Polyethyleneimine beschichteten Eisenoxid-Nanopartikeln als Vehikel für die Lieferung von kleinen interferierende RNA an Makrophagen In Vitro und In Vivo
Summary
Wir beschreiben eine Methode der Verwendung von Polyethyleneimine (PEI)-superparamagnetischen Eisenoxid-Nanopartikeln für transfecting Makrophagen mit SiRNA beschichtet. Diese Nanopartikel können effizient SiRNA zu Makrophagen in Vitro und in Vivo und Stille Ziel Genexpression liefern.
Abstract
Wegen ihre entscheidende Rolle bei der Regulation der Immunantwort Makrophagen kontinuierlich Gegenstand intensiver Forschung und stellen eine vielversprechende therapeutische Ziel bei vielen Erkrankungen wie Autoimmunerkrankungen, Arteriosklerose und Krebs. RNAi vermittelte Gen-silencing ist ein wertvoller Ansatz, Sonde und Makrophagen Funktion zu manipulieren; jedoch die Transfektion von Makrophagen mit SiRNA wird oft als technisch anspruchsvoll, und zur Zeit gibt es einige Methoden, die die SiRNA-Übertragung auf Makrophagen gewidmet. Hier präsentieren wir ein Protokoll mit Polyethyleneimine beschichteten superparamagnetischen Eisenoxid-Nanopartikeln (PEI-Mondfotos) als Vehikel für die gezielte Bereitstellung von SiRNA zu Makrophagen. PEI-Mondfotos sind in der Lage, verbindliche und vollständig kondensiert SiRNA erreicht die Fe: SiRNA-Gewichts-Verhältnis 4 und vor. In-vitro-, diese Nanopartikel können effizient SiRNA liefern, in primären Makrophagen sowie in die Makrophagen-wie RAW 264,7 Zell-Linie, ohne kompromittierende Zellviabilität an die optimale Dosis für Transfection und, letztlich, sie induzieren SiRNA-vermittelten Ziel Gen-silencing. Neben für in-vitro- SiRNA Transfection verwendet, sind PEI-Mondfotos auch ein viel versprechendes Instrument für die Bereitstellung von SiRNA zu Makrophagen in Vivo. Angesichts seiner kombinierten Funktionen der magnetische Eigenschaft und Gen-silencing Fähigkeit dürften systemisch verabreichten PEI-SPION/SiRNA-Partikel nicht nur zu modulieren, Makrophagen-Funktion, sondern auch aktivieren Makrophagen abgebildet und nachverfolgt werden. PEI-Mondfotos repräsentieren im Wesentlichen eine einfache, sichere und wirksame nonviral Plattform für SiRNA Lieferung an Makrophagen in Vitro und in Vivo.
Introduction
Makrophagen sind eine Art von angeborenen immunen Zellen verteilt in allen Körpergeweben, wenn auch in unterschiedlichen Mengen. Durch die Herstellung einer Vielzahl von Zytokinen und anderer Vermittler, spielen sie wichtige Rollen in der Wirt Verteidigung gegen eindringende mikrobielle Krankheitserreger, in Reparatur von Gewebe nach Verletzungen und bei der Aufrechterhaltung der Homöostase-Gewebe1. Aufgrund ihrer Bedeutung waren Makrophagen kontinuierlich Gegenstand intensiver Forschung. Jedoch trotz der Prävalenz in der Genregulation und Funktionsstudien, SiRNA-vermittelten Gen-silencing ist weniger wahrscheinlich, da in Makrophagen erfolgreich diese Zellen – insbesondere primäre Makrophagen – sind oft schwer zu transfizieren. Dies kann eine relativ hohe Toxizität im Zusammenhang mit etabliertesten Transfektion Ansätze, in denen die Zellmembran chemisch ist (z. B.mit Polymeren und Lipide) zugeschrieben werden oder körperlich (z.B.durch Elektroporation und gen Kanonen) gestört, um SiRNA-Moleküle die Membran, dadurch drastisch Makrophagen Lebensfähigkeit2,3überqueren zu lassen. Darüber hinaus sind Makrophagen spezielle Fresszellen, die reich an abbauende Enzyme. Diese Enzyme können die Integrität von SiRNA, die Stummschaltung Effizienz zu schwächen, auch wenn in der Zelle3,4Gen-spezifischen SiRNA geliefert wurde beschädigt. Daher muss eine wirksame Makrophagen ausgerichtete SiRNA Delivery-System zum Schutz der Integrität und Stabilität von SiRNA während Lieferung4.
Es wird immer offensichtlicher, dass dysfunktionale Makrophagen in der Initiierung und Progression von bestimmten gemeinsamen klinischen Erkrankungen wie Autoimmunerkrankungen, Arteriosklerose und Krebs verwickelt sind. Aus diesem Grund Modulation Makrophagen-Funktion mit, zum Beispiel, SiRNA hat als eine attraktive Methode für die Behandlung dieser Erkrankungen5,6,7aufgetaucht. Obwohl große Fortschritte erzielt wurden, ist eine große Herausforderung SiRNA basierenden Behandlungsstrategie der Arme Zelle Besonderheit der systemisch verabreichten SiRNA und die unzureichende SiRNA-Aufnahme durch Makrophagen, die somit zu unerwünschten Nebenwirkungen führen. Im Vergleich mit kostenlosen Nukleinsäure-Therapeutika, die in der Regel fehlt optimale Zelle Selektivität und führen oft zu Nebenwirkungen, Medikament beladenen Nanopartikeln (NPs), aufgrund ihrer spontanen Neigung gefangen vom retikuloendothelialen System Ziel, für passive targeting zu Makrophagen in Vivo, zulassend verbesserten therapeutischen Wirksamkeit mit minimalen Nebenwirkungen8projektierbar. Aktuelle NPs erforscht für die Lieferung von RNA-Molekülen gehören anorganische darin, verschiedene Liposomen und Polymere-9. Unter anderem zeigt Polyethyleneimine (PEI), eine Art von kationischen polymeren in der Lage zu binden und kondensierenden Nukleinsäuren in stabilisierter NPs, die höchsten RNA liefert Kapazität9,10. PEI schützt Nukleinsäuren vor enzymatischen und nonenzymatic Abbau, vermittelt ihre Übertragung über die Zellmembran und fördert ihre intrazellulären Freigabe. Obwohl zunächst als ein DNA-Lieferung-Reagenz eingeführt, zeigte sich PEI anschließend zu einer attraktiven Plattform für in Vivo SiRNA Delivery, entweder lokal oder systemisch9,10.
Superparamagnetischen Eisenoxid-Nanopartikeln (Mondfotos) zeigten viel versprechend in der Biomedizin, aufgrund ihrer magnetischen Eigenschaften, Biokompatibilität, vergleichbarer Größe auf biologisch wichtige Objekte, hohe Oberfläche-Bereich-zu-Volumen-Verhältnis und leicht anpassbar Oberfläche für Bioagent Anlage11. Zum Beispiel haben wegen ihres potenziellen Nutzens als Kontrastmittel und schnelle Aufnahme durch Makrophagen Mondfotos als klinische Lieblingswerkzeug Bild Gewebe Makrophagen12entstanden. Während Mondfotos als Nukleinsäure-Lieferung Fahrzeuge11,13,14,15, nach unserer Kenntnis auch ausgiebig studiert haben enthält die Literatur einige Berichte von Mondfotos als Träger für Makrophagen-gezielte SiRNA Lieferung. Gen-Lieferung von Mondfotos ist ihre Oberfläche in der Regel mit einer Schicht von hydrophilen kationischen polymeren beschichtet auf dem negativ geladenen Nukleinsäuren elektrostatisch angezogen und angebunden werden können. Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode zur Synthese von Mondfotos, dessen Oberfläche mit niedrigem Molekulargewicht (10 kDa), verzweigte PEI (PEI-Mondfotos) geändert wird. Diese magnetische Nanoplatforms werden dann eingesetzt, um kondensieren SiRNA, bilden PEI-SPION/SiRNA-komplexe, die SiRNA-Transport in die Zelle zu ermöglichen. Wir Grund, dass spontane Phagozytose von Mondfotos durch Zellen des retikuloendothelialen System16, gepaart mit der starken Fähigkeit der Bindung und kondensierenden Nukleinsäuren von PEI, rendert PEI-Mondfotos geeignet für den effizienten Transport von SiRNA in Makrophagen. Die hier vorgestellten Daten unterstützen die Machbarkeit des PEI-SPION/SiRNA-mediated Gene silencing in Makrophagen in Kultur als auch in Vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Makrophagen sind refraktär gegenüber von häufig verwendeten nonviral Ansätze wie Elektroporation, kationische Liposomen und Lipid Arten transfizieren. Hier haben wir eine zuverlässige und effiziente Methode, um Makrophagen mit SiRNA transfizieren. Mit Hilfe dieses Protokolls, werden über 90 % der Makrophagen-wie RAW 264,7 Zellen (Abb. 2 b) und Ratte peritonealen Makrophagen18 mit SiRNA ohne wesentliche Beeinträchtigung des die Zellviabilität transfiziert könn…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (81772308) und National Key Research and Development Program of China (Nr. 2017YFA0205502) unterstützt.
Materials
| DMEM | Gibco | C11995500BT | Warm in 37°C water bath before use |
| Fetal bovine serum | Gibco | A31608-02 | |
| Penicillin/streptomycin (1.5 ml) | Gibco | 15140122 | |
| Tetrazolium-based MTS assay kit | Promega | G3582 | For cytotoxicity analysis |
| RAW 264.7 cell line | Cell Bank of Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China | TCM13 | |
| Tissue culture plates (6-well) | Corning | 3516 | |
| Tissue culture dishes (10 cm) | Corning | 430167 | |
| RNase-free tubes (1.5 ml) | AXYGEN | MCT-150-C | |
| Centrifuge tubes (15 ml) | Corning | 430791 | |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | |
| Wistar rats | Shanghai Experimental Animal Center of Chinese Academy of Sciences |
||
| Bacillus Calmette–Guérin freeze-dried powder | National Institutes for Food and Drug Control, China |
for inducing adjuvant arthritis in rats | |
| siRNA | GenePharma (Shanghai, China) | ||
| Cy3-siRNA | RiboBio (Guangzhou, China) | ||
| Polyethyleneimine (10 kDa) | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | E107079 | |
| Ammonia water | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | A112077 | |
| Oleic acid | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | O108484 | |
| Dimethylsulfoxide | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | D103272 | |
| FeSO4•7H2O | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10012118 | |
| FeCl3•6H2O | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10011918 | |
| Dimercaptosuccinic acid | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | D107254 | |
| ultrafiltration tube | Millipore | UFC910096 | |
| Tetramethylammonium hydroxide solution | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | T100882 | |
| Particle size and zeta potential analyzer | Malvern, England | Nano ZS90 |
References
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723 (2011).
- Maeß, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. Journal of Visualized Experiments. (91), e51960 (2014).
- Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The Expression of Exogenous Genes in Macrophages: Obstacles and Opportunities. Macrophages and Dendritic Cells. , 123-143 (2009).
- Zhang, M., Gao, Y., Caja, K., Zhao, B., Kim, J. A. Non-viral nanoparticle delivers small interfering RNA to macrophages in vitro and in vivo. PLoS ONE. 10 (3), e0118472 (2015).
- Davignon, J. -. L., et al. Targeting monocytes/macrophages in the treatment of rheumatoid arthritis. Rheumatology. 52 (4), 590-598 (2012).
- Brown, J. M., Recht, L., Strober, S. The promise of targeting macrophages in cancer therapy. Clinical Cancer Research. 23 (13), 3241-3250 (2017).
- Karunakaran, D., et al. Targeting macrophage necroptosis for therapeutic and diagnostic interventions in atherosclerosis. Science Advances. 2 (7), e1600224 (2016).
- Prosperi, D., Colombo, M., Zanoni, I., Granucci, F. Drug nanocarriers to treat autoimmunity and chronis inflammatory diseases. Seminars in Immunology. 34, 61-67 (2017).
- Höbel, S., Aigner, A. Polyethylenimines for siRNA and miRNA delivery in vivo. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 5 (5), 484-501 (2013).
- Whitehead, K. A., Langer, R., Anderson, D. G. Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 8 (2), 129 (2009).
- Liu, G., et al. N-Alkyl-PEI-functionalized iron oxide nanoclusters for efficient siRNA delivery. Small. 7 (19), 2742-2749 (2011).
- Weissleder, R., Nahrendorf, M., Pittet, M. J. Imaging macrophages with nanoparticles. Nature Materials. 13 (2), 125 (2014).
- Magro, M., et al. Covalently bound DNA on naked iron oxide nanoparticles: Intelligent colloidal nano-vector for cell transfection. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects. 1861 (11), 2802-2810 (2017).
- Abdelrahman, M., et al. siRNA delivery system based on magnetic nanovectors: Characterization and stability evaluation. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 106, 287-293 (2017).
- Zhang, H., Lee, M. -. Y., Hogg, M. G., Dordick, J. S., Sharfstein, S. T. Gene delivery in three-dimensional cell cultures by superparamagnetic nanoparticles. ACS Nano. 4 (8), 4733-4743 (2010).
- Moghimi, S. M., Hunter, A. C., Murray, J. C. Long-circulating and target-specific nanoparticles: theory to practice. Pharmacological Reviews. 53 (2), 283-318 (2001).
- Harvey, A. E., Smart, J. A., Amis, E. Simultaneous spectrophotometric determination of iron (II) and total iron with 1, 10-phenanthroline. Analytical Chemistry. 27 (1), 26-29 (1955).
- Duan, J., et al. Polyethyleneimine-functionalized iron oxide nanoparticles for systemic siRNA delivery in experimental arthritis. Nanomedicine. 9 (6), 789-801 (2014).
- Fröhlich, E. The role of surface charge in cellular uptake and cytotoxicity of medical nanoparticles. International Journal of Nanomedicine. 7, 5577 (2012).
- Wu, Y., et al. Ultra-small particles of iron oxide as peroxidase for immunohistochemical detection. Nanotechnology. 22 (22), 225703 (2011).
- Xia, T., et al. Polyethyleneimine coating enhances the cellular uptake of mesoporous silica nanoparticles and allows safe delivery of siRNA and DNA constructs. ACS Nano. 3 (10), 3273-3286 (2009).
- Mocellin, S., Provenzano, M. RNA interference: learning gene knock-down from cell physiology. Journal of Translational Medicine. 2 (1), 39 (2004).
- Courties, G., et al. et al.In vivo RNAi-mediated silencing of TAK1 decreases inflammatory Th1 and Th17 cells through targeting of myeloid cells. Blood. 116 (18), 3505-3516 (2010).
- Zolnik, B. S., Gonzalez-Fernandez, A., Sadrieh, N., Dobrovolskaia, M. A. Minireview: nanoparticles and the immune system. Endocrinology. 151 (2), 458-465 (2010).
- Mulens-Arias, V., Rojas, J. M., Pérez-Yagüe, S., Morales, M. P., Barber, D. F. Polyethylenimine-coated SPIONs trigger macrophage activation through TLR-4 signaling and ROS production and modulate podosome dynamics. Biomaterials. 52, 494-506 (2015).
