小さい干渉の RNA のマクロファージへの配信のための車両としてポリエチレンイミン被覆された酸化鉄ナノ粒子の in VitroとIn Vivo
Summary
ポリエチレンイミン (PEI) を使用しての方法を述べる-siRNA 株マクロファージの超常磁性酸化鉄ナノ粒子をコーティングします。これらのナノ粒子は効率的に大食細胞の体外および体内と沈黙のターゲット遺伝子の発現を siRNA を提供できます。
Abstract
免疫応答の調節に重要な役割のためマクロファージは集中的な研究の対象とされている継続的に、自己免疫疾患、動脈硬化、癌などの多くの疾患で有望な治療上のターゲットを表します。プローブおよびマクロファージ機能を操作する任意の貴重なアプローチは、RNAi による遺伝子サイレンシングただし、マクロファージ siRNA トランスフェクションが頻繁に技術的に挑戦すると考慮し、現時点では、マクロファージに siRNA に専念ほとんど方法論 。ここでは、大食細胞への siRNA のターゲット配信の手段としてポリエチレンイミン被覆された超常磁性酸化鉄ナノ粒子 (PEI SPIONs) を使用してのプロトコルを提案する.プリンスエド ワード島 SPIONs は、バインドおよび Fe: siRNA の重量比が 4 になったら完全に siRNA を凝縮、上記が可能です。生体外で、これらのナノ粒子が効率的に提供 siRNA プライマリ マクロファージとマクロファージのような未加工 264.7 のセル行の transfection のため最適な用量での妥協のセル実行可能性なしに、最終的には、彼らを誘導します。siRNA を介したターゲット遺伝子の沈黙。体外siRNA トランスフェクションに使用されている、離れて PEI SPIONs、また体内のマクロファージに siRNA を配信する有望なツールです。その磁気特性と遺伝子サイレンシングの能力の機能の組み合わせの観点から全身投与のペイ-スパイ/siRNA 粒子は、マクロファージの機能を調節するのみならず、マクロファージをイメージして追跡を有効にするを期待されています。PEI SPIONs が大食細胞への siRNA 配信簡単、安全、かつ効果的 nonviral プラットフォームを表します本質的の in vitroとin vivoの両方。
Introduction
マクロファージは、さまざまな量とはいえ体のすべての組織に分布する自然免疫系細胞の種類です。様々 なサイトカインや他のメディエーターを生産することによって、彼らは、微生物病原体の侵入に対する生体防御、損傷組織の修復、1組織の恒常性を維持するために重要な役割を果たします。その重要性のためマクロファージ継続的に集中的な研究の対象とされています。しかし、にもかかわらずその、遺伝子機能研究の有病率、siRNA による遺伝子サイレンシングはためマクロファージでは成功しにくいこれらの細胞、特に、プライマリ マクロファージ-transfect に困難が多い。これは毒性細胞膜は化学的に最もよく確立されたトランスフェクション アプローチに関連付けられている時 (例えばポリマーと脂質) の比較的高度に起因することができますまたは物理的に (例えば、電気穿孔法によると遺伝子銃) 中断 siRNA 分子マクロファージの生存率2,3を大幅に削減、膜を通過させる。さらに、マクロファージが専用食細胞分解酵素が豊富です。これらの酵素は、siRNA、特定遺伝子の siRNA は、細胞3,4に配信されている場合でも、その沈黙の効率を弱体化の整合性を損なうことができます。したがって、効果的なマクロファージ標的 siRNA 送達は配信4整合性および siRNA の安定性を保護する必要があります。
ますます機能不全マクロファージが開始し、自己免疫疾患、動脈硬化、癌などの特定の一般的な臨床疾患の進行に関与していることは明らかです。このためと、例えば、siRNA、マクロファージの機能を調節することは、これら疾患5,6,7を治療するための魅力的な方法論として発展しています。多くの進歩を遂げて、siRNA を用いた治療戦略の主要な挑戦は全身投与の siRNA とマクロファージは、望ましくない副作用につながる不十分な siRNA 吸収の悪い細胞の特異性。最適な細胞選択性に乏しいし、頻繁にオフ対象薬物ロードのナノ粒子 (NPs)、細網内皮系によってキャプチャされるの彼らの自発的な傾向により、副作用につながる無料核酸治療薬と比較してください。大食細胞は生体内で、最小限の副作用8と治療効果の向上を可能にする、受動的ターゲティングを設計することができます。無機ナノキャリア、様々 なリポソームや高分子9現在 NPs RNA 分子の配信のために探検が含まれます。その中でも、ポリエチレンイミン (PEI)、カチオン性高分子結合し、安定した NPs に核酸を凝縮できるのタイプは容量9,10を提供する最高の RNA を示しています。PEI は、核酸の酵素的及び非酵素的分解を防ぐ、セル膜を渡る彼らの転送を仲介する、自分の細胞内放出を促進します。当初 DNA 配信試薬として導入されたが、プリンスエド ワード島その後体内siRNA 配信、いずれかのローカルまたは全身9,10の魅力的なプラットフォームとなることを示した。
超常磁性酸化鉄ナノ粒子 (SPIONs) は、生物医学、その磁気特性、生体適合性、生物学的に重要なオブジェクト、高表面面積、体積比に匹敵するサイズのために偉大な約束を示していると容易に適応病原体の添付ファイル11面。例えば、造影剤とマクロファージによる急速な吸収としてその潜在的なユーティリティのため SPIONs は、イメージ組織マクロファージ12好きな臨床ツールとして浮上しています。文献にはためのキャリアとして SPIONs のいくつかのレポートが含まれています SPIONs は核酸配信車11,13,14,15、我々 の知識としては広く研究もされている中マクロファージ標的 siRNA 送達。SPIONs による遺伝子デリバリーの彼らの表面は親水性カチオン性ポリマー、負荷電の核酸静電魅了できテザーの層でコーティング通常。その表面が低分子量 (10 kDa) 分岐プリンスエド ワード島 (PEI SPIONs) と変更された SPIONs を合成する方法を紹介します。これらの磁気 nanoplatforms の採用 siRNA は、細胞への siRNA トランスポートを有効にするプリンスエド ワード島-スパイ-sirna 複合を形成を凝縮していますし。我々 は、細網内皮のシステム16の細胞によって SPIONs の自発的な貪食能を理由バインディングの強力な能力と相まって、PEI SPIONs に siRNA の効率的な輸送に適したレンダリングしますペイによる核酸を凝縮マクロファージ。ここで表示されるデータは、PEI スパイ/siRNA による遺伝子サイレンシング文化だけでなく、体内のマクロファージの可能性をサポートします。
Protocol
Representative Results
Discussion
マクロファージは、エレクトロポレーション、カチオン性リポソーム、脂質種などの一般的に使用される nonviral アプローチを使って耐火物。ここでマクロファージ siRNA を使って信頼性と効率的な方法について説明しました。現在のプロトコルを使用して、以上マクロファージのような未加工 264.7 のセル (図 2 b) とラット腹腔マクロファージ18の 90% こ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、中国の国家自然科学基金 (81772308) とキー研究開発中国プログラム (第 2017YFA0205502) によって支えられました。
Materials
| DMEM | Gibco | C11995500BT | Warm in 37°C water bath before use |
| Fetal bovine serum | Gibco | A31608-02 | |
| Penicillin/streptomycin (1.5 ml) | Gibco | 15140122 | |
| Tetrazolium-based MTS assay kit | Promega | G3582 | For cytotoxicity analysis |
| RAW 264.7 cell line | Cell Bank of Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China | TCM13 | |
| Tissue culture plates (6-well) | Corning | 3516 | |
| Tissue culture dishes (10 cm) | Corning | 430167 | |
| RNase-free tubes (1.5 ml) | AXYGEN | MCT-150-C | |
| Centrifuge tubes (15 ml) | Corning | 430791 | |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | |
| Wistar rats | Shanghai Experimental Animal Center of Chinese Academy of Sciences |
||
| Bacillus Calmette–Guérin freeze-dried powder | National Institutes for Food and Drug Control, China |
for inducing adjuvant arthritis in rats | |
| siRNA | GenePharma (Shanghai, China) | ||
| Cy3-siRNA | RiboBio (Guangzhou, China) | ||
| Polyethyleneimine (10 kDa) | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | E107079 | |
| Ammonia water | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | A112077 | |
| Oleic acid | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | O108484 | |
| Dimethylsulfoxide | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | D103272 | |
| FeSO4•7H2O | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10012118 | |
| FeCl3•6H2O | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10011918 | |
| Dimercaptosuccinic acid | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | D107254 | |
| ultrafiltration tube | Millipore | UFC910096 | |
| Tetramethylammonium hydroxide solution | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | T100882 | |
| Particle size and zeta potential analyzer | Malvern, England | Nano ZS90 |
References
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