Nanoparticelle di ossido di ferro rivestite con Polyethyleneimine come un veicolo per la consegna di piccolo RNA interferente ai macrofagi In Vitro e In Vivo
Summary
Descriviamo un metodo di utilizzo polyethyleneimine (PEI)-rivestito di nanoparticelle di ossido di ferro superparamagnetico per macrofagi trasfezione con siRNA. Queste nanoparticelle è in grado di fornire in modo efficiente siRNA di espressione del gene bersaglio macrofagi in vitro e in vivo e silenzio.
Abstract
A causa del loro ruolo critico nella regolazione della risposta immunitaria, i macrofagi sono stati continuamente oggetto di intensa ricerca e rappresentano un promettente bersaglio terapeutico in molti disturbi, quali malattie autoimmuni, aterosclerosi e cancro. Silenziamento genico RNAi-mediata è un valido approccio di scelta per sonda e modificare la funzione del macrofago; Tuttavia, la transfezione di macrofagi con siRNA è spesso considerata di essere tecnicamente impegnativo e, attualmente, sono disponibili alcune metodologie dedicati al trasferimento siRNA ai macrofagi. Qui, presentiamo un protocollo di utilizzo di nanoparticelle di ossido di ferro superparamagnetico rivestite con polyethyleneimine (PEI-SPIONs) come veicolo per la somministrazione mirata di siRNA di macrofagi. PEI-SPIONs sono capaci di legare e di condensazione completamente siRNA quando il rapporto di peso di Fe: siRNA raggiunge 4 e sopra. In vitro, queste nanoparticelle possono fornire in modo efficiente siRNA in macrofagi primari, così come nella linea cellulare del 264,7 macrofago-come, senza compromettere la vitalità cellulare presso la dose ottimale per la transfezione, e, in definitiva, essi inducono destinazione di siRNA-mediata del silenziamento genico. Oltre ad essere usato per trasfezione con siRNA in vitro , PEI-SPIONs sono anche uno strumento promettente per la consegna di siRNA a macrofagi in vivo. In considerazione di sue caratteristiche unite di proprietà magnetiche e capacità di silenziamento genico, sistematicamente amministrati PEI-SPION/siRNA particelle dovrebbero non solo di modulare la funzione dei macrofagi, ma anche per attivare i macrofagi a essere imaged e tracciati. In sostanza, PEI-SPIONs rappresentano una piattaforma nonviral semplice, sicura ed efficace per la consegna di siRNA ai macrofagi sia in vitro che in vivo.
Introduction
I macrofagi sono un tipo di cellule immuni innate distribuiti in tutti i tessuti del corpo, anche se in quantità diverse. Producendo una varietà di citochine e altri mediatori, giocano ruoli critici nella difesa ospite contro l’invasione di microrganismi patogeni, nella riparazione del tessuto dopo la lesione e nel mantenimento di omeostasi del tessuto1. A causa della loro importanza, i macrofagi sono stati continuamente oggetto di intensa ricerca. Tuttavia, nonostante la sua prevalenza negli studi di funzione e regolazione genica, silenziamento genico siRNA-mediata è meno probabilità di riuscire a macrofagi perché queste cellule — in particolare, macrofagi primari — spesso sono difficili a transfect. Ciò può essere ascritto ad un grado relativamente elevato di tossicità associata con approcci di transfezione più consolidati in cui la membrana cellulare è chimicamente (ad es., con polimeri e lipidi) o fisicamente (ad es., mediante elettroporazione e pistole di gene) interrotto per consentire siRNA molecole attraversano la membrana, riducendone drasticamente vitalità2,3 dei macrofagi. Inoltre, i macrofagi sono dedicati fagociti ricchi di enzimi degradativi. Questi enzimi possono danneggiare l’integrità del siRNA, indebolendo la sua efficienza silenziamento anche se siRNA gene-specifico è stato consegnato in cella3,4. Di conseguenza, un sistema di consegna efficace del macrofago-mirati siRNA ha bisogno proteggere l’integrità e la stabilità di siRNA durante la consegna4.
È sempre più evidente che i macrofagi disfunzionali siano implicati nell’iniziazione e progressione di alcuni comuni disturbi clinici come cancro, aterosclerosi e malattie autoimmuni. Per questo motivo, modulando la funzione del macrofago con, per esempio, siRNA, sta emergendo come una metodologia attraente per il trattamento di questi disturbi5,6,7. Nonostante i progressi realizzati, una sfida importante della strategia di trattamento basati su siRNA è la specificità di povera cella di siRNA sistematicamente amministrato e l’assorbimento di siRNA insufficiente da parte dei macrofagi, che di conseguenza portare a effetti collaterali indesiderati. Confrontato con acido nucleico libero terapeutica che in genere mancano della selettività cellulare ottimale e spesso portare a effetti avversi, caricati nanoparticelle (NPs), a causa della loro tendenza spontanea di essere catturato dal sistema reticoloendoteliale, fuori bersaglio possono essere progettati per il targeting passivo a macrofagi in vivo, permettendo una migliore efficacia terapeutica con effetti collaterali minimi8. NPs corrente esplorato per il rilascio di molecole di RNA includono nanovettori inorganici e liposomi vari polimeri9. Tra loro, polyethyleneimine (PEI), un tipo di polimeri cationici in grado di legare e di condensazione di acidi nucleici in NPs stabilizzato, Mostra il RNA più alto offrendo capacità9,10. PEI protegge gli acidi nucleici da degradazione enzimatici e non enzimatici, media il loro trasferimento attraverso la membrana cellulare e promuove il loro rilascio intracellulare. Anche se inizialmente introdotto come un reagente di consegna di DNA, PEI successivamente è stata dimostrata per essere una piattaforma attraente per in vivo siRNA consegna, o in locale o sistemica9,10.
Nanoparticelle di ossido di ferro superparamagnetico (SPIONs) hanno mostrato grande promessa nel campo della biomedicina, a causa delle loro proprietà magnetiche, biocompatibilità, dimensioni paragonabili agli oggetti biologicamente importanti, alto rapporto superficie-zona–volume e facilmente adattabile superficie per agente allegato11. Per esempio, a causa della loro utilità potenziale come un agente di contrasto e di rapido assorbimento da parte dei macrofagi, SPIONs sono emersi come uno strumento clinico a immagine del tessuto macrofagi12. Mentre SPIONs inoltre sono stati studiati estesamente come acido nucleico consegna veicoli11,13,14,15, a nostra conoscenza, la letteratura contiene pochi rapporti di SPIONs come vettore per consegna del macrofago-mirati siRNA. Per la consegna del gene di SPIONs, la loro superficie è solitamente rivestita con uno strato di polimeri cationici idrofilici su cui caricati negativa degli acidi nucleici può essere elettrostaticamente attratto e legati. Qui, presentiamo un metodo per la sintesi di SPIONs cui superficie viene modificata con basso peso molecolare (10 kDa), ramificata PEI (PEI-SPIONs). Questi nanoplatforms magnetico sono quindi impiegati per condensare siRNA, formando dei complessi PEI-SPION/siRNA che permettono il trasporto di siRNA nella cellula. Abbiamo ragione quella spontanea fagocitosi di SPIONs dalle cellule del sistema reticoloendoteliale16, accoppiato con la forte capacità di associazione e condensazione di acidi nucleici da PEI, rende PEI-SPIONs adatto per il trasporto efficiente di siRNA in macrofagi. I dati presentati qui sostengono la fattibilità del silenziamento genico PEI-SPION/siRNA-mediata nei macrofagi in cultura come pure in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
I macrofagi sono refrattari a transfect da approcci nonviral comunemente utilizzati, quali l’elettroporazione, liposomi cationici e specie del lipido. Qui abbiamo descritto un metodo affidabile ed efficiente per transfect macrofagi con siRNA. Utilizzando il presente protocollo, oltre 90% di macrofago-come 264.7 celle grezze (Figura 2B) e macrofagi peritoneali di ratto18 può essere trasfettate con siRNA senza significativa compromissione dell’attuabilità delle cellul…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dal National Natural Science Foundation of China (81772308) e nazionali chiave di ricerca e sviluppo programma della Cina (n. 2017YFA0205502).
Materials
| DMEM | Gibco | C11995500BT | Warm in 37°C water bath before use |
| Fetal bovine serum | Gibco | A31608-02 | |
| Penicillin/streptomycin (1.5 ml) | Gibco | 15140122 | |
| Tetrazolium-based MTS assay kit | Promega | G3582 | For cytotoxicity analysis |
| RAW 264.7 cell line | Cell Bank of Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China | TCM13 | |
| Tissue culture plates (6-well) | Corning | 3516 | |
| Tissue culture dishes (10 cm) | Corning | 430167 | |
| RNase-free tubes (1.5 ml) | AXYGEN | MCT-150-C | |
| Centrifuge tubes (15 ml) | Corning | 430791 | |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | |
| Wistar rats | Shanghai Experimental Animal Center of Chinese Academy of Sciences |
||
| Bacillus Calmette–Guérin freeze-dried powder | National Institutes for Food and Drug Control, China |
for inducing adjuvant arthritis in rats | |
| siRNA | GenePharma (Shanghai, China) | ||
| Cy3-siRNA | RiboBio (Guangzhou, China) | ||
| Polyethyleneimine (10 kDa) | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | E107079 | |
| Ammonia water | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | A112077 | |
| Oleic acid | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | O108484 | |
| Dimethylsulfoxide | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | D103272 | |
| FeSO4•7H2O | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10012118 | |
| FeCl3•6H2O | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10011918 | |
| Dimercaptosuccinic acid | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | D107254 | |
| ultrafiltration tube | Millipore | UFC910096 | |
| Tetramethylammonium hydroxide solution | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | T100882 | |
| Particle size and zeta potential analyzer | Malvern, England | Nano ZS90 |
References
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