fem gånger högre än strukturen.
- Inkubera provet för 0, 12, 60, 120, 240 minuter för att se hur snabb omkonfigurering uppstår.
- För 12, 60, 120, 240 minuters inkubation, snabbt värma provet till 40 ° C och långsamt kyla ner till 20 ° C för den tid som motsvarar varje. Direkt efter det detaching steget, snabbt kyla ner provet till 4 ° C att förhindra oönskade denaturering.
- För 0 minuters inkubering, förvara provet vid 4 ° C höger efter omvänd kompletterande delarna läggs.
7. TEM Imaging
Obs: Protokoll för TEM-avbildning anpassades från tidigare litteratur18,20.
- Förbereda 1,25 M NaOH-lösning genom att blanda 87,5 μL nuclease-gratis vatten och 12,5 μl 10 M NaOH-lösning.
- Tillsätt 1 μL av 1,25 M NaOH-lösning till 50 μL av 2% uranyl formate lösningen.
- Vortex lösningen i 3 minuter och centrifugera vid max hastighet i 3 minuter. Insättning 3 μL av renat provet på rutnätet glöd-urladdat TEM i 3 minuter och tvätta snabbt ut med filterpapper.
- Insättning 7 μL av beredda uranyl formate lösning för 30 sekunder och snabbt tvätta ur med filterpapper.
- Mät längd och vinkel av dragspel struktur avbildas av TEM.
8. GRÄMA analys
- Använda Atto 550 och Atto 647N dye, som Förster avståndet är 6,5 nm. Ersätta stapelvara 58 och krampa 117 i tabell 1 med fluorescently märkta delarna. Sedan syntetisera strukturen med fluorescently märkta delarna av den metod som beskrivs i avsnitt 3.
- Mätning av koncentrationen av renat provet.
- Normalisera provet till 10 nM och belastning 50 μL till de 384 mikroplattor väl.
- Excitera provet med givare och acceptor färgämnen vid 550 nm och åtgärd fluorescens spektrumet från 570 nm till 800 nm med en fluorometer.
- Mät fluorescens spektrumet av givare-bara provet på samma sätt.
- Excitera färgerna av provet vid 650 nm och fluorescens spektrum och mått från 670 nm till 800 nm. Detta är att mäta koncentrationen av acceptorn.
- Få standardavvikelserna genom att upprepa samma experiment med tre prover, som syntetiseras och renas separat.
- Beräkna bandet effektiviteten med förhållandet en metod som beskrivs av ekvationen nedan21.
DA550: Acceptor peak fluorescensintensiteten hos provet med givare och acceptor vid 550 nm excitation.
D550: fluorescensintensiteten på acceptor utsläpp utbud av givare-bara provet vid 550 nm excitation.
DA650: Acceptor peak fluorescensintensiteten hos provet med givare och acceptor på 650 nm excitation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Designade 6 av 6 DNA dragspel racket simuleras från oxDNA16,17 och resultaten visas i figur 6. Från simulering resultatet bekräftades det att den avsedda strukturen bildas utan förvrängning av strukturen.
TEM bilder i figur 7 är bilder av konfigurerade strukturer med lock längd 2, 8, 13 och 20 bp. På bilden, är vinkeln på strukturerna (figur 8A) minskade eftersom längden på låset blir längre. För att statistiskt analysera tendensen, erhölls medelvärdet och standardavvikelsen för vinkel (figur 8A) flera konfigurerade strukturer (figur 8B). Dessutom bandet mätresultaten visar strukturomvandlingen och dess hastighet, förutom strukturella tendensen visas i TEM bild (figur 8 c).
Från dessa förfaranden för analys, karaktärisering av DNA dragspel racket såsom hur många Lås behövs för strukturella konfiguration och omkonfigurering hastighet bestämdes.
Figur 1. En omkonfigurerbara DNA dragspel rack. A. The DNA dragspel rack består av styva DNA balkar och flera flexibla lederna som ansluter varje bom. Dragspel racket konfigureras på olika sätt beroende på längd av DNA låser. Olika 2D- och 3D-plattformar kan utformas genom att ändra plattformen. B. omkonfigurationen av DNA dragspel racket uppnås med hybridisering av DNA lås med olika längder. I ' gratis ' statsstrukturen, när extra nukleotider läggs till delningsfilter (eller lederna, gul), kan på grund av den lös kopplingen mellan DNA balkar (bestående av två spiraler), vinkel ändras (övre delen). Hybridisering av DNA låser med olika längder å bron till den klibbiga delen av båda angränsande balkar genererar den 'locked staten' (nedre delen). Strand förskjutning med fotfäste delarna (blå) av DNA låser med bränsle strand lossa DNA låsen från det låst tillståndet av strukturen och ändra den fria staten. Genom att upprepa processen med olika bibliotek av DNA låser, konfigureras struktur med olika vinklar. Denna siffra har ändrats från tidigare forskning11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. 6 av 6 dragspel rack är utformad med hjälp av caDNAno. 14 balkar av DNA dragspel racket är numrerade och dragit på galler panel i caDNAno. Denna siffra har ändrats från tidigare forskning11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Schavotten routningsalgoritmen. A. Rullställning som inte används i församlingen på de hörn som ligger på motsatta sidor av dragspel racket. B. sju slutna sammanfogas till en enda slinga genom att generera byggnadsställning delningsfilter. Minst sex byggnadsställning delningsfilter Poäng behövs och position av byggnadsställning delningsfilter är anpassat från tidigare litteratur. Denna siffra har ändrats från tidigare forskning11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Exempel på en konfigurationsfil. Konfigurationsfilen innehåller allmän information såsom informationen tidssteget, energi och rutan storlek och orientering. De nio kolumnerna till vänster i konfigurationsfilen är position vektor, ryggraden-base vektor och normala vektor respektive. De sex kolumnerna till höger är hastigheter och vinkelupplösning hastigheter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Visualisering av konfigurationsfilen före och efter ändringen. Position, ryggraden-base och normal vektor ändrades med roterande omvandling för att göra informationen i konfigurationsfilen återspeglar strukturella informationen av dragspel racket. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Simulering resultatet från oxDNA. Det dragspel racket med DNA lås, varav längderna är 2, 8, 13 och 20 bp, var simuleras. 18 låsning platser användes. En 6 av 6 dragspel rack med en DNA låsa där längden är A 2 bp, B 8 bp, C 13 bp och D 20 bp simuleras ochvisualiseras av cogil. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7. TEM bilder av konfigurerade 6 av 6 DNA dragspel rack. Strukturer med lock längder av A 2 bp, B 8 bp, C 13 bp och D 20 bp var avbildade. 18 låsbara platser användes för detta experiment. (skalstapeln: 100 nm). Denna siffra har ändrats från tidigare forskning11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8. Kontrollen vinkel av 2D dragspel racket. Vinkeln på dragspel racket består av 6-av-6 maskor kontrollerades av längden på DNA låsen. A. genom att lägga DNA lås med längder på 2, 8, 13 och 20 bp 18 låsning platserna för dragspel racket, vinkeln (blå) är konfigurerad som sett i de representativa TEM bilderna. Den dye par, Atto647N och Atto550 är kopplad till strukturen för bandet effektivitet analys. (skalstapeln: 100 nm) B. fördelningen av de konfigurera vinklarna. Putsade Trendkurvan (grå) är från grafen av låset 1 per 2 maskor. Dessutom motsvarar rutnätet med x-axeln samma rutnätet på grafen av låset 1 per 2 maskor. Staplarna representerar en standardavvikelse från medelvärdet vinkeln. C. fördelningen av bandet effektivitetsvinster. Staplarna representerar en standardavvikelse från medelvärdet effektivitet. D. GRÄMA effektivitet förändring medan staten övergått från gratis till låst eller vice versa mättes enligt olika inkubationstider. DNA låsa med längden 2 bp användes. Staplarna representerar en standardavvikelse från medelvärdet effektivitet. Denna siffra har ändrats från tidigare forskning11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Namn | Sekvens | Längd | |||
| Stapelvara 1 | ATAAGAGGTCATTTTTGCGGATGGATGTTACT | 32 | |||
| Stapelvara 2 | CAAAGTTACCAGAAGGAAACCGAGACATCGGG | 32 | |||
| Stapelvara 3 | ACAATGAAATAGCAATAGCTATCTCAAATAAA | 32 | |||
| Stapelvara 4 | CGCTAATATGAACGGTGTACAGACCAGGCGCATAGGCTGGGAACAAAGTCAGAGGG | 56 | |||
| Stapelvara 5 | CAGAAAACCCGGAATAGGTGTATCACCGTACTCAGGAGGTCCCCCTCAAATGCTTT | 56 | |||
| Häftklammer 6 | AGTGAGAATAGAAAGGTATGATATTCAACCGTTCTAGCTGATAAATTATCAACAGT | 56 | |||
| Stapelvara 7 | ATTTGGGGCGCGAGCTATATGGTT | 24 | |||
| Häftklammer 8 | GCCTTTATTTCAACGCAAGGATAATTAATGGA | 32 | |||
| Häftklammer 9 | TCAATTACCCACTACGAAGGCACCGGTAAAAT | 32 | |||
| Häftklammer 10 | ATTCAGTGAATAAGGCTTGCCCTGAAAACAGA | 32 | |||
| Stapelvara 11 | AGAAACAATAACGGATTCGCCTGATAGCCGAA | 32 | |||
| Häftklammer 12 | ATCAATATCTGGTCAGTTGGCAAAAGTAACAA | 32 | |||
| Häftklammer 13 | CGGAGACAGTCAAATCACCATCAAGGGTTAGA | 32 | |||
| Stapelvara 14 | GAGAATTAACTGAACACGAAACAAAGTACAACGGAGATTTGTATCATCGAAGCGCA | 56 | |||
| Stapelvara 15 | CGAGAGGGTTGATATAAGTATAGCATAGGAAC | 32 | |||
| Häftklammer 16 | CCCTTATTAGCGTTTGCCATCTTTTGGTGCCG | 32 | |||
| Stapelvara 17 | GTTTTCATCGGCATTTATGCCGGA | 24 | |||
| Stapelvara 18 | GTAGCAACTTCCAGTAAGCGTCATGTCTCTGA | 32 | |||
| Stapelvara 19 | AGCTAATGCAGAACGCAATAAACA | 24 | |||
| Stapelvara 20 | CCGTAATGGGATAGGTCACGTTGGGCCTATTT | 32 | |||
| Stapelvara 21 | ACCAGAGCCACCACCGCGAGAGGC | 24 | |||
| Stapelvara 22 | AGGCTCCAAAAGGAGCCGTTTACCAGACGACGATAAAAACCAAAATAGAAAATCTC | 56 | |||
| Stapelvara 23 | GCCGGAAGGAAACGCAATAATAACGGAATACCCAAAAGAACTCACAATTCCACACA | 56 | |||
| Häftklammer 24 | TTTTTCACCGGTGTCTGGAAGTTTCATTCCATATAACAGTACTAAAGGAATTGCGA | 56 | |||
| Stapelvara 25 | ATCAGGTCTTTACCCTCGCATTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTGACCATA | 56 | |||
| Häftklammer 26 | TGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTGACATTCA | 32 | |||
| Stapelvara 27 | AATAAAGAAATTGCGTAGATTTTCAGCTGCTC | 32 | |||
| Stapelvara 28 | CCCAATCCTCGCACTCCAGCCAGCTTTCCGGCACCGCTTCAAAATAAACAGCCATA | 56 | |||
| Stapelvara 29 | AAAGACTTCAAATATCATCAAAAGAATAGCCCGAGATAGGGTTGAGTGATTAAGAG | 56 | |||
| Stapelvara 30 | GTAGCGACAGAATCAAGTTTGCCTGATTTAGA | 32 | |||
| Stapelvara 31 | GCCACCCTCAGAACCGCCACCCTCAACAAGAG | 32 | |||
| Stapelvara 32 | AAGCAAGCCGTTTTTATTTTCATCTCCTGATT | 32 | |||
| Stapelvara 33 | GAGGGTAGCTATTTTTGAGAGATCCGTCAGAC | 32 | |||
| Stapelvara 34 | TATGACCCTGTAATACTCCCATCCTAATTTACGAGCATGTAGAAACCAGTTGTACC | 56 | |||
| Stapelvara 35 | GATTAGAGAGTACCTTAACAGTGCCCGTATAAACAGTTAATGCCCCCTAACTCCAA | 56 | |||
| Stapelvara 36 | CGTCTTTCCAGACGTTGTAGGAATCATTACCGCGCCCAATAGCAAGCACGATCTAA | 56 | |||
| Stapelvara 37 | TTTAACGTCAAAAATGAGTGAGACGGGCAACAGCTGATTGCCCTTCACAAGAAACG | 56 | |||
| Stapelvara 38 | TTTAACGGGGTCAGTGCCTTGAGTATAAGGGA | 32 | |||
| Stapelvara 39 | AATTGTGTGCAAAATCCCTTATAAGGTGGTTC | 32 | |||
| Stapelvara 40 | ACCAGTAGCACCATTACCATTAGCTTTCAGGG | 32 | |||
| Stapelvara 41 | AAACATCAAGAAAACAAAATTAATTCACATTA | 32 | |||
| Stapelvara 42 | TTGGCCTTGATATTCATCATCTTT | 24 | |||
| Stapelvara 43 | TGCATCAATCAACAGTTGAAAGGAATTGAGGAAGGTTATCATTATAGTCAGAAGCA | 56 | |||
| Stapelvara 44 | GCCCCAGCAGGCGAAAATCCTGTTAGGGGACG | 32 | |||
| Stapelvara 45 | TCCTCATTAAAGCCAGAATGGAAAAGCAAGAA | 32 | |||
| Stapelvara 46 | GAGCCTAATTTGCCAGGGGGGTAATAGTAAAATGTTTAGACTGGATAGAACGAGCG | 56 | |||
| Stapelvara 47 | TAAGAGCAACACTATCATAACCCTTTAACGTC | 32 | |||
| Stapelvara 48 | ATAGCAAGCCCAATAGGAACCCATGCAAAATC | 32 | |||
| Stapelvara 49 | CATAAAAACTTAGAGCTTAATTGCTGAATATAATGCTGTATAGCAGCCTTTACAGA | 56 | |||
| Stapelvara 50 | ATTTACCGGGCTACAGAGGCTTTGGAACGAGG | 32 | |||
| Stapelvara 51 | GTGCCTAATGAGTGAGAATGCAGATACATAACGCCAAAAGGAATTACGAAGTGTAA | 56 | |||
| Stapelvara 52 | ATACCGATAGTTGCGCATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTTTCTTAA | 56 | |||
| Stapelvara 53 | ATAACCGATACCGAAGCCCTTTTTAAGAAAAGTAAGCAGAAATGACAACAACCATC | 56 | |||
| Stapelvara 54 | TCAGAGCCGCCACCCTCAGAACCGGCTCAACA | 32 | |||
| Stapelvara 55 | TTTTGCAAAAGAAGTTTTGCCAGAAATCAAAA | 32 | |||
| Stapelvara 56 | GGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTAAGAAACC | 32 | |||
| Stapelvara 57 | ACATGTTCAAAGACACCACGGAATCATATAAA | 32 | |||
| Stapelvara 58 | CTGTGTGAAATTGTTAGAGTAATGTGTAGGTAAAGATTCAAAAGGGTGTGGTCATA | 56 | |||
| Stapelvara 59 | TTTCGAGGCCGGATATTCATTACCCAAATCAACGTAACAAAATTGTATCGGTTTAT | 56 | |||
| Stapelvara 60 | CTTTAGGAGCACTAACAACTAATAAGCCCCAA | 32 | |||
| Stapelvara 61 | AGATTAGTTGCTATTTTACAAAGGCTATCAGGTCATTGCCTGAGAGTCTTGAAGCC | 56 | |||
| Stapelvara 62 | GAGCCGCCGCCAGCATTGACAGGACTGACCTT | 32 | |||
| Stapelvara 63 | GAAACCAGGCAAAGCGCCATTCGCTCATAGCC | 32 | |||
| Stapelvara 64 | CATCAAGAGTAATCTTGACAAGAACACCACCA | 32 | |||
| Häftklammer 65 | AACCTTGCTTCTGTAAATCGTCGCTTATCAAC | 32 | |||
| Häftklammer 66 | TAGTTAGCGACAACTCGTATTAAATCCTTTGCCCGAACGTGTAGCATTCCACAGAC | 56 | |||
| Stapelvara 67 | ACCGATTGAGGGAGGGAAGGTAAAGGGGGATG | 32 | |||
| Stapelvara 68 | TACCAGCGCCAAAGACAAAAGGGCGTTTAGCT | 32 | |||
| Stapelvara 69 | TCATATATTTTAAATGCAATGCCTAAAACGAA | 32 | |||
| Stapelvara 70 | ACATTATCATTTTGCGTATTGACG | 24 | |||
| Stapelvara 71 | CGGAACCTATTATTCTGAAACATGCGGATTGA | 32 | |||
| Stapelvara 72 | CCTGAGAGATATTTTGTTAAAATTTAAATTGT | 32 | |||
| Stapelvara 73 | GAAACCATCGATAGCAAATCAGAT | 24 | |||
| Stapelvara 74 | CTCAGAGCCGCCACCATATTGGGC | 24 | |||
| Stapelvara 75 | CACCGACTTGAGCCATTTGGGAATACACTGAG | 32 | |||
| Stapelvara 76 | TCATGAGGAAGTTTCCATTAAACGTTTGCGGG | 32 | |||
| Stapelvara 77 | AAACAGGAAGATTGTATAAGCAAATAAAATAT | 32 | |||
| Stapelvara 78 | ATCGTCACCCTCAGCAGCGAAAGAAGACTTTT | 32 | |||
| Stapelvara 79 | ATCAACATTAAATGTGTTGTTCCA | 24 | |||
| Stapelvara 80 | TGCAGGGAGTTAAAGGAACGAAAGAGGCAAAAGAATACACTAAAACACTTCGGTCG | 56 | |||
| Stapelvara 81 | ACGTAATGCTGAGCAAAAGAAGATTATTCATT | 32 | |||
| Stapelvara 82 | AATCGATGAACGGTAATCGTAAAATTAGTACC | 32 | |||
| Stapelvara 83 | GACCCCCAGCGATTATACCAAGCGGAGGCAGG | 32 | |||
| Stapelvara 84 | CGAAATCCGCGACCTGGCCTGATA | 24 | |||
| Stapelvara 85 | GCCATCAAAAATAATTCGCGTCTGAGTGCCGT | 32 | |||
| Stapelvara 86 | TCGGCTGTCTTTCCTTATCATTCCATTACCTT | 32 | |||
| Stapelvara 87 | CAGACCGGGGGCGCATCGTAACCGTGCATCTGCCAGTTTGTTTAATTCGAGCTTCA | 56 | |||
| Stapelvara 88 | GTTTGGAACAAGAGTCCACTATTACCTGTAGC | 32 | |||
| Stapelvara 89 | AACAGTACATAAATCAATATATGTCGGGAGAA | 32 | |||
| Stapelvara 90 | GACGTTGGGAAGAAAAATCTACGTCTGGCATG | 32 | |||
| Stapelvara 91 | CAAAATCGCGCAGAGGCGGGAAAC | 24 | |||
| Stapelvara 92 | ATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTGATGAAAC | 32 | |||
| Stapelvara 93 | CCCCGGTTGATAATCACGTCCAAT | 24 | |||
| Stapelvara 94 | ATGCCTGCAGGTCGACAAGAACGGGTATTAAACCAAGTACCGCACTCACCAGTGCC | 56 | |||
| Stapelvara 95 | GTTTGGATTATACTTCTGAATAATTGATTCCC | 32 | |||
| Stapelvara 96 | ACCGAACTGACCAACTTTGAAAGATAATAAGT | 32 | |||
| Stapelvara 97 | GCCAGGGTGGTTTTTCTTTTCACCCCTCAGAG | 32 | |||
| Stapelvara 98 | CAGTTGAGATTTAGGAATACCACATACATTTA | 32 | |||
| Stapelvara 99 | TAGCCGGAACGAGGCGCAGACGGTTCCTTTTG | 32 | |||
| Stapelvara 100 | AGTATTAGACTTTACAAACAATTCCGTAATCA | 32 | |||
| Stapelvara 101 | CTTGCGGGAGAACCGCCACCCTCAGAGCCACCACCCTCATGAGGCGTTTTAGCGAA | 56 | |||
| Stapelvara 102 | TTAAGAACTGGCTCATATCAATAA | 24 | |||
| Stapelvara 103 | CATACAGGCAAGGCAAAGAATTAGAAGTTTAT | 32 | |||
| Stapelvara 104 | ATTGAGTTAAGCCCAAACATGGCTTTTGATGATACAGGAGTGTACTGGGAGATAAC | 56 | |||
| Stapelvara 105 | ATAGAAGGCTTATCCGGTATTCTACGGAAACG | 32 | |||
| Stapelvara 106 | CTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGATTTGAATA | 32 | |||
| Stapelvara 107 | CTTACCAAGATTAGAGCCGTCAATAGATAATACATTTGAGCCCAGCTACAATTTTA | 56 | |||
| Stapelvara 108 | ACCTTGCTGAACCTCAAAAGTATTAAGAGGCTGAGACTCCTCAAGAGAAAAAATCT | 56 | |||
| Stapelvara 109 | TTTGTCACAATCAATAGAAAATTCCAATAAAT | 32 | |||
| Stapelvara 110 | CAATTCTATTCAACTTTAATCATTCTTGAGAT | 32 | |||
| Stapelvara 111 | ACGACAGTATCGGCCTCAGGAAGAGCTGGTTT | 32 | |||
| Stapelvara 112 | ACTGCGGAATCGTCATAAATATTCATGTCAAT | 32 | |||
| Stapelvara 113 | TTTCGTCACCAGTACAAACTACAAATCACCGT | 32 | |||
| Stapelvara 114 | AATTCTGCGAACGAGTAGATTTAGTCCTGATT | 32 | |||
| Stapelvara 115 | GAAATTATTCATTAAAGGTGAATTTTTAAAAG | 32 | |||
| Stapelvara 116 | ACCAGAAGGAGCGGAATTATCATCTCGGTGCG | 32 | |||
| Stapelvara 117 | AATTCGTAACGAGAAACACCAGAACGAGTAGTAAATTGGGGAGGATCCCCGGGTAC | 56 | |||
| Stapelvara 118 | ATTAAGACTCCTTATTACGCAGTACCAGTCAG | 32 | |||
| Stapelvara 119 | GGTTTAATCTAATAGTAGTAGCATGGTGGCAT | 32 | |||
| Stapelvara 120 | AAACCGTCTTAGCGGGGTTTTGCTCAGTACCAGGCGGATATGGACTCCAACGTCAA | 56 | |||
| Stapelvara 121 | TATCAAAATTATTTGCAGAAAGGC | 24 | |||
| Stapelvara 122 | ACAACATTATTACAGGTAGAACCC | 24 | |||
| Stapelvara 123 | CCCGTCGGATTCTCCGTGGGAACAAACCCTCA | 32 | |||
| Stapelvara 124 | ACAATTTCATTTGAATTACCTTTTAGATTCAT | 32 | |||
| Stapelvara 125 | GCTAAACACATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGAAATGAATTTTCTGTAT | 56 | |||
| Stapelvara 126 | AATAGATAAGTCCTGAACAAGAAAGAGTGAAT | 32 | |||
| Stapelvara 127 | AAAGCTAATGTTAGCAAACGTAGAAAATACATACATAAAGTTAAGCAATAAAGCCT | 56 | |||
| Stapelvara 128 | TGTTTTAAATATGCAACTAAAGTACGCCTCCC | 32 | |||
| Stapelvara 129 | ATACAGTAACAGTACCAGGCATAG | 24 | |||
| Stapelvara 130 | GTAAAACGTTTGACCATTAGATACATTTCGCAAATGGTCACAGGGTTTTCCCAGTC | 56 | |||
| Stapelvara 131 | AGTTGCAGCAAGCGGTCGCCTGGC | 24 | |||
| Stapelvara 132 | ATGGCAATTCATCAATTCGAGAAC | 24 | |||
Tabell 1. Sekvens av krampa strandar
| Namn | Sekvens |
| Toehold_1 | AGAAGTCG |
| Toehold_2 | AGGTATGG |
| Toehold_3 | CTCCACTC |
| Toehold_4 | GTGTCCGA |
| Toehold_5 | AAGTAGAC |
| Toehold_6 | GAGTCGCT |
| Toehold_7 | AGTGTCTA |
| Toehold_8 | GTATCGTG |
| Toehold_9 | CATCACAG |
| Toehold_10 | CGAGACTT |
| Toehold_11 | ACGGACGA |
| Toehold_12 | GCCTACTC |
| Toehold_13 | GATGTGGA |
| Toehold_14 | GCGTGCGT |
| Toehold_15 | GTGGACAA |
| Toehold_16 | TACGACTG |
| Toehold_17 | CAGCCGTG |
| Toehold_18 | TGCCGCAT |
Tabell 2. Fotfäste sekvens för strand deplacement experimentet
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll införs hela processen från design, simulering, syntes och analys av grundläggande 2D DNA dragspel racket. Modifierad design och simulering regler har beskrivits eftersom design rule skiljer sig från standard DNA-origami, däri DNA dragspel racket har ytterligare nukleotider på av delningsfilter för flexibilitet14,15. Från detta, vi förväntar oss att protokollet kan påskynda olika forskningar använder DNA dragspel rack. Dessutom kan protokollet beskrivs också tillämpas på annan forskning som använder DNA nanostruktur i stället för standard DNA-origami.
För strukturer än 2D grundstrukturen demonstrerade i ursprungliga forskning papper, kan designen göras med ändringar av protokollet beskrivs. I korthet är en boxning-handske-våren struktur utformad genom att ändra beam antalet och längden från den grundläggande modellen. 3D nanotubular strukturer kan också skapas genom att ansluta båda ändarna av en 2D dragspel rack struktur. Men för att simulera 3D-strukturer, den inledande placeringen av balkar bör övervägas i 3D-rymden och starttillståndet för balkar är tänkt för att böjas. Därför behövs fler computational omvandling. Design och simulering av olika 2D- och 3D DNA dragspel rack strukturer kommer att genomföras genom att utveckla datorstödd programmet i framtida forskning.
Hastighet och repeterbarhet av aktivering är också viktiga faktorer för dynamisk DNA nanoteknik. Nyligen dynamiska DNA-strukturer som svarar på externa elektriska eller magnetiska fält föreslås och drivs med hög hastighet22,23. Medan DNA dragspel racket har aktiverat kollektiva aktivering av flera DNA balkar, var omkonfigurering hastigheten inte signifikant bättre eftersom aktivering är baserad på DNA strand förskjutning. För mer ytterligare applikationer, bör svar på yttre stimuli förbättras genom att optimera DNA lås design eller använda en annan yttre stimuli.
Som en ansökan studie för omkonfigurerbara dragspel struktur, olika funktionella material såsom läkemedelsmolekyler, kan nanopartiklar eller proteiner kopplas till strukturen. För detta, kan molekylerna anslutas till krampa som finns vid den avsedda positionen. Sammantaget kan en mängd ansökan studier genomföras genom detta protokoll och dess ändringar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja
Acknowledgments
Denna forskning var delvis stöds av Global utveckling Center forskningsprogrammet genom den nationella forskning stiftelsen av Korea(NRF) finansieras av ministeriet för vetenskap och IKT (MSIT) (2015K1A4A3047345) och Nano· Material Technology Development Program genom den nationella Research Foundation i Korea (NRF) finansieras av ministeriet för vetenskap och IKT (MSIT) (2012M3A7A9671610). Institutet för teknisk forskning vid Seoul National University som forskningsanläggningar för detta arbete. Författarna erkänner tacksamhet mot Tae-ung Yoon (Biological Sciences, Seoul National University) angående fluorescens-spektroskopi för bandet analys.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| M13mp18 Single-stranded DNA | NEB | N4040s | |
| 1M MgCl2 Solution | Biosesang | M2001 | |
| Tris-EDTA buffer | Biosesang | T2142 | |
| Nuclease-Free Water | Qiagen | 129114 | |
| 5M Sodium Chloride solution | Biosesang | s2007 | |
| PEG 8000 | Sigma Aldrich | 1546605 | |
| 10N NaOH | Biosesang | S2038 | |
| Uranyl formate | Thomas Science | C993L42 | |
| Thermal cycler C1000 | Biorad | ||
| Nanodropic 2000 | Thermo Fisher Scientific | ||
| TEM (LIBRA 120) | Carl Zeiss | ||
| Fluorometer Enspire 2300 | Perkin-Elmer | ||
| Centrifuge | Labogene | LZ-1580 |
References
- Andersen, E. S., et al. Self-assembly of a nanoscale DNA box with a controllable lid. Nature. 459 (7243), 73-76 (2009).
- Cha, T. -G., et al. Design principles of DNA enzyme based walkers: Translocation kinetics and photo-regulation. Journal of the American Chemical Society. 137 (29), 9429-9437 (2015).
- Gerling, T., Wagenbauer, K. F., Neuner, A. M., Dietz, H. Dynamic DNA devices and assemblies formed by shape-complementary, non-base pairing 3D components. Science. 347 (6229), 1446-1452 (2015).
- Pinheiro, A. V., Han, D., Shih, W. M., Yan, H. Challenges and opportunities for structural DNA nanotechnology. Nature nanotechnology. 6 (12), 763-772 (2011).
- Li, J., et al. Exploring the speed limit of toehold exchange with a cartwheeling DNA acrobat. Nature Nanotechnology. 1, (2018).
- Krishnan, Y., Simmel, F. C. Nucleic acid based molecular devices. Angewandte Chemie International Edition. 50 (14), 3124-3156 (2011).
- Liu, M., et al. A DNA tweezer-actuated enzyme nanoreactor. Nature communications. 4, 2127 (2013).
- Douglas, S. M., Bachelet, I., Church, G. M. A logic-gated nanorobot for targeted transport of molecular payloads. Science. 335 (6070), New York, N.Y. 831-834 (2012).
- Kuzyk, A., et al. Reconfigurable 3D plasmonic metamolecules. Nature Materials. 13 (9), 862-866 (2014).
- Zhou, C., Duan, X., Liu, N. A plasmonic nanorod that walks on DNA origami. Nature communications. 6, 8102 (2015).
- Choi, Y., Choi, H., Lee, A. C., Lee, H., Kwon, S. A Reconfigurable DNA Accordion Rack. Angewandte Chemie International Edition. 57 (11), 2811-2815 (2018).
- Chen, H., et al. Understanding the Mechanical Properties of DNA Origami Tiles and Controlling the Kinetics of their Folding and Unfolding Reconfiguration. Journal of the American Chemical Society. 136 (19), 6995-7005 (2014).
- Han, D., Pal, S., Liu, Y., Yan, H. Folding and cutting DNA into reconfigurable topological nanostructures. Nature Nanotechnology. 5 (10), 712-717 (2010).
- Douglas, S. M., et al. Rapid prototyping of 3D DNA-origami shapes with caDNAno. Nucleic Acids Research. 37 (15), 5001-5006 (2009).
- Castro, C. E., et al. A primer to scaffolded DNA origami. Nature methods. 8 (3), 221-229 (2011).
- Ouldridge, T. E., Louis, A. A., Doye, J. P. K. DNA Nanotweezers Studied with a Coarse-Grained Model of DNA. Physical Review Letters. 104 (17), 178101 (2010).
- Snodin, B. E. K., et al. Direct Simulation of the Self-Assembly of a Small DNA Origami. ACS Nano. 10 (2), 1724-1737 (2016).
- Amir, Y., Abu-Horowitz, A., Bachelet, I. Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami. Journal of Visualized Experiments. (106), e51272 (2015).
- Stahl, E., Martin, T. G., Praetorius, F., Dietz, H. Facile and Scalable Preparation of Pure and Dense DNA Origami Solutions. Angewandte Chemie International Edition. 53 (47), 12735-12740 (2014).
- Wei, B., Vhudzijena, M. K., Robaszewski, J., Yin, P. Self-assembly of Complex Two-dimensional Shapes from Single-stranded DNA Tiles. Journal of Visualized Experiments. (99), e52486 (2015).
- Clegg, R. M. Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids. Methods in enzymology. 211, 353-388 (1992).
- Kopperger, E., et al. A self-assembled nanoscale robotic arm controlled by electric fields. Science. 359 (6373), New York, N.Y. 296-301 (2018).
- Lauback, S., et al. Real-time magnetic actuation of DNA nanodevices via modular integration with stiff micro-levers. Nature Communications. 9 (1), 1446 (2018).
