Наночастицы полиэтиленимина покрытием оксида железа как средство для доставки малые интерферирующие РНК макрофаги In Vitro и In Vivo
Summary
Мы описываем метод использования полиэтиленимина (PEI)-покрытием суперпарамагнетическим оксида железа наночастицы для transfecting макрофагов с siRNA. Эти наночастицы могут эффективно поставлять малых интерферирующих РНК к макрофагов в пробирке и в естественных условиях и молчание экспрессии генов цели.
Abstract
Из-за их решающую роль в регулировании иммунной реакции Макрофаги непрерывно были предметом интенсивных исследований и представляют собой многообещающие терапевтические целевой многих расстройств, таких как аутоиммунных заболеваний, атеросклероза и рак. Сайленсинга генов, опосредованного системой РНК-интерференции является ценным подход выбора зонд и манипулировать функции макрофагов; Однако transfection макрофагов с siRNA часто считается чтобы быть технически сложным, и в настоящее время, доступны несколько методик, посвященный siRNA передачи макрофагов. Здесь мы представляем протокол использования наночастиц полиэтиленимина покрытием суперпарамагнетическим оксида железа (пей-SPIONs) в качестве транспортного средства для доставки целевых интерферирующей РНК макрофагов. Пей-SPIONs способны привязки и полностью конденсации siRNA, когда массовая доля Fe: siRNA достигает 4 и выше. В пробирке, эти наночастицы могут эффективно поставлять малых интерферирующих РНК в первичных макрофагов, а также в Макрофаг как RAW 264.7 клеток линии, без ущерба для жизнеспособности клеток при оптимальной дозе для transfection, и, в конечном счете, они вызывают малых интерферирующих РНК опосредованной целевой сайленсинга генов. Помимо используется для в vitro трансфекции siRNA, пей-SPIONs также являются перспективным инструментом для доставки siRNA макрофагов в естественных условиях. С учетом его комбинированных особенностей магнитные свойства и способность заставлять замолчать гена системно управляемых Пей-SPION/siRNA частицы, как ожидается, не только чтобы модулировать функции макрофагов, но и для включения макрофаги образы и отслеживаются. По сути, пей-SPIONs представляют собой простой, безопасный и эффективный синцитиального платформу для доставки siRNA макрофагов в пробирке и в естественных условиях.
Introduction
Макрофаги являются тип innate иммунных клеток, распространен во всех тканях организма, хотя и в разных количествах. Производя различные цитокины и других посредников, они играют важнейшую роль в принимающей обороны против вторжения патогенных микроорганизмов, в ткани ремонт после травмы и в поддержании гомеостаза ткани1. Из-за их важности макрофаги непрерывно были предметом интенсивных исследований. Однако, несмотря на его распространенности в ген регулирования и исследования функции, малых интерферирующих РНК опосредованной генов меньше шансов на успех в макрофагах, потому что эти клетки — в частности, первичного макрофаги — зачастую трудно transfect. Это можно объяснить сравнительно высокой степени токсичности связанные с наиболее устоявшихся трансфекции подходов, в которых клеточной мембраны является химически (например, полимеров и липидами) или физически (например, путем электропорации и Джин пушек) нарушается позволить siRNA молекул через мембрану, тем самым значительно снижая макрофаги жизнеспособности2,3. Кроме того макрофаги, посвященный фагоцитов богаты деструктивные ферментов. Эти ферменты могут нарушить целостность siRNA, ослабляет эффективность глушителя, даже если ген специфического siRNA был доставлен в ячейке3,4. Таким образом эффективный siRNA Макрофаг целевой системы доставки необходимо защищать целостность и стабильность малых интерферирующих РНК во время доставки4.
Становится все более очевидным, что неблагополучных макрофаги замешаны в инициации и прогрессирования некоторых общих клинических расстройств как аутоиммунных заболеваний, атеросклероза и рак. По этой причине, модулирует функции макрофагов с, например, siRNA формируется как привлекательный методологию для лечения этих расстройств по5,6,7. Хотя был достигнут значительный прогресс, главной задачей стратегии на основе малых интерферирующих РНК лечения является бедным ячейки специфика системно управляемых siRNA и недостаточно siRNA поглощение макрофагами, которые соответственно приводят к нежелательным побочным эффектам. По сравнению с свободной нуклеиновые кислоты терапевтов, которые обычно не имеют оптимальное ячейки избирательности и часто приводят к негативным последствиям, загруженных наркотиков наночастиц (NPs), ввиду их спонтанной склонность быть захвачен ретикулоэндотелиальной системы,-цели могут быть спроектированы для пассивной ориентации макрофагов в естественных условиях, позволяя для улучшения терапевтической эффективности с минимальными побочными эффектами8. Текущий NPs, изучены для доставки молекул РНК включают неорганических nanocarriers, различные липосомы и полимеров9. Среди них полиэтиленимина (PEI), тип катионных полимеров, способных привязки и конденсации нуклеиновых кислот в стабилизированное NPs, показывает высокий РНК, обеспечивая потенциал9,10. PEI защищает нуклеиновые кислоты от ферментативного и nonenzymatic деградации, является посредником при их передаче через клеточную мембрану и способствует их внутриклеточного релиз. Хотя первоначально введено как реагент доставки ДНК, пей впоследствии был продемонстрирован быть привлекательной платформой для в естественных условиях доставки siRNA, либо локально или системно9,10.
Наночастицы суперпарамагнетическим оксида железа (SPIONs) показали большие перспективы в биомедицине, вследствие их магнитные свойства, биосовместимость, сопоставимого размера биологически важных объектов, высокий коэффициент площадь поверхности и объем и легко адаптируется поверхностью для bioagent крепления11. Например из-за их потенциальной полезности в качестве контрастного вещества и быстрое поглощение макрофагами, SPIONs появились как любимый клинический инструмент для изображения ткани макрофагами12. В то время как SPIONs также были широко изучены как нуклеиновые кислоты доставки транспортных средств11,13,14,15, к нашему знанию, литература содержит несколько сообщений о SPIONs как носитель для Макрофаг целевой siRNA доставки. Для доставки генов, SPIONs их поверхность обычно покрыты слоем гидрофильные катионных полимеров, на которые отрицательно заряженных нуклеиновые кислоты может быть электростатически привлекают и привязал. Здесь мы представляем метод синтеза SPIONs, поверхность которых изменяется с низким молекулярным весом (10 кДа), разветвленные Пей (пей-SPIONs). Затем эти магнитные nanoplatforms заняты уплотнить siRNA, образуя комплексы Пей-SPION/siRNA, позволяющие транспорта малых интерферирующих РНК в клетку. Мы причина что спонтанное фагоцитоза SPIONs клеток ретикулоэндотелиальной системы16, в сочетании с сильной способности привязки и конденсации нуклеиновых кислот, пей, оказывает Пей-SPIONs подходит для эффективной перевозки малых интерферирующих РНК в макрофаги. Представленные здесь данные поддерживают возможности подавления экспрессии гена Пей-SPION/малых интерферирующих РНК опосредованной в макрофагах в культуре, а также в естественных условиях.
Protocol
Representative Results
Discussion
Макрофаги являются тугоплавкие transfect часто используемые синцитиального подходы, например, электропорация, Катионный липосомы и липидов видов. Здесь мы описали надежный и эффективный метод для transfect макрофагов с siRNA. Используя настоящий Протокол, свыше 90% Макрофаг как RAW 264.7 клеток (<strong cl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Фонд национального естественных наук Китая (81772308) и Национальный исследовательский ключ и Программа развития Китая (№ 2017YFA0205502).
Materials
| DMEM | Gibco | C11995500BT | Warm in 37°C water bath before use |
| Fetal bovine serum | Gibco | A31608-02 | |
| Penicillin/streptomycin (1.5 ml) | Gibco | 15140122 | |
| Tetrazolium-based MTS assay kit | Promega | G3582 | For cytotoxicity analysis |
| RAW 264.7 cell line | Cell Bank of Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China | TCM13 | |
| Tissue culture plates (6-well) | Corning | 3516 | |
| Tissue culture dishes (10 cm) | Corning | 430167 | |
| RNase-free tubes (1.5 ml) | AXYGEN | MCT-150-C | |
| Centrifuge tubes (15 ml) | Corning | 430791 | |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | |
| Wistar rats | Shanghai Experimental Animal Center of Chinese Academy of Sciences |
||
| Bacillus Calmette–Guérin freeze-dried powder | National Institutes for Food and Drug Control, China |
for inducing adjuvant arthritis in rats | |
| siRNA | GenePharma (Shanghai, China) | ||
| Cy3-siRNA | RiboBio (Guangzhou, China) | ||
| Polyethyleneimine (10 kDa) | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | E107079 | |
| Ammonia water | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | A112077 | |
| Oleic acid | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | O108484 | |
| Dimethylsulfoxide | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | D103272 | |
| FeSO4•7H2O | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10012118 | |
| FeCl3•6H2O | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10011918 | |
| Dimercaptosuccinic acid | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | D107254 | |
| ultrafiltration tube | Millipore | UFC910096 | |
| Tetramethylammonium hydroxide solution | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | T100882 | |
| Particle size and zeta potential analyzer | Malvern, England | Nano ZS90 |
References
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723 (2011).
- Maeß, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. Journal of Visualized Experiments. (91), e51960 (2014).
- Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The Expression of Exogenous Genes in Macrophages: Obstacles and Opportunities. Macrophages and Dendritic Cells. , 123-143 (2009).
- Zhang, M., Gao, Y., Caja, K., Zhao, B., Kim, J. A. Non-viral nanoparticle delivers small interfering RNA to macrophages in vitro and in vivo. PLoS ONE. 10 (3), e0118472 (2015).
- Davignon, J. -. L., et al. Targeting monocytes/macrophages in the treatment of rheumatoid arthritis. Rheumatology. 52 (4), 590-598 (2012).
- Brown, J. M., Recht, L., Strober, S. The promise of targeting macrophages in cancer therapy. Clinical Cancer Research. 23 (13), 3241-3250 (2017).
- Karunakaran, D., et al. Targeting macrophage necroptosis for therapeutic and diagnostic interventions in atherosclerosis. Science Advances. 2 (7), e1600224 (2016).
- Prosperi, D., Colombo, M., Zanoni, I., Granucci, F. Drug nanocarriers to treat autoimmunity and chronis inflammatory diseases. Seminars in Immunology. 34, 61-67 (2017).
- Höbel, S., Aigner, A. Polyethylenimines for siRNA and miRNA delivery in vivo. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 5 (5), 484-501 (2013).
- Whitehead, K. A., Langer, R., Anderson, D. G. Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 8 (2), 129 (2009).
- Liu, G., et al. N-Alkyl-PEI-functionalized iron oxide nanoclusters for efficient siRNA delivery. Small. 7 (19), 2742-2749 (2011).
- Weissleder, R., Nahrendorf, M., Pittet, M. J. Imaging macrophages with nanoparticles. Nature Materials. 13 (2), 125 (2014).
- Magro, M., et al. Covalently bound DNA on naked iron oxide nanoparticles: Intelligent colloidal nano-vector for cell transfection. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects. 1861 (11), 2802-2810 (2017).
- Abdelrahman, M., et al. siRNA delivery system based on magnetic nanovectors: Characterization and stability evaluation. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 106, 287-293 (2017).
- Zhang, H., Lee, M. -. Y., Hogg, M. G., Dordick, J. S., Sharfstein, S. T. Gene delivery in three-dimensional cell cultures by superparamagnetic nanoparticles. ACS Nano. 4 (8), 4733-4743 (2010).
- Moghimi, S. M., Hunter, A. C., Murray, J. C. Long-circulating and target-specific nanoparticles: theory to practice. Pharmacological Reviews. 53 (2), 283-318 (2001).
- Harvey, A. E., Smart, J. A., Amis, E. Simultaneous spectrophotometric determination of iron (II) and total iron with 1, 10-phenanthroline. Analytical Chemistry. 27 (1), 26-29 (1955).
- Duan, J., et al. Polyethyleneimine-functionalized iron oxide nanoparticles for systemic siRNA delivery in experimental arthritis. Nanomedicine. 9 (6), 789-801 (2014).
- Fröhlich, E. The role of surface charge in cellular uptake and cytotoxicity of medical nanoparticles. International Journal of Nanomedicine. 7, 5577 (2012).
- Wu, Y., et al. Ultra-small particles of iron oxide as peroxidase for immunohistochemical detection. Nanotechnology. 22 (22), 225703 (2011).
- Xia, T., et al. Polyethyleneimine coating enhances the cellular uptake of mesoporous silica nanoparticles and allows safe delivery of siRNA and DNA constructs. ACS Nano. 3 (10), 3273-3286 (2009).
- Mocellin, S., Provenzano, M. RNA interference: learning gene knock-down from cell physiology. Journal of Translational Medicine. 2 (1), 39 (2004).
- Courties, G., et al. et al.In vivo RNAi-mediated silencing of TAK1 decreases inflammatory Th1 and Th17 cells through targeting of myeloid cells. Blood. 116 (18), 3505-3516 (2010).
- Zolnik, B. S., Gonzalez-Fernandez, A., Sadrieh, N., Dobrovolskaia, M. A. Minireview: nanoparticles and the immune system. Endocrinology. 151 (2), 458-465 (2010).
- Mulens-Arias, V., Rojas, J. M., Pérez-Yagüe, S., Morales, M. P., Barber, D. F. Polyethylenimine-coated SPIONs trigger macrophage activation through TLR-4 signaling and ROS production and modulate podosome dynamics. Biomaterials. 52, 494-506 (2015).
