Summary

二本鎖 RNA と否定的な感覚の RNA のウイルス感染におけるパターン認識受容体の共焦点レーザー顕微鏡

Published: January 26, 2019
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Summary

二本鎖 RNA ウイルス RNA の複製中に生産は、生来の免疫応答を誘導するパターン認識受容体によって認識できます。否定的な感覚の RNA のウイルスの低レベルの dsRNA と PRRs の相互作用は不明します。アレナ ウイルス科 dsRNA と個々 の細胞における PRR を視覚化する共焦点顕微鏡法を行った。

Abstract

二本鎖 (ds) RNA が RNA ウイルス感染複製中間体として生成されます。レチノイン酸などには、[ホストのパターン認識の受容器 (PRRs) による dsRNA の認識 (リグ-私) 受容体 (RLRs) リグが好き-私と黒色腫分化関連タンパク質 5 (MDA-5) は、生得の免疫反応の誘導に 。形成と肯定的な感覚の RNA ウイルス感染における dsRNA の細胞内分布をよく顕微鏡によって特徴づけられています。多く否定的な感覚の RNA のウイルスなどいくつかのアレナは、感染時に生得の免疫反応をトリガーします。しかし、否定的な感覚の RNA のウイルスは dsRNA ウイルス dsRNA の PRR 認識のイメージング研究を妨げるの低レベルを生成すると考えられました。さらに、高い封じ込めバイオ セーフティ レベル設備 (BSL-4) で高病原性アレナでの感染実験を行う必要があります。高病原性 RNA ウイルスのウイルスの RNA と PRRs の相互作用は主研究者は BSL 4 施設に直面する必要がある追加の技術的な課題のため知られています。最近では、もともとパン エンテロ ウイルス検出用モノクローナル抗体 (Mab) (クローン 9 5) は特に伝統的な J2 または K1 アンチ dsRNA の抗体よりも高い感度で dsRNA を検出する発見されています。9 5 を用いて、抗体、dsRNA ウイルス蛋白質、アレナ ウイルスに感染した細胞で同時に PRR を視覚化するために正常に使用されている共焦点の顕微鏡検査プロトコルについて述べる。プロトコルの dsRNA の PRR BSL4 施設における病原性アレナ ウイルス感染細胞分布のイメージングにも適しています

Introduction

生得の免疫反応の誘導の最初のステップは二本鎖 (ds) RNA によって、パターン認識の受容器 (PRRs) レチノイン酸などの宿主認識 (リグ-私) 受容体 (RLRs) リグが好き-私と黒色腫分化関連タンパク質 5 (MDA-5)1。肯定的な感覚の RNA のウイルスの dsRNA 容易に検出できる J2 または K1 アンチ dsRNA のモノクローナル抗体 (Mab)2を使用しています。DsRNA と PRRs のピコルナ ウイルスなどのプラス鎖 RNA ウイルスの相互作用は、共焦点顕微鏡3を使用して特徴づけられています。ただし、否定的な感覚 RNA ウイルス、PRR と dsRNA の相互作用の可視化とによって妨げられている dsRNA に敏感な抗体の欠如。RNA 蛍光そのままの交配 (魚) は、ウイルスの RNA と PRRs4の可視化に適用されています。それにもかかわらず、魚方法論はターゲット RNA シーケンスの知識が必要です、PRR は共同染色と互換性がない可能性があります。最近、9 5 パン エンテロ ウイルス感染症の診断のため開発された、Mab 見つかり J2 モノクローナル抗体よりも高感度が容易に否定的な感覚の RNA ウイルス感染症5,6に dsRNA を検出します。したがって、Mab 9 5 が斬新で、ウイルスの複製と PRR および否定的な感覚の RNA ウイルスのウイルスの RNA 間の相互作用を検討するときに役立ちます。

アレナは、単一座礁させた、否定的な感覚の RNA ウイルス、ラッサ ウイルス (LASV)、フニン ウイルス (JUNV)、Machupo ウイルス (MACV)、人間7に重度の出血熱の病気を引き起こすなど、いくつかの人間の病原体を含む家族です。JUNV 新世界アレナ ウイルスによって引き起こされるアルゼンチン出血熱の重症や死亡するケースから臨床データを表わす血清 IFN α8,9の異常に高いレベル。病原性の NW アレナ (JUNV、MACV) がない、病原性旧世界アレナ ウイルス科、LASV、型を誘発することを示した私10ひと単球由来樹状細胞におけるインターフェロン (IFN) 応答します。さらに、リグ-私は、センサーの一つを仲介する I 型 IFN の応答 JUNV 感染細胞11。DsRNA 認識のため伝統的に知られている蛋白質キナーゼ (PKR) R 受容体が病原性 NW アレナ ウイルス感染12でアクティブであることが分かった。アレナ ウイルス感染ウイルスに特有な IFN 応答のメカニズムをさらに理解するには、dsRNA ウイルスと細胞質の PRRs の相互作用を視覚化するためのプロトコルの開発を目的とします。

病原性 JUNV、MACV LASV と感染実験は、バイオ セーフティにおける行いますレベル 4 (BSL-4) 施設。したがって、アレナ ウイルス感染で形成された dsRNA のおそらく低レベル、に加えてバイオセイフティ要件を満たす別技術課題ですこれらの高病原性ウイルスのイメージングを行う際。9 5 を用いた抗体と JUNV の Candid1 # ワクチン株、共焦点顕微鏡ベースのプロトコルは dsRNA ウイルス蛋白質、PRR のアレナ ウイルスによる感染細胞で同時に視覚化に正常に使用されているこのレポートに記載されています。BSL2 実験室。プロトコルは、dsRNA と PRR BSL4 施設における病原性アレナ ウイルス感染時に細胞内に分布の可視化に適しています。

Protocol

1 作成 A549 細胞と JUNV 感染症 ポリ-D-リジン (PDL) に種子 2 x 10 の5ひと肺上皮 A549 細胞は、感染前に 24 時間で 12 ウェルのプレートにガラス coverslips をコーティングしました。 1.0 プラーク ダルベッコ変更されたワシの媒体 (DMEM) 培地 2% ウシ胎児血清 (FBS) と 1% ペニシリンとストレプトマイシン (P/S で希釈したセルごとユニットを形成 JUNV13感染症 (MOI) の?…

Representative Results

このプロトコルは、配布し、RLRs の間の共存の研究に応用された (リグ-私は、MDA 5) と JUNV 感染細胞における dsRNA。図 1と図 2のように、ウイルス感染の進行につれて dsRNA の蓄積が増加します。MDA-5 (図 1) とリグを集中-(図 2) 信号は、NP、dsRNA の点状の構造の結果発見されました。<…

Discussion

肯定的な感覚の RNA のウイルスは、dsDNA ウイルス dsRNA は J2 アンチ dsRNA の広く使用される抗体を容易に検出されます。ただし、否定的な感覚の RNA のウイルスは、低または2同じ抗体を使用して検出のレベルの下の dsRNA を生成すると考えられています。したがって、ウイルスの RNA と PRR の相互作用の多くの側面は否定的な感覚の RNA のウイルスの明確な主ではありません。J2 ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

顕微鏡支援のための UTMB イメージングの中核施設とマキシム ・ イワニコフに感謝したいと思います。

この作品は、公衆衛生サービスによって支えられた RO1AI093445 と RO1AI129198 受賞に SP、ch、UTMB コミットメント基金 P84373 と EM を T32 AI007526 を付与します。

Materials

APEX Alexa Fluor 647 antibody labeling kit Invitrogen A10475
BSA Sigma Aldrich A4503
DAPI Cell Signaling 4083 1:1,000 dilution
Donkey-anti rabbit Alexa Fluor 594 Invitrogen A-11058 1:2,000 dilution; Lot #: 1454437
Dulbecco's modified Eagle's medium Corning 10-013-CV
Fetal Bovine Serum Atlanta Bio S11150
Glass microscope slides Fisher 12-550-15
Goat-anti mouse Alexa Fluor 488 Invitrogen A-11029 1:2000 dilution; Lot #: 1874804
Human lung epithelial A549 cells ATCC CCL-185
Methanol Fisher A412 Stored at -20 °C
Mouse MAb anti-JUNV NP BEI NA05-AG12 Conjugated to Alexa-647 at 1:1,000 dilution
Mouse MAb pan-Enterovirus 9D5 Reagent Millipore Sigma 3361 ready for use; diluted to 1:2; Lot #: 3067445
PBS supplemented with Ca and Mg Corning 21-030-CV
PDL Coated coverslips Neuvitro H-12-1.5-pdl
ProLong Gold antifade Invitrogen P10144
Rabbit MAb MDA-5 Abcam ab126630 1:250 dilution; Lot #: GR97758-7
recombiant Candid#1 strain of JUNV Lab generated Lab generated As previously described in reference 13.
RIG-I mouse MAb conjugated to Alexa-594 Santa Cruz sc-376845 1:1000 dilution; Lot #: AO218
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787 

References

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Cite This Article
Mateer, E., Paessler, S., Huang, C. Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection. J. Vis. Exp. (143), e59095, doi:10.3791/59095 (2019).

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