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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

再構成可能な DNA アコーディオン ラックの設計と合成

Published: August 15, 2018 doi: 10.3791/58364
Automatic Translation
*1, *1, *2, 1,2,3,4
1Department of Electrical and Computer Engineering, Seoul National University, 2Interdisciplinary Program for Bioengineering, Seoul National University, 3Institute of Entrepreneurial Bio Convergence, Seoul National University, 4Seoul National University Hospital Biomedical Research Institute, Seoul National University Hospital
* These authors contributed equally

Summary

設計、シミュレーション、ぬれた実験室実験および 6 によって 6 メッシュの再構成可能な DNA アコーディオン ラックの解析のための詳しいプロトコルについて述べる。

Abstract

DNA ナノ構造に基づく機械システムまたは DNA ナノマシン オングストローム分解能をナノメータ単位で 2 D および 3 D の複雑なナノスケール運動を作り出す、ドラッグデリバリー、分子の原子炉などナノテクノロジーの様々 な分野で大きな可能性を示してください。・ nanoplasmonic システム。DNA の入力への応答の複数の段階で、要素の 2D または 3D のナノスケール ネットワークを操作できますまとめて、再構成可能な DNA アコーディオン ラックが説明されています。プラットフォームには、再構成の複数の段階のネットワーク規模にいくつかの要素から DNA ナノマシンの制御できる要素の数を増やす可能性があります。

このプロトコルで再構成可能な 6 によって 6 メッシュの DNA アコーディオン ラック全体の実験プロセスをについて説明します。プロトコルには、構造と合成と再構成のウェット研究室の実験の設計ルールとシミュレーションの手順が含まれています。さらに、TEM (透過型電子顕微鏡) とフレット (蛍光共鳴エネルギー移動) を使用して構造の解析は、プロトコルに含まれます。このプロトコルで覆われている新規の設計とシミュレーションの方法は、さらにアプリケーションの DNA アコーディオン ラックを使用する研究者を支援します。

Introduction

DNA ナノ構造や DNA ナノマシン1,2,3,4,5に基づく機械システムが一意にナノメータ単位で 2 D および 3 D の複雑なナノスケール モーションを出すのでオングストローム分解能、様々 な生体分子の刺激2,3,6によると。これらの構造の機能性材料を取り付けると自分の位置を制御する、これらの構造は、様々 な分野に適用できます。たとえば、DNA ナノマシンは分子原子炉7、薬配信8、および nanoplasmonic システム9,10の提案されている.

以前、紹介した再構成の DNA アコーディオン ラックは、要素11 (図 1 a) の 2D または 3D のナノスケール ネットワークを操作することができます。異なり、いくつかの要素を制御するだけ他の DNA ナノマシン、プラットフォームはまとめて、さまざまな段階に周期的に配列した 2D または 3D 要素を操作できます。プログラム可能な生物・化学反応ネットワークまたは分子コンピューティング システム ビルドできることを私達のシステムから制御可能な要素の数を増やすことで期待しています。DNA アコーディオン ラックは、複数の DNA 梁のネットワークは単一座礁させた DNA (図 1 b) の接合に接続されて、構造です。DNA 梁によって生成されたアコーディオンのラックは、梁の粘着部分に交配させるし、ロック (ロック状態) のブリッジ部分の長さによると梁の間の角度を変更する DNA ロックによって再構成されます。さらに、鎖の足掛かりに基づく変位12,13を介して DNA ロックをデタッチによって自由国の形成の後新しいロックを加えることによって多段の再構成を示します。

このプロトコルで再構成可能な DNA アコーディオン ラックの全体設計・合成プロセスをについて説明します。プロトコルには、設計、シミュレーション、ぬれた実験室実験および 6 によって 6 メッシュの DNA アコーディオン ラックとこれらの再構成の合成の分析が含まれています。以前研究11の基本的なモデルのプロトコルで覆われた構造で、65 65 nm nm の 14 の梁から成る。設計とシミュレーションの面でのアコーディオンのラック構造設計は従来 DNA 折り紙14,15 (すなわち、ぎっしり詰まった) によって違います。したがって、設計ルールと分子シミュレーションを従来の方法から変更されています。示すために、caDNAno14の変更されたアプローチと追加のスクリプト oxDNA16,17を使用してアコーディオンのラックのシミュレーションを用いた設計法を示す.最後に、構成されたアコーディオン ラック構造の分析 TEM およびフレットの両方のプロトコルを説明します。

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Protocol

1. 6 DNA アコーディオン ラック caDNAno14で 6 のデザイン

  1. ダウンロードし、インストール caDNAno 2.0 ソフトウェア14 DNA アコーディオン ラックを設計する (caDNAno 2.5 も https://github.com/cadnano/cadnano2.5 で利用可能です)。CaDNAno14を開き、正方格子で新しいパーツを追加する正方形ツールをクリックします。
  2. アコーディオンのラックの各ビームの数、caDNAno14 (図 2) の左の格子パネルに描画します。
  3. [鉛筆ツール] をクリックし、caDNAno14の右の編集パネルで各ビームを描画します。休憩梁すべて 32 bp は、隣接する梁の接合部は。関節と同じ位置に定番のクロス オーバーを配置します。CaDNAno14 挿入ツールや[鉛筆] ツールを使用して、追加の単一座礁させたクロス オーバーがある関節をできるようにします。
  4. [鉛筆ツール] をクリックし、関節を接続します。各ビームは 7 つの関節です。
  5. ルーティング アルゴリズム11以前に報告された足場を使用して、単一のループに足場をマージする足場のクロス オーバーを生成します。8 未満になる足場と主食の鎖間最小結合ドメインはいけない bp (図 3)。
  6. 図 3に示すように、アコーディオンのラックの反対側にある頂点のアセンブリに慣れていない足場を配置します。
  7. 分割ツールをクリックします。ステープル繊維、円形または 60 より長い毛を壊して bp。
  8. ロックの dna を設計します。
    1. 分割ツールをクリックします。粘着部分を作るし、8 を削除する定番 DNA 領域の休憩 8 bp 定番 DNA 領域の bp。6 6 によってアコーディオン ラック 18 粘着部分 (図 1) があります。
    2. ロック鎖の両端に粘着部分に相補的なはリバース シーケンスを配置し、ポリ T (図 1 b) の所望の長さの鎖から成っているブリッジの地域でそれらを接続します。
    3. 再構成、追加 8 ストランド変位、DNA の終わりに足掛かりシーケンスの bp をロックします。表 2使用足掛かりシーケンスです。
    4. ポリ A 鎖が逆ブリッジ領域に補足を準備します。
    5. デザインのストランドにある逆再構成実験 DNA ロックを補完するもの。
  9. シーケンス ツール足場 DNA をクリックします。標準 M13mp18。エクスポート ツールをクリックして csv 形式 (表 1) で、シーケンスを保存は、足場を選択します。

2、oxDNA の構造をシミュレートします。

  1. ダウンロードして oxDNA16,17をインストールします。最新のソース コードは、https://sourceforge.net/projects/oxdna/files/ で利用可能です。
  2. OxDNA16,17パッケージで提供されている ' cadnano_interface.py' の python スクリプトを使用して caDNAno14ファイルから開始の設定ファイルを作る。使用方法のとおりです: 'python cadnano_interface.py cadnano_file.json sq'。トポロジ ファイルと構成ファイルが生成されました。
    注: トポロジ ファイルを含むどのように多くのストランドし、ヌクレオチドは、構造とのヌクレオチドの間基幹バックボーン債に関する情報。構成ファイルには、刻み、エネルギー、ボックスのサイズなどの一般的な情報が含まれています。位置ベクトル、バックボーン基底ベクトル、法線ベクトル、速度、およびヌクレオチドの角速度など向きの情報が含まれている (図 4)。
  3. アコーディオンのラックの真の構造情報を反映し、caDNAno14からトポロジおよび構成ファイル内の情報を変更します。CaDNAno14からトポロジおよび構成ファイルは、視覚化されたとき、すべてのビームが平行に配置されます。ただし、アコーディオンのラックは、結合ヌクレオチド間の距離は、シミュレーション (図 5) まで格子構造です。
    1. 回転、各ビームを任意の格子構造に移動します。構成ファイルで左に 9 つの列が位置ベクトル、バックボーン基本ベクトルと法線ベクトル (図 4)。ビームを回転するには、すべての位置の回転変換を用いたバックボーン ベースと通常のベクトルを回転させます。図 5に示すように、それを見つけるに位置ベクトルを変更することでビームを移動します。
    2. OxDNA パッケージで提供されるスクリプトを使用して構造体をリラックス ($oxDNA の例を参照してください/例の RELAX_INITIAL_CONFIGURATION さらに詳しい情報/)。
  4. 分子動力学法によるリラックスした構成ファイルを使用して 1000 万の手順を実行します。使用方法のとおりです: './oxDNA < 入力 >' すべての 5000 や 10000 ステップ データを保存します。
  5. 可視化
    注: 構造は、cogli を使用して視覚化されました。
    1. ダウンロードし、cogli (https://sourceforge.net/projects/cogli1/) の最新バージョンをインストールします。
    2. OxDNA シミュレーションからトポロジおよび構成ファイルで、cogli を実行します。使用方法のとおりです: './cogli1 t < トポロジ ファイル >< 構成ファイル >'。
    3. ボックスを非表示には、 bを押します。

3. 構造体の合成

注: 以前のプロトコル15,18から合成法が適応されます。

  1. オリゴヌクレオチド プロバイダーからデザインの DNA ステープルを購入します。
  2. これらの DNA ステープルはヌクレアーゼ フリー水を使用して 100 μ m の濃度を調整します。
    1. 1 つの管に '無料の状態の構造を構成する各 DNA 鎖をプールし、各ストランドの 2 μ M の濃度を調整します。
    2. プール DNA ロックはチューブに鎖の長さとロックのサイトの数によって、各ストランドの 2 μ M の濃度を調整します。18、9、4 サイトをロックが使用されます。同じ濃度でブリッジの領域に補足であるポリ A 鎖を追加します。
    3. プール鎖 DNA に相補的な逆に、管に長さによって鎖をロック各ストランドの 2 μ M に濃度を調整してください。
  3. 300 の MgCl2ソリューションを準備ヌクレアーゼ フリー水の 70 μ、1 μ M MgCl2ソリューションの 30 μ L を混合することによって nM。ヌクレアーゼ フリー水の 95 μ L と 100 倍トリス EDTA 溶液の 5 μ L を混合することによってトリス EDTA 溶液 x 5 を準備します。
  4. 定番 MgCl2ソリューションの 1.1 μ L の DNA の 2 μ L、トリス EDTA 溶液、ヌクレアーゼ フリー水の 7.6 μ L と足場の DNA 濃度が 110 の 7.3 μ L の 2 μ L を追加混合株式の 20 μ L にする nM。最終的な足場 DNA 濃度を 40 に設定海里、200 nM、MgCl2から 16 mM と 0.5 にトリス EDTA 溶液に DNA をホチキス止め x。
  5. 60 ° C ° C あたり 40 分のレートで 4 ° C から 4 ° C とクールな毎分の割合で 60 ° C にサーマルサイクラーを 80 ° C でクールな混合原液を急速に熱します。

4. 構造体の浄化

注: すべての構造体のサンプルを分析する前に精製しました。このセクションで以前の文学19から適応されているペグ浄化のプロトコルについて述べる。以前の文学15,18で説明するよう、サンプルをゲル電気泳動浄化もことができます。

  1. 5 M の NaCl と 100 x トリス-EDTA を準備します。
  2. ペグ 8000、トリス EDTA x 100 の 500 μ L と 5 M の NaCl の 101 μ L、ヌクレアーゼ フリー水の 249 μ L の 150 μ L を混合することによって沈殿バッファーを準備します。
  3. セクション 3.3 から 300 nM MgCl2ソリューションの 5.5 μ L、セクション 3.3 から 5 x トリス EDTA 溶液 10 μ L、ヌクレアーゼ フリー水の 84.5 μ L を混合することによってターゲット バッファーを準備します。
  4. セクション 3 とセクション 4.2 から沈殿バッファーの 20 μ L から合成構造のミックス 20 μ L。その後、4 ° C で 16000 × g で混合株をスピンします。上澄みを除去し、セクション 4.3 からのターゲット バッファーのペレットを溶解します。

5. 'ロック状態' '無料状態' からアコーディオン ラックの再構成

  1. 構成実験 DNA ロックせず構造を合成します。
  2. セクション 3 からロック dna を準備します。
  3. 合成構造の 20 μ L に所望の長さの dna ロックの 2 μ L を追加します。ロック dna 濃度は構造より 5 倍高いです。
  4. 0、10、25、50 のサンプルをインキュベートまたはどのように迅速に再構成して 100 分が発生します。
    1. 100 分インキュベーション サンプル 50 ° C で 30 分間インキュベートし、ゆっくり 0.33 ° C/分の速度で 25 ° C まで冷却します。
    2. 50 分インキュベーション サンプル 50 ° C で 15 分間インキュベートし、ゆっくり 0.66 ° C/分の速度で 25 ° C まで冷却します。
    3. 25 分インキュベーション 7.5 分の 50 ° c サンプルをインキュベートし、ゆっくり 1.32 ° C/分の速度で 25 ° C まで冷却します。
    4. 10 分インキュベーション サンプル 50 ° C で 3 分間インキュベートし、ゆっくりと 3.3 ° C/分の速度で 25 ° C まで冷却します。
    5. 0 分インキュベーション dna ロックが追加された後に 4 ° C 右のサンプルを格納します。
  5. 取り付け手順の直後に急速に、不要な変性を防ぐために 4 ° C にサンプル クールダウンします。

6. アコーディオン ラック '無料状態' の 'ロック状態' からの再構成

  1. 構成の実験を希望する長さの DNA ロック構造を合成します。
  2. セクション 3 から逆の相補的な鎖を準備します。
  3. 合成構造の 20 μ L に所望の長さのロックの鎖に相補的なリバース、ストランドの 2 μ L を追加します。ロック dna 濃度は構造より 5 倍高いです。
  4. 0、12、60、120 サンプルをインキュベート、どのように迅速に再構成して 240 分に発生します。
    1. 12、60、120、240 分インキュベーション 40 ° C にサンプルを急速に加熱し、ゆっくりとそれぞれに対応する時刻の 20 ° C まで冷却します。脱着の手順の直後に急速に、不要な変性を防ぐために 4 ° C にサンプル クールダウンします。
    2. 0 分インキュベーション逆相補的な鎖が追加された後に 4 ° C 右のサンプルを格納します。

7. 電子顕微鏡イメージング

注: 電子顕微鏡イメージング プロトコルは、以前の文学18,20から適応されました。

  1. ヌクレアーゼ フリー水の 87.5 μ L と 10 M NaOH 溶液 12.5 μ L を混合することによって 1.25 M NaOH 溶液を準備します。
  2. 2% ウラニル ギ酸溶液 50 μ L に 1.25 M NaOH 溶液 1 μ L を追加します。
  3. 渦 3 分、最大速度で 3 分間遠心するためのソリューション。3 分間のグロー放電 TEM グリッド上精製サンプルの 3 μ L を預金し、急速にろ紙を洗い流します。
  4. 30 秒間入金の準備ウラニル ギ酸溶液 7 μ L と急速にろ紙を洗い流します。
  5. 長さとアコーディオン構造の tem イメージの角度を測定します。

8. フレット解析

  1. Atto 550 と Atto 647N 染料、フェルスター距離、6.5 を使用して nm。蛍光標識鎖で主食 58、表 1の主食 117 を置き換えます。セクション 3 で説明する方法によって蛍光標識ストランド構造を合成します。
  2. 精製した試料の濃度を測定します。
  3. まあ 384 プレートに 10 nM と負荷 50 μ L のサンプルを正規化します。
  4. エキサイト、550 nm 帯およびメジャー ドナーとアクセプター色素サンプル 570 から蛍光スペクトル nm 800 から nm、蛍光光度計。
  5. 同じ方法でドナーのみのサンプルの蛍光スペクトルを測定します。
  6. 650 でサンプルの染料を刺激 nm と蛍光スペクトル測定 670 から nm 800 から nm。これは、受容体の濃度を測定することです。
  7. 3 つのサンプルが合成され、個別に浄化すると同じ実験を繰り返すことによって標準偏差を取得します。
  8. 比21以下の方程式で記述されるような方法で FRET 効率を計算します。
    Equation
    DA550: ドナーとアクセプター 550 nm 励起でサンプルのアクセプター ピーク蛍光強度。
    D550: 550 nm 励起のドナーのみのサンプルのアクセプター発光範囲で蛍光強度。
    ダ650: ドナーとアクセプター 650 nm 励起でサンプルのアクセプター ピーク蛍光強度。

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Representative Results

OxDNA16,17から 6 によって設計された 6 DNA のアコーディオン ラックをシミュレートし、結果を図 6に示します。シミュレーション結果から構造の歪みのない意図されていた構造が形成されることが確認されました。

図 7の TEM イメージ 2、8、13、20 bp のロックの長さで構成されている構造のイメージです。画像で、ロックの長さが長くなると、構造 (図 8 a) の角度は小さくなります。傾向を統計的に分析するには、平均および複数の構成された構造の角度 (図 8 a) の標準偏差は、(図 8 b) を得られました。また、フレット測定結果表示構造の変化とその速度、構造の傾向のほかに示すように TEM 像 (図 8)。

分析手順から構造構成に必要なロックの数など DNA アコーディオン ラックのキャラクタリゼーションと再構成速度を求めた。

Figure 1
図 1。再構成可能な DNA アコーディオン ラック。A.の DNA アコーディオン ラック剛性の DNA 梁と各ビームを接続する複数の柔軟な関節で構成されています。アコーディオンのラックは、異なる DNA ロックの長さに従って構成されます。さまざまな 2 D および 3 D のプラットフォームは、プラットフォームを変更することにより設計できます。B.異なった長さの DNA ロックの交配による DNA アコーディオン ラックの再構成を実現します。'無料州' の構造の余分なヌクレオチドがクロス オーバー (または関節、黄色) に追加される (2 つのヘリックスを含む), DNA ビーム間緩やかな接続による角度変更できます (上の部分)。両方の隣接する梁の粘着部分にブリッジの部分の様々 な長さを持つ DNA ロックの交配は、ロックされた状態を生成します (下部)。燃料鎖 DNA ロックの足掛かり部分 (青) を使用して鎖変位は構造のロック状態から DNA ロックを外し、状態を自由に変更します。DNA ロックのさまざまなライブラリを使用してプロセスを繰り返すことによって構造を再構成して、別の角度で。この図は、以前の研究11から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 2
図 2 6 6 によってアコーディオンのラックは、caDNAno を使用して設計されています。 。DNA アコーディオン ラックの 14 の梁は、番号し、caDNAno の格子パネルに描かれました。この図は、以前の研究11から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 3
図 3。足場のルーティング アルゴリズム。A.足場アコーディオン ラックの反対側にある頂点でアセンブリでは使用されていません。B. 7 つの閉じたループは、足場のクロス オーバーを生成することによって単一のループにマージされます。足場の交差の位置は以前の文献から適応と、少なくとも六つの足場のクロス オーバー ポイントが必要です。この図は、以前の研究11から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 4
図 4。構成ファイルの例です。構成ファイルには、刻み、エネルギー、ボックスのサイズと向きの情報などの全般情報が含まれています。構成ファイルで左に 9 つの列は、それぞれ位置ベクトル、バックボーン基本ベクトルと法線ベクトルです。右側の 6 つの列は、速度と角速度です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 5
図 5。前に、と変更後の構成ファイルの視覚化します。バックボーン ベースと通常のベクトルの位置、回転変換を使用してアコーディオンのラックの構造情報を反映して構成ファイルの情報が変更されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 6
図 6。OxDNA からシミュレーション結果。長さが 2、8、13、20 bp DNA ロックとアコーディオンのラックがシミュレートされました。18 サイトをロックが使用されました。DNA と 6 6 によってアコーディオン ラック ロック長さがA 2 B 8 bp bp、 C 13 bp とD 20 bp をシミュレートしているとcogil で可視化した。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 7
図 7。6 で構成された 6 DNA アコーディオン ラックの TEM 画像。A 2 のロックの長さと構造 bp、 B 8 bp、 C 13 bp とD 20 bp をイメージしました。18 サイトのロックは、この実験のために使用されました。(スケール バー: 100 nm)。この図は、以前の研究11から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 8
図 8。2 D のアコーディオン ラックの角制御します。6-6 でメッシュから成るアコーディオンのラックの角度だった DNA ロックの長さによって制御されます。A. 2、8、13、20 bp の長さと DNA ロックをアコーディオンのラックの 18 ロック サイトに追加すると、角度 (青) が構成されている代表的な TEM 画像に見られるように。染料のペア、Atto647N、および Atto550 は、FRET 効率分析の構造にアタッチされます。(スケール バー: 100 nm)B.設定角度の分布。オーバーレイされる傾向線 (グレー) が 2 メッシュあたり 1 ロックのグラフからです。さらに、x 軸のグリッドは 1 ロック 2 メッシュごとのグラフに同じグリッドに対応します。バーは、平均の角度から 1 つの標準偏差を表します。C. FRET 効率の分布。バーは、平均効率から 1 つの標準偏差を表します。+は、無料版からの移行状態がロックされているか、異なるインキュベーション時間を計測した逆間効率変化を心配しないでください。2 の長さと DNA ロック bp が使用されました。バーは、平均効率から 1 つの標準偏差を表します。この図は、以前の研究11から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

名 シーケンス 長さ
定番 1 ATAAGAGGTCATTTTTGCGGATGGATGTTACT 32
定番 2 CAAAGTTACCAGAAGGAAACCGAGACATCGGG 32
主食 3 ACAATGAAATAGCAATAGCTATCTCAAATAAA 32
主食 4 CGCTAATATGAACGGTGTACAGACCAGGCGCATAGGCTGGGAACAAAGTCAGAGGG 56
主食 5 CAGAAAACCCGGAATAGGTGTATCACCGTACTCAGGAGGTCCCCCTCAAATGCTTT 56
主食 6 AGTGAGAATAGAAAGGTATGATATTCAACCGTTCTAGCTGATAAATTATCAACAGT 56
主食 7 ATTTGGGGCGCGAGCTATATGGTT 24
定番 8 GCCTTTATTTCAACGCAAGGATAATTAATGGA 32
定番 9 TCAATTACCCACTACGAAGGCACCGGTAAAAT 32
定番 10 ATTCAGTGAATAAGGCTTGCCCTGAAAACAGA 32
定番 11 AGAAACAATAACGGATTCGCCTGATAGCCGAA 32
定番 12 ATCAATATCTGGTCAGTTGGCAAAAGTAACAA 32
定番 13 CGGAGACAGTCAAATCACCATCAAGGGTTAGA 32
定番 14 GAGAATTAACTGAACACGAAACAAAGTACAACGGAGATTTGTATCATCGAAGCGCA 56
定番 15 CGAGAGGGTTGATATAAGTATAGCATAGGAAC 32
定番 16 CCCTTATTAGCGTTTGCCATCTTTTGGTGCCG 32
定番 17 GTTTTCATCGGCATTTATGCCGGA 24
定番 18 GTAGCAACTTCCAGTAAGCGTCATGTCTCTGA 32
定番 19 AGCTAATGCAGAACGCAATAAACA 24
定番 20 CCGTAATGGGATAGGTCACGTTGGGCCTATTT 32
定番 21 ACCAGAGCCACCACCGCGAGAGGC 24
定番 22 AGGCTCCAAAAGGAGCCGTTTACCAGACGACGATAAAAACCAAAATAGAAAATCTC 56
定番 23 GCCGGAAGGAAACGCAATAATAACGGAATACCCAAAAGAACTCACAATTCCACACA 56
ステープル 24 TTTTTCACCGGTGTCTGGAAGTTTCATTCCATATAACAGTACTAAAGGAATTGCGA 56
定番 25 ATCAGGTCTTTACCCTCGCATTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTGACCATA 56
定番 26 TGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTGACATTCA 32
定番 27 AATAAAGAAATTGCGTAGATTTTCAGCTGCTC 32
定番 28 CCCAATCCTCGCACTCCAGCCAGCTTTCCGGCACCGCTTCAAAATAAACAGCCATA 56
定番 29 AAAGACTTCAAATATCATCAAAAGAATAGCCCGAGATAGGGTTGAGTGATTAAGAG 56
主食 30 GTAGCGACAGAATCAAGTTTGCCTGATTTAGA 32
定番 31 GCCACCCTCAGAACCGCCACCCTCAACAAGAG 32
定番 32 AAGCAAGCCGTTTTTATTTTCATCTCCTGATT 32
定番 33 GAGGGTAGCTATTTTTGAGAGATCCGTCAGAC 32
定番 34 TATGACCCTGTAATACTCCCATCCTAATTTACGAGCATGTAGAAACCAGTTGTACC 56
定番 35 GATTAGAGAGTACCTTAACAGTGCCCGTATAAACAGTTAATGCCCCCTAACTCCAA 56
定番 36 CGTCTTTCCAGACGTTGTAGGAATCATTACCGCGCCCAATAGCAAGCACGATCTAA 56
定番 37 TTTAACGTCAAAAATGAGTGAGACGGGCAACAGCTGATTGCCCTTCACAAGAAACG 56
定番 38 TTTAACGGGGTCAGTGCCTTGAGTATAAGGGA 32
定番 39 AATTGTGTGCAAAATCCCTTATAAGGTGGTTC 32
主食 40 ACCAGTAGCACCATTACCATTAGCTTTCAGGG 32
定番 41 AAACATCAAGAAAACAAAATTAATTCACATTA 32
定番 42 TTGGCCTTGATATTCATCATCTTT 24
定番 43 TGCATCAATCAACAGTTGAAAGGAATTGAGGAAGGTTATCATTATAGTCAGAAGCA 56
定番 44 GCCCCAGCAGGCGAAAATCCTGTTAGGGGACG 32
定番 45 TCCTCATTAAAGCCAGAATGGAAAAGCAAGAA 32
定番 46 GAGCCTAATTTGCCAGGGGGGTAATAGTAAAATGTTTAGACTGGATAGAACGAGCG 56
定番 47 TAAGAGCAACACTATCATAACCCTTTAACGTC 32
定番 48 ATAGCAAGCCCAATAGGAACCCATGCAAAATC 32
定番 49 CATAAAAACTTAGAGCTTAATTGCTGAATATAATGCTGTATAGCAGCCTTTACAGA 56
定番 50 ATTTACCGGGCTACAGAGGCTTTGGAACGAGG 32
定番 51 GTGCCTAATGAGTGAGAATGCAGATACATAACGCCAAAAGGAATTACGAAGTGTAA 56
主食 52 ATACCGATAGTTGCGCATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTTTCTTAA 56
定番 53 ATAACCGATACCGAAGCCCTTTTTAAGAAAAGTAAGCAGAAATGACAACAACCATC 56
定番 54 TCAGAGCCGCCACCCTCAGAACCGGCTCAACA 32
主食 55 TTTTGCAAAAGAAGTTTTGCCAGAAATCAAAA 32
定番 56 GGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTAAGAAACC 32
ステープル 57 ACATGTTCAAAGACACCACGGAATCATATAAA 32
定番 58 CTGTGTGAAATTGTTAGAGTAATGTGTAGGTAAAGATTCAAAAGGGTGTGGTCATA 56
定番 59 TTTCGAGGCCGGATATTCATTACCCAAATCAACGTAACAAAATTGTATCGGTTTAT 56
定番 60 CTTTAGGAGCACTAACAACTAATAAGCCCCAA 32
定番 61 AGATTAGTTGCTATTTTACAAAGGCTATCAGGTCATTGCCTGAGAGTCTTGAAGCC 56
定番 62 GAGCCGCCGCCAGCATTGACAGGACTGACCTT 32
定番 63 GAAACCAGGCAAAGCGCCATTCGCTCATAGCC 32
定番 64 CATCAAGAGTAATCTTGACAAGAACACCACCA 32
主食 65 AACCTTGCTTCTGTAAATCGTCGCTTATCAAC 32
定番 66 TAGTTAGCGACAACTCGTATTAAATCCTTTGCCCGAACGTGTAGCATTCCACAGAC 56
定番 67 ACCGATTGAGGGAGGGAAGGTAAAGGGGGATG 32
定番 68 TACCAGCGCCAAAGACAAAAGGGCGTTTAGCT 32
定番 69 TCATATATTTTAAATGCAATGCCTAAAACGAA 32
定番 70 ACATTATCATTTTGCGTATTGACG 24
定番 71 CGGAACCTATTATTCTGAAACATGCGGATTGA 32
定番 72 CCTGAGAGATATTTTGTTAAAATTTAAATTGT 32
定番 73 GAAACCATCGATAGCAAATCAGAT 24
定番 74 CTCAGAGCCGCCACCATATTGGGC 24
主食 75 CACCGACTTGAGCCATTTGGGAATACACTGAG 32
定番 76 TCATGAGGAAGTTTCCATTAAACGTTTGCGGG 32
定番 77 AAACAGGAAGATTGTATAAGCAAATAAAATAT 32
定番 78 ATCGTCACCCTCAGCAGCGAAAGAAGACTTTT 32
定番 79 ATCAACATTAAATGTGTTGTTCCA 24
主食 80 TGCAGGGAGTTAAAGGAACGAAAGAGGCAAAAGAATACACTAAAACACTTCGGTCG 56
定番 81 ACGTAATGCTGAGCAAAAGAAGATTATTCATT 32
定番 82 AATCGATGAACGGTAATCGTAAAATTAGTACC 32
定番 83 GACCCCCAGCGATTATACCAAGCGGAGGCAGG 32
定番 84 CGAAATCCGCGACCTGGCCTGATA 24
主食 85 GCCATCAAAAATAATTCGCGTCTGAGTGCCGT 32
定番 86 TCGGCTGTCTTTCCTTATCATTCCATTACCTT 32
定番 87 CAGACCGGGGGCGCATCGTAACCGTGCATCTGCCAGTTTGTTTAATTCGAGCTTCA 56
定番 88 GTTTGGAACAAGAGTCCACTATTACCTGTAGC 32
定番 89 AACAGTACATAAATCAATATATGTCGGGAGAA 32
定番 90 GACGTTGGGAAGAAAAATCTACGTCTGGCATG 32
定番 91 CAAAATCGCGCAGAGGCGGGAAAC 24
定番 92 ATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTGATGAAAC 32
定番 93 CCCCGGTTGATAATCACGTCCAAT 24
定番 94 ATGCCTGCAGGTCGACAAGAACGGGTATTAAACCAAGTACCGCACTCACCAGTGCC 56
主食 95 GTTTGGATTATACTTCTGAATAATTGATTCCC 32
定番 96 ACCGAACTGACCAACTTTGAAAGATAATAAGT 32
定番 97 GCCAGGGTGGTTTTTCTTTTCACCCCTCAGAG 32
定番 98 CAGTTGAGATTTAGGAATACCACATACATTTA 32
定番 99 TAGCCGGAACGAGGCGCAGACGGTTCCTTTTG 32
主食 100 AGTATTAGACTTTACAAACAATTCCGTAATCA 32
定番 101 CTTGCGGGAGAACCGCCACCCTCAGAGCCACCACCCTCATGAGGCGTTTTAGCGAA 56
定番 102 TTAAGAACTGGCTCATATCAATAA 24
主食 103 CATACAGGCAAGGCAAAGAATTAGAAGTTTAT 32
定番 104 ATTGAGTTAAGCCCAAACATGGCTTTTGATGATACAGGAGTGTACTGGGAGATAAC 56
定番 105 ATAGAAGGCTTATCCGGTATTCTACGGAAACG 32
定番 106 CTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGATTTGAATA 32
定番 107 CTTACCAAGATTAGAGCCGTCAATAGATAATACATTTGAGCCCAGCTACAATTTTA 56
定番 108 ACCTTGCTGAACCTCAAAAGTATTAAGAGGCTGAGACTCCTCAAGAGAAAAAATCT 56
定番 109 TTTGTCACAATCAATAGAAAATTCCAATAAAT 32
定番 110 CAATTCTATTCAACTTTAATCATTCTTGAGAT 32
定番 111 ACGACAGTATCGGCCTCAGGAAGAGCTGGTTT 32
定番 112 ACTGCGGAATCGTCATAAATATTCATGTCAAT 32
定番 113 TTTCGTCACCAGTACAAACTACAAATCACCGT 32
定番 114 AATTCTGCGAACGAGTAGATTTAGTCCTGATT 32
定番 115 GAAATTATTCATTAAAGGTGAATTTTTAAAAG 32
定番 116 ACCAGAAGGAGCGGAATTATCATCTCGGTGCG 32
定番 117 AATTCGTAACGAGAAACACCAGAACGAGTAGTAAATTGGGGAGGATCCCCGGGTAC 56
定番 118 ATTAAGACTCCTTATTACGCAGTACCAGTCAG 32
定番 119 GGTTTAATCTAATAGTAGTAGCATGGTGGCAT 32
ステープル 120 AAACCGTCTTAGCGGGGTTTTGCTCAGTACCAGGCGGATATGGACTCCAACGTCAA 56
定番 121 TATCAAAATTATTTGCAGAAAGGC 24
定番 122 ACAACATTATTACAGGTAGAACCC 24
定番 123 CCCGTCGGATTCTCCGTGGGAACAAACCCTCA 32
定番 124 ACAATTTCATTTGAATTACCTTTTAGATTCAT 32
定番 125 GCTAAACACATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGAAATGAATTTTCTGTAT 56
定番 126 AATAGATAAGTCCTGAACAAGAAAGAGTGAAT 32
定番 127 AAAGCTAATGTTAGCAAACGTAGAAAATACATACATAAAGTTAAGCAATAAAGCCT 56
定番 128 TGTTTTAAATATGCAACTAAAGTACGCCTCCC 32
定番 129 ATACAGTAACAGTACCAGGCATAG 24
定番 130 GTAAAACGTTTGACCATTAGATACATTTCGCAAATGGTCACAGGGTTTTCCCAGTC 56
定番 131 AGTTGCAGCAAGCGGTCGCCTGGC 24
定番 132 ATGGCAATTCATCAATTCGAGAAC 24

表 1。短鎖シーケンス

名 シーケンス
Toehold_1 AGAAGTCG
Toehold_2 AGGTATGG
Toehold_3 CTCCACTC
Toehold_4 GTGTCCGA
Toehold_5 AAGTAGAC
Toehold_6 GAGTCGCT
Toehold_7 AGTGTCTA
Toehold_8 GTATCGTG
Toehold_9 CATCACAG
Toehold_10 CGAGACTT
Toehold_11 ACGGACGA
Toehold_12 GCCTACTC
Toehold_13 GATGTGGA
Toehold_14 GCGTGCGT
Toehold_15 GTGGACAA
Toehold_16 TACGACTG
Toehold_17 CAGCCGTG
Toehold_18 TGCCGCAT

表 2。ストランド変位実験のための足掛かりのシーケンス

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Discussion

このプロトコルは、設計、シミュレーション、合成、および基本的な 2D DNA アコーディオン ラックの解析から全体のプロセスを紹介します。変更された設計とシミュレーション ルールは記載柔軟性14,15のクロス オーバーで、DNA アコーディオン ラックはヌクレオチドという点で標準的な DNA 折り紙の設計ルールが異なるためにをされています。このことから、我々 はプロトコルは DNA アコーディオン ラックを用いた様々 な研究を加速することが期待します。さらに、説明されているプロトコルは DNA ナノ構造ではなく、標準的な DNA の折り紙を使用して他の研究にも適用できます。

元の研究論文に示す基本的な 2 D 構造以外の構造で説明したプロトコルの変更でデザインを行うことができます。簡単に言えば、ボクシング グローブ スプリング構造は、基本モデルからビームの数と長さを変更することによって設計されています。2D アコーディオン ラック構造の両端を接続して 3 D ナノチューブ構造を作成もできます。しかし、3 D 構造をシミュレートするためビームの初期位置は、3 D 空間で考慮すべき、ビームの初期状態があるが曲がっているはず。したがって、計算より多くの変換が必要です。デザインとさまざまな 2D および 3D DNA アコーディオン ラックの構造は将来の支援プログラムの開発によって実施されるシミュレーション研究します。

速度と作動の再現性は、動的 DNA のナノテクノロジーの分野で重要な要因です。電気の外部に応答する動的な最近の DNA の構造または磁場を提案し、高速22,23運営.DNA アコーディオン ラックが複数の DNA 梁の集合的な作動を有効にしながら、以来、DNA ストランド変位に基づいて作動に再構成速度はかなり改良されません。さらにアプリケーションは、外部刺激への反応は、DNA ロック設計を最適化または別の外部刺激を用いたによって改善されるべき。

再構成可能なアコーディオン構造、薬の分子など様々 な機能性材料の応用研究として、ナノ粒子、または蛋白質構造に接続できます。このため、分子は意図されていた位置に存在する主食に接続できます。全体的にみて、このプロトコルとその修正を通じて様々 な応用研究を実施できます。

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Disclosures

著者がある何も開示するには

Acknowledgments

この研究は、国立研究財団の Korea(NRF) 省の科学と ICT (MSIT) (2015K1A4A3047345) Nano· によって資金を供給を通じてグローバル研究開発センター プログラムによって部分的に支持されました。材料技術開発プログラムを通じて、国立研究財団の韓国 (NRF) 科学省と ICT (MSIT) (2012M3A7A9671610) によって資金を供給します。ソウル大学校工学研究所は、この作品の研究施設を提供しました。著者は、フレットの分析のための蛍光分光法に関するユン ・ テヨン (生物科学, ソウル国立大学) への感謝をご了承ください。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
M13mp18 Single-stranded DNA NEB N4040s
1M MgCl2 Solution Biosesang M2001
Tris-EDTA buffer Biosesang T2142
Nuclease-Free Water Qiagen 129114
5M Sodium Chloride solution Biosesang s2007
PEG 8000 Sigma Aldrich 1546605
10N NaOH Biosesang S2038
Uranyl formate Thomas Science C993L42
Thermal cycler C1000 Biorad
Nanodropic 2000 Thermo Fisher Scientific
TEM (LIBRA 120)   Carl Zeiss
Fluorometer Enspire 2300 Perkin-Elmer
Centrifuge Labogene LZ-1580

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References

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工学問題 138、DNA ナノマシン、DNA のナノテクノロジー、DNA ナノ構造、DNA 折り紙、組み立て式、caDNAno、oxDNA
再構成可能な DNA アコーディオン ラックの設計と合成
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Choi, Y., Choi, H., Lee, A. C., Kwon, S. Design and Synthesis of a Reconfigurable DNA Accordion Rack. J. Vis. Exp. (138), e58364, doi:10.3791/58364 (2018).

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