חלקיקי תחמוצת ברזל מצופה Polyethyleneimine כרכב למסירה של RNA מפריעות קטן כדי מקרופאגים במבחנה , In Vivo
Summary
אנו מתארים שיטה של שימוש polyethyleneimine (פיי)-מצופה חלקיקי תחמוצת ברזל פאראמגנטי עבור מקרופאגים transfecting עם siRNA. חלקיקים אלה יכולים להעביר ביעילות siRNA מקרופאגים במבחנה , ויוו , שתיקה ביטוי גנים היעד.
Abstract
בגלל תפקידם קריטי בוויסות תגובות חיסוניות, מקרופאגים ברציפות כבר הנושא של מחקר אינטנסיבי ומייצגות מטרה טיפולית מבטיחה בהפרעות רבות, כגון מחלות אוטואימוניות, טרשת עורקים, סרטן. מציאה RNAi בתיווך ג’ין להחרשת היא גישה יקר של בחירה כדי לחקור ולטפל מקרופאג פונקציה; עם זאת, תרביות תאים של מקרופאגים עם siRNA נחשב לעתים קרובות להיות מאתגר מבחינה טכנית,, בזמן הנוכחי, כמה מתודולוגיות המוקדש את העברת siRNA מקרופאגים הינם זמינים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול של שימוש חלקיקי תחמוצת ברזל מצופה polyethyleneimine פאראמגנטי (פיי-SPIONs) כרכב למסירה יישוב של siRNA מקרופאגים. פיי-SPIONs מסוגלים של האיגוד לבין לחלוטין עיבוי siRNA כאשר היחס בין משקל Fe: siRNA מגיע 4 ומעלה. במבחנה, חלקיקים אלה יכול ביעילות לספק siRNA לתוך מקרופאגים הראשי, כמו גם לתוך הקו תא 264.7 גלם כמו macrophage, מבלי להתפשר על הכדאיות תא למינון האופטימלי עבור תרביות תאים, ו, בסופו של דבר, הם זירוז היעד בתיווך siRNA ג’ין להחרשת. מלבד בשימוש עבור במבחנה siRNA תרביות תאים, פיי-SPIONs הם גם כלי מבטיח להעברת siRNA מקרופאגים ויוו. לאור התכונות שלו משולב של המאפיין מגנטי ויכולת ג’ין להחרשת, חלקיקים פיי-SPION/siRNA מערכתית בניהול צפויים לא רק כדי לווסת את הפונקציה macrophage, אלא גם כדי לאפשר מקרופאגים עם תמונה ולהיות במעקב. בעיקרו של דבר, פיי-SPIONs מייצגים פלטפורמה nonviral פשוט, בטוח ויעיל למסירה siRNA המקרופאגים גם במבחנה וגם בתוך vivo.
Introduction
המקרופאגים הם סוג של תאים חיסוניים מולדת מופץ בכל רקמות הגוף, אם כי בכמויות שונות. על ידי ייצור מגוון רחב של ציטוקינים ומתווכים, הם ממלאים תפקידים חיוניים ההגנה מארח נגד הפולשים חיידקים פתוגנים, תיקון רקמות בעקבות פגיעה, בשמירה על הומאוסטזיס הרקמה1. בשל חשיבותם, מקרופאגים ברציפות כבר הנושא של מחקר אינטנסיבי. עם זאת, למרות השכיחות שלה הכונה ולימודים פונקציה, בתיווך siRNA ג’ין להחרשת סביר פחות להצליח מקרופאגים כי תאים אלה — במיוחד, מקרופאגים הראשי — הם לעתים קרובות קשה transfect. זה יכול להיות מיוחסות רמה גבוהה יחסית של רעילות הקשורים ביותר ומבוססת תקנים גישות שבו הוא קרום התא מבחינה כימית (למשל, עם פולימרים ושומנים) או פיזית (למשל, על ידי אלקטרופורציה ו ג’ין רובים) משובשות לתת מולקולות siRNA חוצה הממברנה, ובכך באופן דרסטי הפחתת של מקרופאגים הכדאיות2,3. יתר על כן, המקרופאגים הם עשירים degradative אנזימים ייעודי phagocytes. אנזימים אלה יכול להזיק לתקינות של siRNA, היחלשות ביעילותה שתיקה גם אם גנים ספציפיים siRNA נמסרה לתוך התא3,4. לכן, מערכת משלוח siRNA ממוקדות מקרופאג יעיל צריך להגן את תקינות והיציבות של siRNA במהלך משלוח4.
זה ברור יותר ויותר כי מקרופאגים לקוי הם מעורבים החניכה, התקדמות של הפרעות מסוימות קליניים נפוצים כמו מחלות אוטואימוניות, טרשת עורקים, סרטן. מסיבה זו, להתכוונן מקרופאג פונקציה עם, למשל, siRNA, יש כבר מתעוררים כמו מתודולוגיה אטרקטיבי לטיפול אלה הפרעות5,6,7. למרות התקדמות רבה נעשתה, האתגר העיקרי של הטיפול מבוססת siRNA האסטרטגיה היא יחודיות תא המסכן של siRNA מערכתית בניהול, תפיסה siRNA לא מספיקות על ידי מקרופאגים, אשר כתוצאה מכך להוביל לתופעות לוואי לא רצויות. לעומת הרפוי חומצת גרעין חינם בדרך כלל חוסר תא אופטימלית סלקטיביות, לעיתים קרובות להוביל תופעות לוואי, טעון-סמים חלקיקים (NPs), בשל שלהם נטיה ספונטנית של בשבי על ידי מערכת reticuloendothelial, את המטרה . ניתן לתכנן עבור מיקוד פסיבי מקרופאגים ויוו, המאפשר שיפור יעילות טיפולית עם תופעות לוואי מינימליות8 NPs הנוכחי חקר למסירה של מולקולות RNA כוללים nanocarriers אורגניים, ליפוזומים שונים פולימרים9. ביניהם, polyethyleneimine (פיי), סוג של יכולת של איגוד וכן עיבוי חומצות גרעין לתוך NPs מיוצב, cationic פולימרים מציג את הרנ א הגבוהה אספקת קיבולת9,10. פיי מגן חומצות גרעין השפלה אנזימטיות, nonenzymatic, ומתווך העברה שלהם על פני קרום התא, ומקדם שחרורם תאיים. אמנם בתחילה הציג ריאגנט משלוח ה-DNA, פיי הודגם לאחר מכן להיות פלטפורמה מושכת ויוו siRNA משלוח, או באופן מקומי או מערכתית9,10.
חלקיקי תחמוצת ברזל פאראמגנטי (SPIONs) הראו הבטחה גדולה וההתערבות, בשל שלהם תכונות מגנטיות, כימי, גודל דומה אובייקטים חשובים מבחינה ביולוגית, יחס פני-שטח-כדי-נפח גבוה, וניתנת להתאמה בקלות השטח עבור הקובץ המצורף גורם המחלה. אלים11. למשל, בשל פוטנציאל ניגוד הסוכן, ספיגה מהירה על ידי מקרופאגים, SPIONs הופיעו ככלי קליני האהוב תמונה רקמה מקרופאגים12. בעוד SPIONs גם נחקרו בהרחבה חומצת גרעין משלוח רכב11,13,14,15, לידע שלנו, הספרות מכיל כמה דיווחים SPIONs כנשא של משלוח, ממוקדות מקרופאג siRNA. למסירה גן מאת SPIONs, פני השטח שלהם בדרך כלל מצופה בשכבה של פולימרים cationic הידרופילית שעליו חומצות גרעין טעונים שלילית יכול להיות electrostatically נמשכת ולא קשורה. כאן, אנו מציגים את שיטת סינתזה SPIONs של מי פני השטח משתנה עם נמוך משקל מולקולרי (10 kDa), מסועף פיי (פיי-SPIONs). אלה nanoplatforms מגנטי מועסקים ואז לתמצת siRNA, הקמת מתחמי פיי-SPION/siRNA המאפשרים תחבורה siRNA לתוך התא. אנחנו הסיבה הזאת phagocytosis ספונטנית של SPIONs על ידי תאים המערכת reticuloendothelial16, בשילוב עם יכולת חזקה של האיגוד, עיבוי חומצות גרעין על ידי פיי, למתאימה פיי-SPIONs תעבורה יעילה של siRNA לתוך מקרופאגים. הנתונים המוצגים כאן לתמוך את הכדאיות של פיי-SPION/siRNA-מתווכת ג’ין להחרשת ב מקרופאגים תרבות וכן ויוו.
Protocol
Representative Results
Discussion
המקרופאגים הם דברים מעוותים transfect על ידי גישות nonviral בשימוש נפוץ, כגון אלקטרופורציה, ליפוזומים cationic השומנים מינים. כאן אנחנו תיאר שיטה אמינה ויעילה כדי transfect מקרופאגים עם siRNA. משתמש בפרוטוקול הנוכחי, מעל 90% של תאים 264.7 גלם כמו מקרופאג (איור 2B) ו מקרופאגים הצפק החולדה18…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי נבחרת מדעי הטבע קרן של סין (81772308) ואת המחקר הלאומי מפתח תוכנית הפיתוח של סין (מספר 2017YFA0205502).
Materials
| DMEM | Gibco | C11995500BT | Warm in 37°C water bath before use |
| Fetal bovine serum | Gibco | A31608-02 | |
| Penicillin/streptomycin (1.5 ml) | Gibco | 15140122 | |
| Tetrazolium-based MTS assay kit | Promega | G3582 | For cytotoxicity analysis |
| RAW 264.7 cell line | Cell Bank of Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China | TCM13 | |
| Tissue culture plates (6-well) | Corning | 3516 | |
| Tissue culture dishes (10 cm) | Corning | 430167 | |
| RNase-free tubes (1.5 ml) | AXYGEN | MCT-150-C | |
| Centrifuge tubes (15 ml) | Corning | 430791 | |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | |
| Wistar rats | Shanghai Experimental Animal Center of Chinese Academy of Sciences |
||
| Bacillus Calmette–Guérin freeze-dried powder | National Institutes for Food and Drug Control, China |
for inducing adjuvant arthritis in rats | |
| siRNA | GenePharma (Shanghai, China) | ||
| Cy3-siRNA | RiboBio (Guangzhou, China) | ||
| Polyethyleneimine (10 kDa) | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | E107079 | |
| Ammonia water | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | A112077 | |
| Oleic acid | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | O108484 | |
| Dimethylsulfoxide | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | D103272 | |
| FeSO4•7H2O | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10012118 | |
| FeCl3•6H2O | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10011918 | |
| Dimercaptosuccinic acid | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | D107254 | |
| ultrafiltration tube | Millipore | UFC910096 | |
| Tetramethylammonium hydroxide solution | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | T100882 | |
| Particle size and zeta potential analyzer | Malvern, England | Nano ZS90 |
References
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723 (2011).
- Maeß, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. Journal of Visualized Experiments. (91), e51960 (2014).
- Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The Expression of Exogenous Genes in Macrophages: Obstacles and Opportunities. Macrophages and Dendritic Cells. , 123-143 (2009).
- Zhang, M., Gao, Y., Caja, K., Zhao, B., Kim, J. A. Non-viral nanoparticle delivers small interfering RNA to macrophages in vitro and in vivo. PLoS ONE. 10 (3), e0118472 (2015).
- Davignon, J. -. L., et al. Targeting monocytes/macrophages in the treatment of rheumatoid arthritis. Rheumatology. 52 (4), 590-598 (2012).
- Brown, J. M., Recht, L., Strober, S. The promise of targeting macrophages in cancer therapy. Clinical Cancer Research. 23 (13), 3241-3250 (2017).
- Karunakaran, D., et al. Targeting macrophage necroptosis for therapeutic and diagnostic interventions in atherosclerosis. Science Advances. 2 (7), e1600224 (2016).
- Prosperi, D., Colombo, M., Zanoni, I., Granucci, F. Drug nanocarriers to treat autoimmunity and chronis inflammatory diseases. Seminars in Immunology. 34, 61-67 (2017).
- Höbel, S., Aigner, A. Polyethylenimines for siRNA and miRNA delivery in vivo. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 5 (5), 484-501 (2013).
- Whitehead, K. A., Langer, R., Anderson, D. G. Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 8 (2), 129 (2009).
- Liu, G., et al. N-Alkyl-PEI-functionalized iron oxide nanoclusters for efficient siRNA delivery. Small. 7 (19), 2742-2749 (2011).
- Weissleder, R., Nahrendorf, M., Pittet, M. J. Imaging macrophages with nanoparticles. Nature Materials. 13 (2), 125 (2014).
- Magro, M., et al. Covalently bound DNA on naked iron oxide nanoparticles: Intelligent colloidal nano-vector for cell transfection. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects. 1861 (11), 2802-2810 (2017).
- Abdelrahman, M., et al. siRNA delivery system based on magnetic nanovectors: Characterization and stability evaluation. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 106, 287-293 (2017).
- Zhang, H., Lee, M. -. Y., Hogg, M. G., Dordick, J. S., Sharfstein, S. T. Gene delivery in three-dimensional cell cultures by superparamagnetic nanoparticles. ACS Nano. 4 (8), 4733-4743 (2010).
- Moghimi, S. M., Hunter, A. C., Murray, J. C. Long-circulating and target-specific nanoparticles: theory to practice. Pharmacological Reviews. 53 (2), 283-318 (2001).
- Harvey, A. E., Smart, J. A., Amis, E. Simultaneous spectrophotometric determination of iron (II) and total iron with 1, 10-phenanthroline. Analytical Chemistry. 27 (1), 26-29 (1955).
- Duan, J., et al. Polyethyleneimine-functionalized iron oxide nanoparticles for systemic siRNA delivery in experimental arthritis. Nanomedicine. 9 (6), 789-801 (2014).
- Fröhlich, E. The role of surface charge in cellular uptake and cytotoxicity of medical nanoparticles. International Journal of Nanomedicine. 7, 5577 (2012).
- Wu, Y., et al. Ultra-small particles of iron oxide as peroxidase for immunohistochemical detection. Nanotechnology. 22 (22), 225703 (2011).
- Xia, T., et al. Polyethyleneimine coating enhances the cellular uptake of mesoporous silica nanoparticles and allows safe delivery of siRNA and DNA constructs. ACS Nano. 3 (10), 3273-3286 (2009).
- Mocellin, S., Provenzano, M. RNA interference: learning gene knock-down from cell physiology. Journal of Translational Medicine. 2 (1), 39 (2004).
- Courties, G., et al. et al.In vivo RNAi-mediated silencing of TAK1 decreases inflammatory Th1 and Th17 cells through targeting of myeloid cells. Blood. 116 (18), 3505-3516 (2010).
- Zolnik, B. S., Gonzalez-Fernandez, A., Sadrieh, N., Dobrovolskaia, M. A. Minireview: nanoparticles and the immune system. Endocrinology. 151 (2), 458-465 (2010).
- Mulens-Arias, V., Rojas, J. M., Pérez-Yagüe, S., Morales, M. P., Barber, D. F. Polyethylenimine-coated SPIONs trigger macrophage activation through TLR-4 signaling and ROS production and modulate podosome dynamics. Biomaterials. 52, 494-506 (2015).
