Imagerie confocale d’ARN bicaténaire et récepteurs de reconnaissance de modèle dans l’infection par le Virus ARN de polarité négative
Summary
ARN bicaténaire produite lors de la réplication des virus à ARN sont reconnaissables par les récepteurs de reconnaissance de modèle pour induire une réponse immunitaire innée. Pour les virus à ARN sens négatif, l’interaction entre l’Arndb à basse altitude et PRRs reste floue. Nous avons développé une méthode de microscopie confocale afin de visualiser les arénavirus dsRNA et PRR dans des cellules individuelles.
Abstract
Double-brin (ds) RNA est produit comme intermédiaire réplicatif pendant l’infection de virus à ARN. Reconnaissance de dsRNA de récepteurs de reconnaissance modèle hôte (SDRP) tels que l’acide rétinoïque (RIG-je) comme des récepteurs (SRRL) RIG-I et mélanome protéine associée à la différenciation 5 (MDA-5) conduit à l’induction de la réponse immunitaire innée. La formation et la distribution intracellulaire de l’Arndb dans l’infection de virus à ARN de polarité positive a été bien caractérisées par microscopie. Plusieurs virus à ARN sens négatif, y compris certains arénavirus, déclenchent la réponse immunitaire innée au cours de l’infection. Toutefois, les virus à ARN sens négatif étaient censés produire de faibles niveaux d’Arndb, qui fait obstacle à l’étude d’imagerie de la reconnaissance de la PRR d’Arndb virale. En outre, des expériences d’infection avec arénavirus hautement pathogène doivent être effectuées dans les installations de niveau de biosécurité de confinement élevé (BSL-4). L’interaction viral RNA / EREP hautement pathogène du virus ARN ignore en grande partie en raison des défis techniques supplémentaires que les chercheurs doivent faire face dans les installations de BSL-4. Récemment, un anticorps monoclonal (ACM) (clone 9 5) initialement utilisé pour la détection de pan-entérovirus s’est avéré de détecter spécifiquement dsRNA avec une sensibilité plus élevée que les anticorps d’anti-dsRNA J2 ou K1 traditionnels. Dans les présentes, en utilisant les 5 9 anticorps, les auteurs décrivent un protocole de microscopie confocale qui a été utilisé avec succès pour visualiser l’Arndb, protéine virale et PRR simultanément dans les cellules infectées par des arénavirus. Le protocole est également adapté aux études de dsRNA et distribution de PRR dans les cellules pathogènes arénavirus infectés dans BSL4 installations d’imagerie.
Introduction
L’étape initiale de l’induction de la réponse immune innée est reconnaissance hôte de double-brin (ds) RNA par les récepteurs de reconnaissance de modèle (SDRP) tels que l’acide rétinoïque (RIG-je) comme des récepteurs (SRRL) RIG-I et mélanome associée à la différenciation protéine obligatoire 5 (MDA-5)1. Pour les virus ARN de polarité positive, dsRNA habituellement facilement repérables à l’aide de la J2 ou K1 anti-dsRNA anticorps monoclonaux (ACM)2. Interaction entre dsRNA et rer dans les virus à ARN brin positif, comme les picornavirus, a été caractérisée à l’aide de la microscopie confocale3. Toutefois, pour les virus à ARN sens négatif, visualisation et la caractérisation de l’interaction PRR et dsRNA a été entravée par l’absence d’anticorps sensibles d’Arndb. Hybridation in situ fluorescente (FISH) de RNA a été appliquée à la visualisation de viral RNA et PRRs4. Néanmoins, la méthodologie de poisson nécessite la connaissance de l’objectif de la séquence d’ARN et ne peut-être pas être compatible avec PRR conjointement la coloration. Récemment, le 5 de 9 Mab, qui a été initialement développé pour le diagnostic de l’infection à entérovirus-pan, s’est avéré être plus sensible que le Mab J2 et peut facilement détecter les Arndb en sens négatif infection de virus à ARN5,6. Ainsi, Mab 9 5 est un outil utile pour étudier la réplication virale et l’interaction entre le PRR et l’ARN viral pour les virus à ARN de polarité négative et novateur.
Arenavirus sont une famille de virus à ARN monocaténaire, polarité négative, qui comprennent plusieurs pathogènes humains, tels que les virus de Lassa (LASV), le virus Junin (JUNV) et le virus de Machupo (MACV), qui provoquent des maladies de fièvre hémorragique sévère chez les humains,7. Les données cliniques de cas graves et mortels de Argentine fièvre hémorragique causée par le nouveau monde arénavirus JUNV présentent des niveaux anormalement élevés de sérum IFN-α8,9. Nous avons montré que le pathogène arénavirus NW (JUNV et MACV), mais pas les pathogènes du vieux monde arénavirus, LASV, induisent un type j’ai réponse interféron (IFN) dans les cellules dendritiques humaines macrophages dérivés de monocytes,10. En outre, RIG-I est un des capteurs médiant de type I réponse IFN dans les cellules infectées par le JUNV11. Nous avons également constaté que le R (PKR) récepteur kinase, qui est traditionnellement connu pour la reconnaissance de l’Arndb, est activé en pathogènes NW arénavirus infection12. Pour mieux comprendre le mécanisme de réponse IFN spécifiques du virus pendant l’infection arénavirus, visait à élaborer un protocole pour visualiser l’interaction entre l’Arndb virale et le SDRP cytoplasmique.
Expériences d’infection pathogène JUNV, MACV et LASV doivent être réalisées dans la biosécurité de niveau 4 installations (BSL-4). Ainsi, en plus du niveau présumée faible d’Arndb formé en infection arénavirus, satisfaisant aux prescriptions de prévention des risques biotechnologiques est un autre défi technique lors de l’exécution des études d’imagerie pour ces virus hautement pathogènes. En utilisant les 5 9 anticorps et la souche du vaccin Candid1 # de JUNV, un protocole basé sur la microscopie confocal est décrit dans le présent rapport, qui a été utilisé avec succès pour visualiser l’Arndb, protéine virale et PRR simultanément dans les cellules infectées par arénavirus dans Laboratoires BSL2. Le protocole est également adapté pour la visualisation de la distribution intracellulaire de l’Arndb et PRR pendant l’infection pathogène arénavirus dans BSL4 installations.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pour les virus ARN à polarité positive et virus dsDNA, dsRNA est facilement détectable avec l’anticorps d’anti-dsRNA J2 largement utilisé. Toutefois, les virus à ARN sens négatif sont censés produire dsRNA faible ou au-dessous du niveau de détection en utilisant le même anticorps2. Ainsi, beaucoup d’aspects de l’interaction ARN et PRR virale est en grande partie floue pour les virus à ARN sens négatif. Nous avons tenté de tache de dsRNA arénavirus infection à l’aide de l’…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier les installations d’imagerie de base UTMB et Maxim Ivannikov pour microscope.
Ce travail a été soutenu par le Public Health Service accorder RO1AI093445 et RO1AI129198 attribué à SP, UTMB engagement fonds P84373 à CH et T32 AI007526 à EM.
Materials
| APEX Alexa Fluor 647 antibody labeling kit | Invitrogen | A10475 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A4503 | |
| DAPI | Cell Signaling | 4083 | 1:1,000 dilution |
| Donkey-anti rabbit Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-11058 | 1:2,000 dilution; Lot #: 1454437 |
| Dulbecco's modified Eagle's medium | Corning | 10-013-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Bio | S11150 | |
| Glass microscope slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Goat-anti mouse Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11029 | 1:2000 dilution; Lot #: 1874804 |
| Human lung epithelial A549 cells | ATCC | CCL-185 | |
| Methanol | Fisher | A412 | Stored at -20 °C |
| Mouse MAb anti-JUNV NP | BEI | NA05-AG12 | Conjugated to Alexa-647 at 1:1,000 dilution |
| Mouse MAb pan-Enterovirus 9D5 Reagent | Millipore Sigma | 3361 | ready for use; diluted to 1:2; Lot #: 3067445 |
| PBS supplemented with Ca and Mg | Corning | 21-030-CV | |
| PDL Coated coverslips | Neuvitro | H-12-1.5-pdl | |
| ProLong Gold antifade | Invitrogen | P10144 | |
| Rabbit MAb MDA-5 | Abcam | ab126630 | 1:250 dilution; Lot #: GR97758-7 |
| recombiant Candid#1 strain of JUNV | Lab generated | Lab generated | As previously described in reference 13. |
| RIG-I mouse MAb conjugated to Alexa-594 | Santa Cruz | sc-376845 | 1:1000 dilution; Lot #: AO218 |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 |
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