Summary

Конфокальная томография двуцепочечной РНК и шаблон признание рецепторов в отрицательной смысл РНК вируса

Published: January 26, 2019
doi:

Summary

Двуцепочечной РНК производится во время репликации РНК вируса могут быть признаны рецепторов признание шаблон побудить врожденный иммунный ответ. Для отрицательных смысл РНК-вирусов взаимодействие между низкоуровневых двуцепочечной ДНК и РРСС остается неясным. Мы разработали метод confocal микроскопии для визуализации Аренавирусы двуцепочечной ДНК и ПРР в отдельных клетках.

Abstract

Двуцепочечные РНК (ds) выпускается в виде репликативной промежуточных во время РНК вируса. Признание малым интерферирующим РНК, принимающих шаблон признание рецепторов (ПРРС) как ретиноевой кислоты (RIG-я) как рецепторы (RLRs) рог-I и меланома дифференциация связанные белком 5 (MDA-5) приводит к индукции врожденный иммунный ответ. Формирования и внутриклеточного распределения двуцепочечной ДНК в положительных смысле РНК вируса также характеризуется микроскопии. Многие РНК-вирусов негативные чувства, включая некоторые аренавирусов, триггер врожденный иммунный ответ во время инфекции. Однако отрицательный смысл РНК-вирусов предполагалось производить низкий уровень двуцепочечной ДНК, что препятствует исследования изображений PRR распознавания вирусной РНК. Кроме того инфекции эксперименты с высоко патогенного аренавирусов должны выполняться в высокой сдерживания биобезопасности уровня удобства (BSL-4). Взаимодействие между вирусной РНК и неродным для высоко патогенного вируса РНК практически неизвестны из-за дополнительных технических проблем, которые исследователи должны сталкиваться в зал BSL-4. Недавно была признана моноклональных антител (МАБ) (клон 9D 5), первоначально использовались для обнаружения Пан энтеровирусного специально обнаружить двуцепочечной ДНК с более высокой чувствительности, чем традиционные J2 или K1 антител анти-двуцепочечной ДНК. Здесь, используя 9D 5 антитела, мы описываем confocal микроскопии протокол, который успешно используется для визуализации малым интерферирующим РНК, вирусных белков и PRR одновременно в отдельных клетках, инфицированных Аренавирусы. Протокол также подходит для изображений исследования двуцепочечной ДНК и распределения PRR в патогенные Аренавирусы инфицированных клеток в BSL4 зал.

Introduction

Начальный шаг индукции врожденный иммунный ответ является признание принимающей двуцепочечные РНК (ds), модель распознавания рецепторов (ПРРС) как ретиноевой кислоты (RIG-я) как рецепторы (RLRs) рог-I и меланома дифференциация связанных белка 5 (MDA-5)1. Для положительных смысл РНК-вирусов двуцепочечной ДНК может обычно легко обнаружить с помощью моноклональных антител (МАБ)2анти dsRNA J2 или K1. Взаимодействие между малым интерферирующим РНК и РРСС в положительных нить РНК-вирусов, таких как Пикорнавирусы, характеризуется с помощью конфокальной микроскопии3. Однако для отрицательных смысл РНК вируса, визуализации и характеристика PRR и dsRNA взаимодействия сдерживается отсутствием чувствительных антител к двуцепочечной ДНК. РНК флуоресцентной гибридизации in situ (рыба) был применен к визуализации вирусной РНК и РРСС4. Тем не менее рыба методология требует знания РНК последовательности целевого объекта и не могут быть совместимы с PRR совместно пятнать. Недавно, 9D 5 МАБ, которая первоначально была разработана для диагностики инфекции Пан энтеровирусов, было обнаружено более чувствительны, чем J2 МАБ и может легко обнаружить двуцепочечной ДНК в отрицательной смысле РНК вирус инфекции5,6. Таким образом МАБ 9D 5 — Роман и полезным инструментом для изучения вирусной репликации и взаимодействие между ПРР и вирусной РНК для отрицательных смысл РНК вируса.

Аренавирусов представляют собой семейство одноцепочечной, отрицательные чувство РНК-вирусов, которые включают несколько человеческие патогены, например вирус Ласса (LASV), вирус Хунин (JUNV) и Мачупо вирус (MACV), которые вызывают тяжелые геморрагические лихорадки заболевания людей7. Клинические данные из тяжелых и смертельных случаев Аргентинская геморрагическая лихорадка, вызванных новый мир Аренавирусы JUNV выставку необычно высокий уровень сывороточного ИФН α8,9. Мы показали, что патогенных аренавирусов NW (JUNV и MACV), но не патогенные Аренавирусы старого света, LASV, побудить типа я интерферон (ИФН) ответ в человека моноцитарных дендритных клеток10. Кроме того, RIG-I является одним из датчиков посредничество типа I ИФН ответ в JUNV-инфицированных клеток11. Мы также обнаружили, что белок протеинкиназы R (PKR) рецептор, который традиционно известен для распознавания малым интерферирующим РНК, активируется в болезнетворные СВ Аренавирусы инфекции12. Для более глубокого понимания механизма вирус специфических ИФН ответа во время Аренавирусы инфекции, мы стремились разработать протокол к визуализировать взаимодействие между вирусной РНК и цитоплазматических РРСС.

Инфекция эксперименты с патогенных JUNV, MACV и LASV должны быть выполнены в области биобезопасности уровня 4 (BSL-4) объектов. Таким образом помимо предположительно низкий уровень двуцепочечной ДНК, образованная в Аренавирусы инфекции, выполнения требований по биобезопасности является еще одной проблемой технику при выполнении визуализации исследования для этих высоко патогенные вирусы. Используя 9D 5 антитела и Candid1 # вакцинного штамма JUNV, конфокальная микроскопия-протокол на основе описанных в настоящем докладе, который успешно используется для визуализации малым интерферирующим РНК, вирусных белков и PRR одновременно в клетках, инфицированных Аренавирусы в BSL2 лаборатории. Протокол также подходит для визуализации внутриклеточного распределения двуцепочечной ДНК и PRR во время патогенных Аренавирусы инфекции в BSL4 зал.

Protocol

1. Подготовка A549 клеток и JUNV инфекции Семенной 2 x 105 человеческих легких A549 клеток эпителия на поли D-Лизин (PDL) покрытием стекла coverslips в 12-ну пластины на 24 часа до инфекции. Подготовить аликвоты 150 мл JUNV13 на умножение инфекции (МВД) 1.0 зубного налета, образуя блок…

Representative Results

Этот протокол был применен для изучения распределения и colocalization между RLRs (RIG-I и MDA-5) и малым интерферирующим РНК в клетках, инфицированных JUNV. Как показано на рис.1 и рис.2, накопление двуцепочечной ДНК увеличивается с течением времени как …

Discussion

Для положительных смысл РНК-вирусов и вирусов dsDNA dsRNA легко обнаружены с антитела анти dsRNA J2 широко используется. Однако производить двуцепочечной ДНК на низком уровне или ниже обнаружения с помощью же антитела2считаются отрицательный смысл РНК-вирусов. Таким образом многи…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы хотели бы поблагодарить UTMB изображений основной зал и Максим Иванников помощи микроскопа.

Эта работа была поддержана Служба общественного здравоохранения грант, RO1AI093445 и RO1AI129198 награждены SP, до UTMB приверженность Фонда P84373 для CH и T32 AI007526 ет.

Materials

APEX Alexa Fluor 647 antibody labeling kit Invitrogen A10475
BSA Sigma Aldrich A4503
DAPI Cell Signaling 4083 1:1,000 dilution
Donkey-anti rabbit Alexa Fluor 594 Invitrogen A-11058 1:2,000 dilution; Lot #: 1454437
Dulbecco's modified Eagle's medium Corning 10-013-CV
Fetal Bovine Serum Atlanta Bio S11150
Glass microscope slides Fisher 12-550-15
Goat-anti mouse Alexa Fluor 488 Invitrogen A-11029 1:2000 dilution; Lot #: 1874804
Human lung epithelial A549 cells ATCC CCL-185
Methanol Fisher A412 Stored at -20 °C
Mouse MAb anti-JUNV NP BEI NA05-AG12 Conjugated to Alexa-647 at 1:1,000 dilution
Mouse MAb pan-Enterovirus 9D5 Reagent Millipore Sigma 3361 ready for use; diluted to 1:2; Lot #: 3067445
PBS supplemented with Ca and Mg Corning 21-030-CV
PDL Coated coverslips Neuvitro H-12-1.5-pdl
ProLong Gold antifade Invitrogen P10144
Rabbit MAb MDA-5 Abcam ab126630 1:250 dilution; Lot #: GR97758-7
recombiant Candid#1 strain of JUNV Lab generated Lab generated As previously described in reference 13.
RIG-I mouse MAb conjugated to Alexa-594 Santa Cruz sc-376845 1:1000 dilution; Lot #: AO218
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787 

References

  1. Jensen, S., Thomsen, A. R. Sensing of RNA viruses: a review of innate immune receptors involved in recognizing RNA virus invasion. Journal of Virology. 86, 2900-2910 (2012).
  2. Weber, F., Wagner, V., Rasmussen, S. B., Hartmann, R., Paludan, S. R. Double-stranded RNA is produced by positive-strand RNA viruses and DNA viruses but not in detectable amounts by negative-strand RNA viruses. Journal of Virology. 80, 6 (2006).
  3. Triantafilou, K., Vakakis, E., Kar, S., Richer, E., Evans, G. L., Triantafilou, M. Visualisation of direct interaction of MDA5 and the dsRNA replicative intermediate form of positive strand RNA viruses. Journal of Cell Science. 125, 4761-4769 (2012).
  4. Onomoto, K., et al. Critical role of an antiviral stress granule containing RIG-I and PKR in viral detection and innate immunity. PLoS One. 7, e43031 (2012).
  5. Son, K. N., Liang, Z., Lipton, H. L. Double-stranded RNA is detected by immunofluorescence analysis in RNA and DNA virus infections, including those by negative-sense RNA viruses. Journal of Virology. 89, 9383-9392 (2015).
  6. Mateer, E. J., Paessler, S., Huang, C. Visualization of double-stranded RNA colocalizing with pattern recognition receptors in arenavirus infected cells. Frontiers Cellular and Infection Microbiology. 8, 251 (2018).
  7. Buchmeier, M. J., de la Torre, J. C., Peters, C. J., Knipe, D. M., Howley, P. M. Arenavirdae: The viruses and their replication. Fields Virology. 2, (2006).
  8. Levis, S. C., et al. Endogenous interferon in Argentine hemorrhagic fever. The Journal of Infectious Diseases. 149, 428-433 (1984).
  9. Levis, S. C., et al. Correlation between endogenous interferon and the clinical evolution of patients with Argentine hemorrhagic fever. Journal of Interferon Research. 5, 383-389 (1985).
  10. Huang, C., et al. Highly pathogenic new world and old world human arenaviruses induce distinct interferon response in human cells. Journal of Virology. 89, 7079-7088 (2015).
  11. Huang, C., et al. Junin virus infection activates the type I interferon pathway in a RIG-I-dependent manner. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6, e1659 (2012).
  12. Huang, C., Kolokoltsova, O. A., Mateer, E. J., Koma, T., Paessler, S. Highly pathogenic new world arenavirus infection activates the pattern recognition receptor protein kinase R without attenuating virus replication in human cells. Journal of Virology. 91, 20 (2017).
  13. Emonet, S. F., et al. Rescue from cloned cDNAs and in vivo characterization of recombinant pathogenic Romero and live-attenuated Candid#1 strains of Junin virus, the causative agent of Argentine hemorrhagic fever disease. Journal of Virology. 85 (4), 1473-1483 (2011).
  14. Child, S. J., et al. Antagonism of the protein kinase R pathway in human cells by Rhesus Cytomegalovirus. Journal of Virology. 92, 6 (2018).
  15. Hobro, A. J., Smith, N. I. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).

Play Video

Cite This Article
Mateer, E., Paessler, S., Huang, C. Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection. J. Vis. Exp. (143), e59095, doi:10.3791/59095 (2019).

View Video