微链 rna 的共聚焦成像和模式识别受体在负感 rna 病毒感染中的应用
Summary
在 rna 病毒复制过程中产生的双链 rna 可以通过模式识别受体来识别, 从而诱导先天免疫反应。对于负感 rna 病毒, 低水平 dsrna 和 prr 之间的相互作用仍不清楚。我们开发了一种共聚焦显微镜方法, 用于在单个细胞中显示腺病毒 dsrna 和 prr。
Abstract
双链 rna 是在 rna 病毒感染过程中作为复制中间体产生的。通过宿主模式识别受体 (prr) (如维甲酸 (MDA-5) 样受体 (rlr) 和黑色素瘤差异相关蛋白 5 (mda-5)) 识别 dsrna, 从而诱导先天免疫反应。在正感 rna 病毒感染中, dsrna 的形成和细胞内分布已通过显微镜观察。许多负面的 rna 病毒, 包括一些芳烃病毒, 在感染过程中触发先天免疫反应。然而, 负感 rna 病毒被认为产生低水平的 dsrna, 这阻碍了对病毒 dsrna 的 prr 识别的成像研究。此外, 高致病性芳烃的感染实验必须在高遏制生物安全设施 (bsl-4) 中进行。病毒 rna 和高致病性 rna 病毒的 prr 之间的相互作用在很大程度上是未知的, 因为研究人员需要在 bsl-4 设施中面临额外的技术挑战。最近, 一种最初用于泛肠病毒检测的单克隆抗体 (mab) (克隆 9d5) 被发现能够以比传统的 j2 或 k1 抗 dsrna 抗体更高的灵敏度专门检测 dsrna。在此, 通过使用9d5 抗体, 我们描述了一种共聚焦显微镜协议, 该协议已成功地用于在感染芳烃病毒的单个细胞中同时显示 dsrna、病毒蛋白和 prr。该方案也适用于 bsl4 设施中致病性腺病毒感染细胞的 dsrna 和 prr 分布的成像研究。
Introduction
诱导先天免疫反应的第一步是通过模式识别受体 (prr) (如维甲酸 (rigi) 样受体 (rlr) r-i 和黑色素瘤差异相关的双链 rna 的宿主识别蛋白 5 (mda-5)1。对于正感 rna 病毒, 通常可以使用 j2 或 k1 抗 dsrna 单克隆抗体 (mab)2很容易检测到 dsrna。利用共聚焦显微镜3对阳性链 rna 病毒 (如 picornas-病毒) 中 dsrna 和 prr 之间的相互作用进行了表征。然而, 对于负感 rna 病毒, prr 和 dsrna 相互作用的可视化和表征由于缺乏对 dsrna 的敏感抗体而受到阻碍。rna 荧光原位杂交 (fish) 已被应用于病毒 rna 和 prrs4 的可视化。然而, fish 方法要求了解目标 rna 序列, 并且可能与 prr 共染色不兼容。最近, 9d5 mab, 最初是为诊断泛肠病毒感染而开发的, 被发现比 j2 mab 更敏感, 并且可以很容易地检测到 dsrna 在负感 rna 病毒感染5,6。因此, mab 9d5 是研究负感 rna 病毒的病毒复制以及 prr 与病毒 rna 相互作用的一种新的有用工具。
竞技场病毒是单链、负感 rna 病毒的家族, 包括几种人类病原体, 如拉萨病毒 (lasv)、junín 病毒 (junv) 和 machupo 病毒 (macv), 这些病毒在人类中引起严重的出血热疾病7。新世界腺病毒引起的阿根廷严重和致命出血热病例的临床数据显示出异常高的血清 ifn-α08,9。我们已经证明, 致病性的 nw 芳烃 (junv 和 macv), 而不是致病性的旧大陆腺病毒, lasv, 诱导 i 型干扰素 (ifn) 反应在人类单核细胞衍生树突状细胞10。此外, rigi 是在 junv 感染细胞11中介导 i 型 ifn 响应的传感器之一。我们还发现, 蛋白激酶 r (pkr) 受体, 这是传统上已知的 dsrna 识别, 被激活的致病性 nw 腺病毒感染12。为了进一步了解腺病毒感染过程中病毒特异性 ifn 反应的机制, 我们的目标是开发一个协议, 以可视化病毒 dsrna 与细胞质 prr 之间的相互作用。
对致病性 junv、macv 和 lasv 的感染实验必须在生物安全第4级 (bsl-4) 设施中进行。因此, 除了在芳烃病毒感染中形成的 dsrna 水平可能较低之外, 在对这些高致病性病毒进行成像研究时, 满足生物安全要求是另一个技术挑战。本报告利用 junv 的9d5 抗体和 candid1# 疫苗株, 描述了一种基于共聚焦显微镜的协议, 该协议已成功地用于在感染芳烃病毒的细胞中同时显示 dsrna、病毒蛋白和 prr。bsl2 实验室。该方案也适用于 bsl4 设施致病性腺病毒感染过程中 dsrna 和 prr 的细胞内分布的可视化。
Protocol
Representative Results
Discussion
对于正感 rna 病毒和 dsdna 病毒, dsrna 很容易被广泛使用的 j2 抗 dsrna 抗体检测。然而, 负感 rna 病毒被认为在低或低于检测水平产生 dsrna 使用相同的抗体2。因此, 病毒 rna 和 prr 相互作用的许多方面在很大程度上是不清楚的负感 rna 病毒。我们试图使用 j2 抗体染色牙病毒感染中的 dsrna, 但与模拟感染相比, 荧光信号是不可微的。最初用于泛肠病毒检测的 mab 9d5 被发现是特定于 dsrna 的,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们要感谢 utmb 成像核心设施和 maxim ivnikov 的显微镜协助。
这项工作得到了公共卫生服务机构向 sp、给方案的 utmb 承诺基金 p84373 和 t32 ai007526 至 em 的 RO1AI093445 和 ro1aia129198 赠款的支持。
Materials
| APEX Alexa Fluor 647 antibody labeling kit | Invitrogen | A10475 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A4503 | |
| DAPI | Cell Signaling | 4083 | 1:1,000 dilution |
| Donkey-anti rabbit Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-11058 | 1:2,000 dilution; Lot #: 1454437 |
| Dulbecco's modified Eagle's medium | Corning | 10-013-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Bio | S11150 | |
| Glass microscope slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Goat-anti mouse Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11029 | 1:2000 dilution; Lot #: 1874804 |
| Human lung epithelial A549 cells | ATCC | CCL-185 | |
| Methanol | Fisher | A412 | Stored at -20 °C |
| Mouse MAb anti-JUNV NP | BEI | NA05-AG12 | Conjugated to Alexa-647 at 1:1,000 dilution |
| Mouse MAb pan-Enterovirus 9D5 Reagent | Millipore Sigma | 3361 | ready for use; diluted to 1:2; Lot #: 3067445 |
| PBS supplemented with Ca and Mg | Corning | 21-030-CV | |
| PDL Coated coverslips | Neuvitro | H-12-1.5-pdl | |
| ProLong Gold antifade | Invitrogen | P10144 | |
| Rabbit MAb MDA-5 | Abcam | ab126630 | 1:250 dilution; Lot #: GR97758-7 |
| recombiant Candid#1 strain of JUNV | Lab generated | Lab generated | As previously described in reference 13. |
| RIG-I mouse MAb conjugated to Alexa-594 | Santa Cruz | sc-376845 | 1:1000 dilution; Lot #: AO218 |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 |
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