تصوير [كنفوكل] الحمض النووي الريبي مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل ونمط الاعتراف مستقبلات في الإصابة بفيروسات الرنا الشعور السلبي
Summary
يمكن التعرف عليه المنتجة أثناء النسخ المتماثل فيروسات الرنا الحمض النووي الريبي مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل بنمط الاعتراف مستقبلات للحث استجابة المناعية فطرية. للبحث عن فيروسات الحمض النووي الريبي الشعور السلبي، التفاعل بين دسرنا ذات المستوى المنخفض وبرس مازال غير واضح. قمنا بتطوير أسلوب الفحص المجهري [كنفوكل] لتصور دسرنا أرينافيروس وبر في الخلايا الفردية.
Abstract
مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل (ds) الجيش الملكي النيبالي ينتج متوسطة replicative أثناء الإصابة بفيروسات الرنا. الاعتراف دسرنا بالمضيف نمط الاعتراف مستقبلات (برس) مثل حمض الريتينويك (تلاعب-أنا) مثل مستقبلات (رلرس) تلاعب-وسرطان الجلد المرتبطة بالتمايز البروتين 5 (نجمة داود الحمراء-5) يؤدي إلى تحريض الاستجابة المناعية الفطرية. تشكيل وتوزيع داخل الخلايا دسرنا في الإصابة بفيروسات الرنا إيجابية بمعنى جيد اتسم بالفحص المجهري. تؤدي العديد من فيروسات الحمض النووي الريبي الشعور السلبي، بما في ذلك بعض أرينافيروسيس، الاستجابة المناعية الفطرية أثناء الإصابة. ومع ذلك، يعتقد فيروسات الرنا سلبي بمعنى إنتاج مستويات منخفضة من دسرنا، مما يعوق الدراسة التصوير بر الاعتراف دسرنا الفيروسية. بالإضافة إلى ذلك، يجب إجراء تجارب العدوى مع أرينافيروسيس شديدة العدوى في مرافق مستوى السلامة الأحيائية الاحتواء عالية (BSL-4). التفاعل بين الجيش الملكي النيبالي الفيروسية وبرس لفيروسات الرنا شديد العدوى غير معروف إلى حد كبير نظراً للتحديات التقنية الإضافية التي يحتاج الباحثون مواجهة في مرافق BSL-4. في الآونة الأخيرة، تم العثور على جسم [مونوكلونل] (ماب) (استنساخ 5 9) في الأصل تستخدم للكشف عن الفيروس المعوي عموم على وجه التحديد الكشف عن دسرنا مع حساسية أعلى من الأجسام المضادة-دسرنا J2 أو K1 التقليدية. هنا، باستخدام 5 9 جسم، يمكننا وصف بروتوكول الفحص المجهري [كنفوكل] التي استخدمت بنجاح لتصور دسرنا والبروتينات الفيروسية وبر في نفس الوقت في الخلايا الفردية بالعدوى عن طريق أرينافيروس. البروتوكول أيضا مناسبة للتصوير الدراسات دسرنا وتوزيع بر في خلايا أرينافيروس المسببة للأمراض بالعدوى في مرافق BSL4.
Introduction
الخطوة الأولى في تنظيم دورات تعريفية للاستجابة المناعية الفطرية المضيف اعتراف مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل (ds) الجيش الملكي النيبالي المستقبلات التعرف على نمط (برس) مثل حمض الريتينويك (تلاعب-أنا) مثل مستقبلات (رلرس) تلاعب-وسرطان الجلد المرتبط بتمايز البروتين 5 (نجمة داود الحمراء-5)1. للبحث عن فيروسات الرنا إيجابية، بمعنى، دسرنا يمكن عادة يسهل الكشف عن استخدام J2 أو K1 مونوكلونل (ماب) مكافحة دسرنا2. التفاعل بين دسرنا وبرس في فيروسات الرنا حبلا إيجابية، مثل بيكورنافيروس، اتسم باستخدام الفحص المجهري [كنفوكل]3. ومع ذلك، للنفي بمعنى فيروسات الرنا، التصور والوصف للتفاعل بر ودسرنا عرقل عدم وجود الأجسام المضادة حساسة إلى دسرنا. الجيش الملكي النيبالي فلوري التهجين في الموقع (الأسماك) قد طبق على التصور من الجيش الملكي النيبالي وبرس الفيروسية4. على الرغم من ذلك، يتطلب معرفة الهدف تسلسل الحمض النووي الريبي المنهجية الأسماك وقد لا تكون متوافقة مع بر تلطيخ المشترك. في الآونة الأخيرة، 5 9 ماب، التي وضعت أصلاً لتشخيص الإصابة بالفيروس المعوي عموم، وجد أن تكون أكثر حساسية من ماب J2 ويمكن أن يسهل الكشف عن دسرنا السلبية-معنى الإصابة بفيروسات الرنا5،6. وهكذا، هو ماب 5 9 رواية وأداة مفيدة لدراسة النسخ المتماثل الفيروسية والتفاعل بين بر والجيش الملكي النيبالي الفيروسية لفيروسات الرنا بمعنى سلبي.
أرينافيروسيس هي عائلة من فيروسات الحمض النووي الريبي المفرد-الذين تقطعت بهم السبل، والسلبية، بمعنى، التي تشمل عدة مسببات الأمراض البشرية، مثل الفيروسات آسا (لاسف) وفيروس جونين (جانف) وفيروس ماتشوبو (مكف)، التي تسبب أمراض الحمى النزفية الحادة في البشر7. البيانات السريرية من حالات حادة وقاتلة من الحمى النزفية الأرجنتينية الناجمة عن أرينافيروس العالمي الجديد جانف يحمل مستويات عالية على نحو غير عادي للمصل IFN-α8،9. وقد أظهرنا أن أرينافيروسيس NW المسببة للأمراض (جانف ومكف)، ولكن ليس الممرضة العالم القديم أرينافيروس، لاسف، الحث على نوع أنا استجابة انترفيرون (IFN) في الخلايا الجذعية البشرية المشتقة من الوحيدات10. وعلاوة على ذلك، تلاعب-يعتبر من أجهزة الاستشعار التوسط للنوع الأول استجابة IFN في الخلايا المصابة جانف11. كما وجدنا أن تنشيط مستقبلات البروتين كيناز R (PKR)، الذي يعرف تقليديا للاعتراف دسرنا، في أرينافيروس شمال غرب الممرضة العدوى12. زيادة فهم إليه استجابة IFN الخاصة بالفيروس أثناء الإصابة أرينافيروس، كنا نهدف إلى وضع بروتوكول لتصور التفاعل بين دسرنا الفيروسية وبرس هيولى.
تجارب العدوى مع الممرضة جانف، مكف ولاسف قد يكون أداؤها في السلامة الأحيائية من المستوى 4 (BSL-4) المرافق. وهكذا، بالإضافة إلى يفترض أن انخفاض مستوى دسرنا شكلت في الإصابة أرينافيروس، الوفاء بمتطلبات السلامة البيولوجية تقنية تحد آخر عند إجراء دراسات التصوير لهذه الفيروسات المسببة للأمراض عالية. باستخدام 5 9 جسم وسلالة اللقاح Candid1 # من جانف، بروتوكول المستندة إلى الفحص المجهري [كنفوكل] المبين في هذا التقرير، وقد استخدمت بنجاح لتصور دسرنا والبروتينات الفيروسية وبر في الخلايا المصابة التي أرينافيروس في واحد مختبرات BSL2. البروتوكول أيضا مناسبة للتصور للتوزيع داخل الخلايا دسرنا وبر خلال العدوى أرينافيروس المسببة للأمراض في مرافق BSL4.
Protocol
Representative Results
Discussion
فيروسات الرنا إيجابية بمعنى والفيروسات dsDNA، يتم الكشف عن سهولة دسرنا مع الأضداد المضادة-دسرنا J2 المستخدمة على نطاق واسع. ومع ذلك، يعتقد فيروسات الرنا سلبية، بمعنى إنتاج دسرنا في مستوى منخفض، أو دون مستوى الكشف عن استخدام جسم نفس2. وبالتالي، العديد من جوانب التفاعل الجيش الملك…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر يزيد التصوير المرافق الأساسية وايفانيكوف مكسيم على مساعدة مجهر.
هذا العمل كان تدعمها “خدمة الصحة العامة” منح منحت RO1AI093445 و RO1AI129198 إلى SP، يزيد التزام الصندوق P84373 للفصل، و AI007526 T32 إلى م.
Materials
| APEX Alexa Fluor 647 antibody labeling kit | Invitrogen | A10475 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A4503 | |
| DAPI | Cell Signaling | 4083 | 1:1,000 dilution |
| Donkey-anti rabbit Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-11058 | 1:2,000 dilution; Lot #: 1454437 |
| Dulbecco's modified Eagle's medium | Corning | 10-013-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Bio | S11150 | |
| Glass microscope slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Goat-anti mouse Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11029 | 1:2000 dilution; Lot #: 1874804 |
| Human lung epithelial A549 cells | ATCC | CCL-185 | |
| Methanol | Fisher | A412 | Stored at -20 °C |
| Mouse MAb anti-JUNV NP | BEI | NA05-AG12 | Conjugated to Alexa-647 at 1:1,000 dilution |
| Mouse MAb pan-Enterovirus 9D5 Reagent | Millipore Sigma | 3361 | ready for use; diluted to 1:2; Lot #: 3067445 |
| PBS supplemented with Ca and Mg | Corning | 21-030-CV | |
| PDL Coated coverslips | Neuvitro | H-12-1.5-pdl | |
| ProLong Gold antifade | Invitrogen | P10144 | |
| Rabbit MAb MDA-5 | Abcam | ab126630 | 1:250 dilution; Lot #: GR97758-7 |
| recombiant Candid#1 strain of JUNV | Lab generated | Lab generated | As previously described in reference 13. |
| RIG-I mouse MAb conjugated to Alexa-594 | Santa Cruz | sc-376845 | 1:1000 dilution; Lot #: AO218 |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 |
References
- Jensen, S., Thomsen, A. R. Sensing of RNA viruses: a review of innate immune receptors involved in recognizing RNA virus invasion. Journal of Virology. 86, 2900-2910 (2012).
- Weber, F., Wagner, V., Rasmussen, S. B., Hartmann, R., Paludan, S. R. Double-stranded RNA is produced by positive-strand RNA viruses and DNA viruses but not in detectable amounts by negative-strand RNA viruses. Journal of Virology. 80, 6 (2006).
- Triantafilou, K., Vakakis, E., Kar, S., Richer, E., Evans, G. L., Triantafilou, M. Visualisation of direct interaction of MDA5 and the dsRNA replicative intermediate form of positive strand RNA viruses. Journal of Cell Science. 125, 4761-4769 (2012).
- Onomoto, K., et al. Critical role of an antiviral stress granule containing RIG-I and PKR in viral detection and innate immunity. PLoS One. 7, e43031 (2012).
- Son, K. N., Liang, Z., Lipton, H. L. Double-stranded RNA is detected by immunofluorescence analysis in RNA and DNA virus infections, including those by negative-sense RNA viruses. Journal of Virology. 89, 9383-9392 (2015).
- Mateer, E. J., Paessler, S., Huang, C. Visualization of double-stranded RNA colocalizing with pattern recognition receptors in arenavirus infected cells. Frontiers Cellular and Infection Microbiology. 8, 251 (2018).
- Buchmeier, M. J., de la Torre, J. C., Peters, C. J., Knipe, D. M., Howley, P. M. Arenavirdae: The viruses and their replication. Fields Virology. 2, (2006).
- Levis, S. C., et al. Endogenous interferon in Argentine hemorrhagic fever. The Journal of Infectious Diseases. 149, 428-433 (1984).
- Levis, S. C., et al. Correlation between endogenous interferon and the clinical evolution of patients with Argentine hemorrhagic fever. Journal of Interferon Research. 5, 383-389 (1985).
- Huang, C., et al. Highly pathogenic new world and old world human arenaviruses induce distinct interferon response in human cells. Journal of Virology. 89, 7079-7088 (2015).
- Huang, C., et al. Junin virus infection activates the type I interferon pathway in a RIG-I-dependent manner. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6, e1659 (2012).
- Huang, C., Kolokoltsova, O. A., Mateer, E. J., Koma, T., Paessler, S. Highly pathogenic new world arenavirus infection activates the pattern recognition receptor protein kinase R without attenuating virus replication in human cells. Journal of Virology. 91, 20 (2017).
- Emonet, S. F., et al. Rescue from cloned cDNAs and in vivo characterization of recombinant pathogenic Romero and live-attenuated Candid#1 strains of Junin virus, the causative agent of Argentine hemorrhagic fever disease. Journal of Virology. 85 (4), 1473-1483 (2011).
- Child, S. J., et al. Antagonism of the protein kinase R pathway in human cells by Rhesus Cytomegalovirus. Journal of Virology. 92, 6 (2018).
- Hobro, A. J., Smith, N. I. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
