Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

מיקרופוקוס X-ray CT (Microfocus) הדמיה של ההדמיה הסינית ( כיום) , וקסנוטורבלה ג'ניקה (קסנואקואלאמפין)

Published: August 6, 2019 doi: 10.3791/59161
Automatic Translation
1, 2, 3, 3
1Mammalian Genetics Laboratory, National Institute of Genetics, 2Misaki Marine Biological Station, The University of Tokyo, 3Shimoda Marine Research Center, University of Tsukuba

Summary

כאן, פרוטוקולים לביצוע מיקרופוקוס רנטגן טומוגרפיה ממוחשבת (Microfocus) הדמיה של שלושה חיות חסרי חוליות ימיים מוסברים בפרוטרוט. מחקר זה מתאר שלבים כגון קיבעון לדוגמה, כתמים, הרכבה, סריקה, שחזור תמונה, וניתוח נתונים. הצעות לגבי אופן ההתאמה של הפרוטוקול עבור דגימות שונות מסופקות גם כן.

Abstract

באופן מסורתי, ביולוגים נאלצו להסתמך על שיטות הרסניות כגון הסתמכות על מנת לחקור את המבנים הפנימיים של אורגניזמים אטומים. שאינם הרסניים מיקרופוקוס רנטגן טומוגרפיה ממוחשבת (Microfocus) הדמיה הפכה לפרוטוקול עוצמה והמתעוררים בביולוגיה, בשל פיתוחים טכנולוגיים בשיטות מכתים לדוגמה וחידושים בחומרה Microfocus, עיבוד מחשבים, ונתונים תוכנות ניתוח. עם זאת, פרוטוקול זה אינו משמש בדרך כלל, כפי שהוא בשדות הרפואיים והתעשייתיים. אחת הסיבות לשימוש מוגבל זה היא העדר מדריך פשוט ומובן המכסה את כל השלבים הדרושים: אוסף לדוגמה, קיבעון, כתמים, הרכבה, סריקה, ניתוח נתונים. סיבה נוספת היא מגוון עצום של מטזואים, במיוחד חסרי חוליות ימיים. בגלל המידות המגוונות, המורפולוגיות והפיזיולוגיות, חיוני להתאים את התנאים הניסיוניים ותצורות החומרה בכל שלב, בהתאם למדגם. כאן, שיטות הדמיה microCT מוסברים בפירוט באמצעות שלושה שונים בעלי חוליות ים ימיים מגוונים: הפיניה שווה (האנטיתים, Cnidaria), Harmothoe Sp. (Polychaeta, אנאלאידה), ו xenoturbella יפני ( . קסנוטורסלדה, קסנאקומורפין הצעות על ביצוע הדמיה microCT על בעלי חיים שונים מסופקים גם.

Introduction

בדרך כלל, חוקרים ביולוגיים היו צריכים לעשות קטעים דקים ולבצע תצפיות על ידי מיקרוסקופ אור או אלקטרון כדי לחקור את המבנים הפנימיים של אורגניזמים אטומים. עם זאת, שיטות אלה הן הרסניות ובעייתיות כאשר הם מוחלים על יצורים נדירים או יקרי ערך. יתר על כן, מספר שלבים בשיטה, כגון הטבעה והפחתה, הם זמן רב, והוא יכול להימשך מספר ימים כדי להתבונן במדגם, בהתאם לפרוטוקול. יתר על כן, בעת טיפול בסעיפים רבים, תמיד יש אפשרות להזיק או לאבד חלקים מסוימים. טכניקות ניקוי רקמות זמינים עבור כמה דגימות1,2,3,4,5 אך אינם ישימים עדיין עבור מינים רבים של בעלי חיים.

כדי להתגבר על בעיות אלה, כמה ביולוגים החלו להשתמש microfocus רנטגן טומוגרפיה ממוחשבת (microfocus) הדמיה6,7,8,9,10,11, . 12,13,14,15 ב-X-ray CT, המדגם הוא הוקרן עם קרני רנטגן מזוויות שונות הנוצרות ממקור X-ray נע סביב המדגם, ואת הרנטגן המשודר מנוטרים על ידי גלאי כי גם נע סביב המדגם. נתוני שידור הרנטגן שהושגו מנתחים כדי לשחזר תמונות בחתך הרוחב של הדגימה. שיטה זו מאפשרת התבוננות של מבנים פנימיים ללא הרס של המדגם. בשל בטחונו וקלות, הוא משמש בדרך כלל ביישומים רפואיים ושיניים, וניתן למצוא מערכות CT בבתי חולים ובמרכזי שיניים ברחבי העולם. יתר על כן, רנטגן תעשייתי CT משמש לעתים קרובות להתבוננות בדגימות לא רפואי עבור בדיקה מטרולוגיה בתחום התעשייה. בניגוד CT רפואי, שבו המקור רנטגן וגלאי הם ניידים, שני החלקים הם קבועים CT תעשייתי, עם המדגם מסתובבת במהלך הסריקה. CT תעשייתי בדרך כלל מייצרת תמונות ברזולוציה גבוהה יותר מאשר CT רפואי והוא המכונה microCT (ברמת מיקרומטר ברמה) או nanoCT (רזולוציה ברמת נאנמטר). לאחרונה, מחקר באמצעות microct גדל במהירות בתחומים שונים של ביולוגיה14,15,16,17,18,19, מיכל בן 20 , מיכל בן 21 , מיכל בן 22 , מיכל בן 23 , בת 24 , מיכל בן 25 , מיכל בן 26 , בן 27 , מיכל בן 28 , בן 29 , בן 30 , מיכל בן 31 , 32 , 33 , 34.

מחקרים ביולוגיים באמצעות CT ממוקדות בתחילה מבנים פנימיים המורכבים בעיקר של רקמה קשה, כגון עצם. ההתקדמות טכניקות צביעת שימוש בחומרים כימיים שונים אפשרה ויזואליזציה של רקמות רכות באורגניזמים שונים6,7,8,9,14,15 , מיכל בן 16 , מיכל בן 17 , מיכל בן 18 , מיכל בן 19 , מיכל בן 20 , מיכל בן 21 , מיכל בן 22 , מיכל בן 23 , בת 24 , מיכל בן 25 , מיכל בן 26 , בן 27 , מיכל בן 28 , בן 29 , בן 30 , מיכל בן 31 , 32 , 33 , 34. של אלה ריאגנטים, מבוססי יוד סוכנים בניגוד הם בטוחים יחסית, זול, והוא יכול לשמש להדמיה של רקמות רכות באורגניזמים שונים7,14. בנוגע לחסרי חוליות ימיים, microct נעשה שימוש נרחב על בעלי חיים כגון רכיכות6,25,32,33, annelids18,19, מיכל בן 20 , 28, וארתוראופהלחמה21,23,29,31. עם זאת, היו דיווחים מעטים על החיה האחרת phyla, כמו bryozoans6, xenacoelomorphs26, ו קטריגרים24,30. באופן כללי, היו פחות מחקרים באמצעות microCT על חסרי חוליות ימיים מאשר אלה על בעלי חוליות. אחת הסיבות העיקריות לשימוש מוגבל זה על חסרי חוליות ימיים הוא מגוון עצום שנצפו בבעלי חיים אלה. בגלל הגדלים המגוונים, הורפולוגיות והפיזיולוגיות שלהם, כל מין מגיב בצורה שונה להליכים ניסיוניים שונים. לכן, זה הכרחי במהלך הכנת המדגם לבחור את הקיבעון המתאים ביותר והכתים מגיב, ולקבוע תנאים בכל שלב, מותאם לכל מין. באופן דומה, יש צורך גם להגדיר את תצורות הסריקה, כגון שיטת ההרכבה, מתח, זרם, שיעור מגדילה מכני, ואת עוצמת רזולוציית החלל, בהתאם לכל מדגם. כדי להתגבר על בעיה זו, מדריך פשוט ומובן המכסה את כל הצעדים הנחוצים, מסביר כיצד ניתן לכוונן כל שלב בהתאם לדגימה, ומציג דוגמאות מפורטות מדגימות מרובות.

במחקר הנוכחי, אנו מתארים את פרוטוקול הדמיה microCT צעד אחר צעד, מתוך קיבעון דגימה לניתוח נתונים, באמצעות שלושה מינים חסרי חוליות ימיים. בסמוך לתחנה הביולוגית של מיססאקי, האוניברסיטה של טוקיו, נאספו דגימות של שושנת הים באקניה (אנתותים). היה להם גוף רך וכדורי שהיה בקוטר של 2 ס מ (איור 1A-C). Harmothoe sp. (Polychaeta, Annelida) דגימות נאספו גם ליד תחנת מיססאקי ימית ביולוגית. הם היו תולעים דק שהיו כ 1.5 ס מ אורך, עם chaetae קשה הנוכחי לאורך כל הגוף (איור 1D). הדגימה של Xenoturbella35 (Xenoturbella, Xenacoeloma) מדגם נאסף ליד שימודה ימית מרכז המחקר, אוניברסיטת טסוקובה, במהלך ה -13 החוף jambio האורגניזם משותף סקר. הייתה זו תולעת עדינה שהייתה כ-0.8 ס מ אורך (איור 1E). התאמות שבוצעו עבור התנאים והתצורות של כל מדגם מוסברות בפרוטרוט. המחקר שלנו מספק מספר הצעות על איך לבצע הדמיה microCT על חסרי חוליות ימיים, ואנו מקווים כי זה יהיה השראה ביולוגים להשתמש בפרוטוקול זה עבור המחקר שלהם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. קיבעון

  1. עבור המלון,הרפה את בעלי החיים ב -10% MgCl2 מי ים במשך כ -15 דקות בטמפרטורת החדר. העברה ל 70% אתנול ולאחסן בטמפרטורת החדר.
  2. עבור harmothoe sp., לשים את החיות על ידי הצבת אותם במי ים קר במשך כ 15 דקות. העברה ל 10% (v/v) פתרון פורמלין עם מי ים וחנות בטמפרטורת החדר.
  3. בשביל להרגיע את החיה באמצעות 7% MgCl2 במים מתוקים. לתקן ב 4% פאראפורמלדהיד (בכיוון הבמה) של מי ים מסוננים בלילה. המקום ב-70% אתנול וחנות ב -4 ° c.
    התראה: המטה מסוכן ויש לטפל בו בזהירות.

2. כתמים

  1. להעביר את הדגימות כדי 50% אתנול ולאחסן בטמפרטורת החדר עבור 15 h. החלף את ה 50% אתנול עם האתנול 25% החנות בטמפרטורת החדר עבור 2 h.
    הערה: אין צורך לדגום את הדגם Harmothoe ב-10% (v/v) בתמיסה עם מי-ים.
  2. להחליף את הפתרון עם מים מזוקקים (DW) ולאחסן את הדגימות ב-DW בטמפרטורת החדר עבור 2 h. חזור על שלב זה שלוש פעמים.
  3. הכינו 25% Lugol פתרון על ידי דילול פתרון המניה (להלן) ל -25% עם DW. פתרון מניות (100% Lugol הפתרון) מכיל 10 גרם של קי ו 5 g של I2, מותאם ל 100 ML עם DW.
    הערה: לוגול הפתרון הוא רגיש לאור, ולכן לאחסן ולטפל בפתרון מוגן מפני אור. בצע את ההוראות של כל מדינה ומוסד לטיפול יוד וסילוק פסולת.
  4. Decant DW מן הדגימות ויוצקים ב 25% Lugol הפתרון. . כתם ל -24 שעות בטמפרטורת החדר

3. הרכבה על הבמה

  1. הכינו 0.5% agarose על ידי המסת 500 mg agarose ב 100 mL של DW ב בקבוקון 250 משנת בקבוק בתוך מיקרוגל (800 W, כ-1-3 דקות). מגניב עד 30-40 ° צ' על ידי שמירה על טמפרטורת החדר.
    התראה: לא להתחמם או לאטום לחלוטין את הבקבוקון כאשר החימום כדי למנוע את הרתיחה מעל.
  2. הר דגימות גדולות כגון . זנב באמצעות שפופרת 50 mL.
    הערה: השתמש בצינורות 50 mL לצורך הרכבה של דגימות גדולות שאינן מתאימות ל-"כחול" מיקרופיפטה 1,000 μL.
    1. מניחים את המדגם בצלחת 60-mm עם DW לשטוף פתרון כתמים מוגזמת מפני השטח.
    2. בעדינות לשפוך 5 מ ל של 0.5% agarose לתוך שפופרת 50 mL והרדן את הצמח על קרח. להיזהר לא לעשות בועות בתוך הצמח.
    3. הוסף בעדינות 20 מ ל של 0.5% agarose לתוך שפופרת ה-mL 50 ומקום על הקרח עד agarose מתחיל הארדן. מניחים את הדגימה בתוך 0.5% agarose באמצעות מלקחיים. להיזהר לא לעשות בועות בתוך הצמח.
    4. להתאים את המיקום ואת הכיוון של המדגם עם מלקחיים להקשיח את הצמח על הקרח.
    5. מניחים חימר על הבמה הרכבה microCT ולהגדיר את צינור 50 mL על החימר (איור 2א).
  3. מטען דגימות קטנות כגון Harmothoe sp. ו -X. יפני באמצעות טיפ מיקרופיפטה של 1,000 μl.
    הערה: לקבלת דגימות קטנות יותר, ניתן להשתמש בתיאור ' צהוב ' מיקרופיפטה 200 μL. במקרה זה, להשתמש 30 μL של agarose עבור התקע ולהוסיף 200 μL של מים מזוקקים או מזוקק.
    1. לצייר את 100 μL של 0.5% agarose לתוך מיקרופיפיפטה המיקרו-1,000 מיקרו-μL ' כחול ' ולהקשיח את האגקם על ידי החזקת הקצה על הקרח, ביצוע תקע בקצה (איור 2ב-א).
    2. Decant את המדגם לתוך צלחת 60-mm ללא שימוש מלקחיים.
    3. בעדינות להעביר את המדגם באמצעות מלקחיים טבעת למנה אחרת 60-mm עם DW לשטוף פתרון כתמים מוגזמת מן המשטח.
    4. הוסף 1,000 μL של או 0.5% agarose או DW לתוך הקצה המחובר (שלב 3.3.1) באמצעות מיקרופיפטה.
      הערה: השימוש ב-0.5% agarose מומלץ, אך השתמש ב-DW לקבלת דגימות שבירות או יקרות שבהן יש להימנע ממנה.
    5. להעביר בעדינות את המדגם ממנה 60-mm לתוך הצמח או DW בקצה מחובר באמצעות מלקחיים טבעת.
    6. התאימו בעדינות את המיקום והכיוון של המדגם בעזרת מחט פטוקולטה או מלקחיים מדויקים. להיזהר לא לעשות בועות במדיום הגובר. ודא שהמדגם יציב בין קירות העצה כאשר DW משמש כאמצעי טעינה (איור 2D-b). מניחים את הקצה על הקרח כדי להקשיח את agarose אם הוא משמש כמדיום גובר.
    7. גזור את הקצה מתוך קצה מיקרופיפטה חדש 1,000 μL (איור 2b-b, c) והכנס את קצה הקצה המחובר לקצה החדש.
    8. מניחים חימר על הבמה הרכבה microCT ולהגדיר את הטיפים עם המדגם בתוך החימר (איור 2C, D).
      הערה: הפתרון מכתים יתחיל לשטוף את המדגם פעם אחת הוא ממוקם ב-DW, אז להמשיך צעד הסריקה הבא מיד.

4. סריקת מיקרו-Ct

  1. תדליק את קרן הרנטגן ב 80 kV, 100 μA.
  2. תוך כדי צפייה בתמונת ה-X-ray במרכז המסך (איור 3א), הזז את השלב כך שניתן יהיה לראות את המדגם כולו על-ידי לחיצה על הלחצנים X ו- Z (איור 3א), ובאופן ידני התאמת כפתור ציר Y בשלב ההרכבה (איור 3B). הגדר את הניגודיות של התמונה כך שניתן יהיה לצפות במבנים הפנימיים על-ידי כוונון תנאי הניגודיות (איור 3A: ניגודיות תמונה).
  3. כוונן את הכיוון של המדגם על-ידי שינוי זווית השפופרת/עצה בחימר (איור 2 א). סובב את השלב 90 ° על-ידי הגדרת ציר הסיבוב (איור 3א) כדי 90 ולחיצה על לחצן התנועה היחסית (איור 3א). בצע את אותו תמרון ארבע פעמים כדי להשלים סיבוב מלא.
    הערה: כבה את קרן ה-X באופן ידני בכל פעם שדלת הדגימה נפתחת, אלא אם המערכת תכבה אותה באופן אוטומטי.
  4. הזז את השלב כך שהמדגם יהיה במרכז התצוגה על-ידי לחיצה על לחצן ציר Z (איור 3א) ובאמצעות התאמה ידנית של כפתור ציר Y בשלב ההרכבה (איור 3ב). להפוך את השלב על ידי 90 ° ולעשות את אותו הדבר. הפעל את השלב 360 ° ובדוק שהמדגם נמצא במרכז התצוגה מכל הכיוונים.
  5. הזז את הבמה לאורך ציר ה-x לכיוון מקור קרן X-ray על-ידי לחיצה על לחצן ציר x (איור 3א) כדי להגדיל את המדגם ולהתאים לפי הצורך, כך שיתאים לתצוגה (איור 3ג).
  6. הפעל את השלב 360 ° והתאם לפי הצורך כך שהדוגמה תתאים לתצוגה מכל הכיוונים.
  7. כוונן את תנאי הסריקה כפי שמוצג בטבלה 1.
  8. התחל סריקה; זה לוקח בערך 10 דקות.

5. שחזור תמונה

  1. הפעל את תוכנת העזר של מערכת microCT ( עיין בטבלת החומרים) ופתח את הנתונים הסרוקים.
  2. כוונן את ההבדלים בציר הסיבוב של המדגם במהלך הסריקה על-ידי לחיצה על לחצן חישוב ערך המשמרת האוטומטי (איור 4א: תיבה ירוקה).
  3. כוונן את כיוון התמונה על-ידי סיבוב החיצים הכתומים (איור 4ב'). אם הכיוון השתנה, חזור על שלב 5.2.
  4. לחץ על הכרטיסיה אזור (איור 4ג: מגנטה תיבה) ואזורי חיתוך שבהם הדוגמיות אינן קיימות (איור 4ג: תיבה צהובה).
  5. לחץ על הכרטיסייה שינוי תצורה (איור 4ד: מגנטה תיבת) ולהגדיר את המסננים כדלקמן כדי להסיר רעש. מסנן טבעת להפחית את המסנן: מסנן חציון-3; מסנן חיסול רעש: ממוצע מסנן -1.
  6. לבצע תצורה מקדימה על ידי לחיצה על לחצן מינוי תצורה (איור 4ד: תיבת ירוק).
  7. כוונן בהירות וניגודיות של תמונה על-ידי הגדרת ערכי השחור-לבן כערך שחור 0, ערך לבן 250 (איור 4ד: תיבה כחולה).
  8. שמור את ערכת הנתונים של תמונת TIFF ששוחזר כ-TIFF של 8 סיביות על-ידי לחיצה על לחצן שמור. שינוי שם של קובצי TIFF כדלקמן: Date_sample_resolution (μm) _ number. TIFF.
    הערה: הנתונים microCT המקורי ממחקר זה זמינים במאגר תאנה, דוי: 10.6084/m9. תאנה. 767083736.

6. ניתוח נתונים

  1. הפעל את תוכנת ניתוח הנתונים (ראה את הטבלה של חומרים) ולאפשר ייבוא של קבצי TIFF על ידי לחיצה על סמל מסד הנתונים (איור 5A: תיבת מגנטה) וכיבוי התיבה המוצגת באיור 5ב.
  2. לחץ על סמל הייבוא (איור 5ג: מגנטה בתיבה), בחר את ערכת הנתונים שנשמרה בסעיף 5 ולחץ על ' פתח'.
  3. לחץ על לחצן העתק קישורים (איור 5ד) כדי לייבא את הנתונים.
  4. הצג את החתך השני על-ידי לחיצה על סמל מציג דו-ממדי (איור 5ג: תיבה כחולה).
  5. כיול ערכת הנתונים על-ידי לחיצה על הכרטיסיה מציג תלת -ממד (איור 5E: תיבה מגנטה) והזנת ערך הרזולוציה בסריקה (שהיה 0.018 במחקר זה [איור 5F]).
  6. לחצו על סמל הבהירות/הניגודיות (איור 5E בתיבה ירוקה). כוונן את הבהירות והניגודיות על-ידי הזזת הסמן בתוך התמונה הדו-ממדית המוצגת ושינוי רמת החלון ורוחב החלון (איור 5G).
  7. בדוק תמונות חוצות-מקטעים אחרות על-ידי הזזת פס הגלילה (איור 5G: box).
  8. שנה את הכיוון של חתך הרוחב על-ידי לחיצה על סמל הכיוון (איור 5E: תיבה כחולה) ובדוק תמונות בכל הכיוונים (איור 5H).
  9. לחצו על התמונה המוצגת, ובחרו בכרטיסייה ' ייצוא ' לאחסון תמונות בחתך הרוחב.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בוצעו הדמיה microct על A. זנב (האנטיתים, cנדבך), harmothoe sp. (polychaeta, annelida), ו X. יפני (xenoturda, xenacoeloma) לאחר צביעת דגימות עם 25% lugol פתרון. הצביעת הגדילו בהצלחה את הניגודיות של המבנים הפנימיים בכל הדגימות, דבר המאפשר תצפיות של רקמות רכות פנימיות (איור 6). יחד עם דו חות העבר6,7,16,19,22,23,24,25,26 , מיכל בן 28 , בן 30 , מיכל בן 31 , 32 , 33, זה מראה כי ניתן להשתמש microct על חסרי חוליות ימיים שונים עבור המחשה מורפולוגיה שלהם, כולל רקמות פנימיות רכות. תמונות ברורות הושגו גם עם הדגימה X. יפני , אשר האפידרמיס ניזוק קשה (איור 6F, G), מראה כי שיטה זו ישימה דגימות שבירות עם נזק חיצוני.

סריקת אזור העניין בלבד, בניגוד לשטח רחב יותר, הגדילה מאוד את הבהירות והרזולוציה של התמונה (להשוות איור 6F ואיור 6G). עם זאת, מערכת נתונים אחת ברזולוציה גבוהה של הדגימה השלמה שוחזר עבור harmothoe sp. (איור 6ג) ו -X. יפני (איור 6F) ממספר סריקות שבוצעו על שונים (אך חופפים) חלקי הדגימה התפרים בין כל סריקה לא בולט בתמונות המשוחזר. המחקר שלנו מראה כי תמונות ברזולוציה גבוהה אחת ניתן להשיג עם מערכות microCT מיקרו-קרן. על-ידי סריקת שטח גדול יותר ברזולוציה גבוהה, קיים סיכון קטן יותר למשקיפים על מבנים קטנים. יתרון נוסף הוא, כי קל יותר לאתר את המיקומים היחסיים של מבנים המצויים הרחק מהשני, כגון הקצה הקדמי והאחורי של מאורך של אנמלאיד מוארך.

Figure 1
איור 1 : בעלי חיים ימיים חסרי חוליות נצפתה במחקר זה. (א-ג) האקניה שווה (אנתותים, קינידריה). (א) מהסופם של בעל חיים חי נינוח ב -10% MgCl2 מי ים. המרוחק (ב) והאבוסיים (ג) מסתיים לאחר קיבעון ב 70% אתנול. (ד) חי מורדם הארמוליי Sp. (Polychaeta, annelida), השקפה מתחת לימין עם הקדמי שמאלה. רוב הליטרה נעלמו כבר בשלב זה, ורק ארבעה מהם נותרו בקרבת הקצה האחורי. (ה) xenoturbella יפני (xenoturbella, Xenacoom, a) תוקן ב 70% אתנול. השקפה נכונה, עם הקדמי למעלה. , בגלל הנסיבות שבאיסוף. האפידרמיס שלה התחיל לרדת קנה מידה ברים = 3 מ"מ. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2 : דגימות הרכבה על מערכת טומוגרפיה ממוחשבת של רנטגן מיקרופוקוס. (א) הרכבה דגימות בצינור 50 mL באמצעות חימר. הכיוון של המדגם יכול להיות מותאם באמצעות החימר. (ב) הכנת טיפ של 1,000 μl מיקרופיפטה כחול לצורך הרכבה של דגימות קטנות. a: עצה עם הקצה שלה מחובר עם 100 μL של 0.5% agarose (קווים אלכסוניים). . הדגימות הוצבו בקצה הזה העצה עם המדגם הוכנס לתוך אחר 1,000 μL מיקרופיפטה ' כחול ' עצה (ב, ג) להרכבה. ב השתמשו ב- Xenoturbella היפני, ו-c שימש עבור Harmothoe sp. (ג) מותקן X. יפנית דגם, מבט כולל (משמאל) ולסגור (מימין). מקור רנטגן ניתן לראות ימינה של המדגם. (ד) דיאגרמות להרכבה של דגימות בטיפ כחול של 1,000 μl מיקרופיפטה. a: X. יפני דגימת מים מזוקקים. ב: המדגם היה במגע עם קיר הקצה (חיצים), כך שהוא לא זז בעת הסריקה. ג: Harmothoe sp. דגם בשנת 0.5% התעוררה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3 : סריקת דגימות על מערכת טומוגרפיה מיקרופוקוס רנטגן ממוחשבת. (א) הפעלת מסך במהלך סריקת מערכת טומוגרפיה ממוחשבת רנטגן של מיקרופוקוס מראה תמונה של שידור רנטגן של הדגימה שווה של הצליל. כוונן את החדות והבהירות באמצעות ' ניגוד תמונה ' בשמאלית התחתונה. (ב) תצוגה של השלב הגובר המציג את כפתור ציר Y. (ג) צילום רנטגן של הדגימה של A. זנב לאחר שלב ההרכבה הוזז קרוב יותר למקור קרן רנטגן. שימו לב שהוא מוגדל בהשוואה לתמונה במרכז (א). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4 : מסך ההפעלה של מערכת שחזור התמונה. (א) התאמת הבדלים בציר הסיבוב של המדגם במהלך הסריקה, תוך הצגת דגימה מועלת. תיבה מגנטה: הכרטיסיה shift; תיבה ירוקה: כפתור חישוב ערך משמרת אוטומטי. (ב) מסך להתאמת כיוון התמונה, באמצעות Harmothoe sp. (ג) מסך במהלך שחזור התמונה של A. זנב, גזיזת את האזור מחוץ לתיבה הצהובה שבה אין דוגמיות קיימות. תיבה מגנטה: כרטיסיית אזור. (ד) מסך במהלך שחזור תמונה, הצגת התמונה המשוחזרת של A. זנב. תיבה מגנטה: הכרטיסיה שינוי תצורה; תיבה ירוקה: לחצן שינוי תצורה; תיבה כחולה: התאמת ערך שחור-לבן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5 : מסך ההפעלה של מערכת ניתוח תמונה. (A) חלון העדפה. לחצת על סמל מסד הנתונים (עיגול מגנטה) כדי לפתוח את חלון ניהול הקבצים של מסד הנתונים. (ב) חלון ניהול קובץ מסד נתונים. בתוכנה זו, התיבה המוצגת עם חץ צריך להיות כבוי כדי לאפשר ייבוא קבצי TIFF. (ג) התפריט ופסי הכלים של מסך מסד הנתונים. תיבת מגנטה = סמל ייבוא; התיבה הכחולה = מציג 2D סמל. (D) חלון ייבוא של קבוצת נתונים. עיגול מגנטה = כפתור העתקת קישורים. (E) התפריט ופסי הכלים של המסך של מציג 2d. בתיבה מגנטה = הכרטיסיה מציג תלת-ממד; תיבה ירוקה = סמל בהירות/ניגודיות; התיבה הכחולה = סמל הכיוון. (F) מגדיר כיול חלון. הזן את ערכי הרזולוציה הרצויים בתוך העמודות בתיבה מגנטה. (G) חתך רוחב של דגימה ממין משולש של התמונה המוצגת בחלון הצופה הדו להתאמת הבהירות והניגודיות. תיבה מגנטה: פס גלילה לבדיקת מקטעים צולבים אחרים. (ח) חתך רוחב של A. זנב המוצגת בחלון הצופה הדו עם כיוון שונה ל (G). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6 : תמונות סרוקות ומשוחזר של חסרי חוליות ימיים. (א) קטעים רוחביים (א) רוחבי ו (ב) האורך של האקניה זנב. האזור שבתוך התיבה הצהובה המנוקדת ב (ב) מוגדל בכניסה. קיצורים: מיט, זוג הוראה mesenteries; מ', זוג mesenteries מושלם; למעלה; p, לוע; וכלי, הברות; t, זרוע; חיצים, הדיסק אוראלי; ראשי חץ לבנים, דוושה בדיסק; , ראשי חץ שחורים. שריר טבעתי שינוי קנה מידה ב-A, B = 3 מ"מ (C-E) Harmothoe sp. (ג) משונן סעיף של החלק הקדמי. (ד, ה) מקטע רוחבי בקווים מנוקדים d ו-e ב (ג). קיצורים: צ'י-שלום; acim = שריר השריר; קו = קוסום; dlm = שריר האורך האורכי; ליפשיץ; עין = עין; int = המעי; לסת = לסת; אנט = אנטנה חציון; מו = פה; mp = שרירי החוטם; לום = לום; פה = לוע; בעיה = בסיס; סוג vlm = שריר האורך הגחוני; vnc = חוט העצב הגחוני. סרגלי קנה מידה: C = 1 מ"מ; D, E = 0.3 מ"מ. (F, G) xenoturbella ג'ניקה. (F) משונן החלק של המדגם כולו. (ז) משונן בחלק הקדמי. bl = לאמינה בסיס; int = המעי; ml = שכבת שריר; מו = פה; nn = רשת עצבית באפידרמיס; חץ לבן = סטלוציסט; חץ שחור = הנקבוביות הקדמית; ראשי חץ לבנים = רשת הבלוטות הגייתי; ראשי חץ שחורים = oocytes. סרגלי קנה מידה: F = 1 מ"מ, G = 0.5 מ"מ. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Table 1
טבלה 1: הכנה לדוגמה ופרוטוקול סריקה עבור כל אחד מהדגימות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

תיקונים באמצעות פורמלין, כגון 10% (v/v) הפתרון של מי ים בשימוש במחקר זה, ידועים כדי לשמר את המבנה של חסרי חוליות מגוונות ימיים ומשמשים לעתים קרובות הדמיה microct18,24,25 ,26,28,30,33. עם זאת, ההגבלות על השימוש בכימיקלים זה הפכו קפדנית במדינות מסוימות בשנים האחרונות, ותחליפים כגון פאראפורמלדהיד או glutarאלדהיד ניתן להשתמש. אם יש תוכניות לחלץ DNA לאחר סריקה, עדיף להימנע באמצעות פורמלין כמו fixative, כי זה ידוע ל-DNA רסיס. במקרה זה, מומלץ להשתמש בתיקונים ששמרו דנ א, כגון 70% אתנול. במחקר זה, cנדבך A. זנב תוקן באמצעות 70% אתנול, ותמונות microct ברור התקבלו מ 70% אתנול-מדגמים קבועים (איור 6א, ב).

במחקר הקודם שביצע סריקת microCT של מטקא מסוגים שונים, דגימות רבות היו מיובשות ב 100% אתנול, וחלקם היו מיובשים בנקודה קריטית לפני סריקת24. למרות שאיברים פנימיים רכים כגון אשכולות זרוע, השרירים, והגונדות נצפו בהצלחה במחקר שלהם, התייבשות ותהליכי ייבוש ידועים כתוצאה בחפצי אמנות מרכזיים כגון דפורמציה והתכווצות של רקמות רכות11 , 21. במחקר הנוכחי, הצלחנו להתבונן במבנים הפנימיים של cנדבך A. זנב קבוע ב 70% אתנול ומוכתם 25% lugol פתרון (איור 6א, ב). הפרוטוקול שלנו, ללא כל שלבי התייבשות או ייבוש, עדיף, ויש לבצעו כל אימת שניתן להפחית את הסיכון לפגיעה בדגימות ובחפצי האמנות במהלך הסריקה.

Lugol פתרון, יוד פתרון, ו phosphotungstic חומצה (ועד ההורים) הם צביעת פתרונות המשמשים לעתים קרובות על דגימות ביולוגיות בהדמיה microct6,7,9,14,16, , 17,20,26,27,38 מניסיוננו של שימוש בדגימות ביולוגיות שונות, הפתרון Lugol סיפק את התוצאות הטובות ביותר עבור דגימות רבות, עם כתמים כהים בפרק זמן קצר יחסית. התמיסה יוד הניבה רק כתמים חלשים מאוד, ו-וועד ההורים דרש זמן רב לצביעת מספיק ודגימות ויטראז הראו התכווצויות חזקות. לכן, כל הדגימות היו מוכתמות בפתרון Lugol במחקר זה. עם זאת, למרות שפתרון Lugol מומלץ, פתרון ההכתמים המתאים שונה בין דגימות, ואנו מציעים שניסויים באמצעות פתרונות מכתיבי אחרים יבוצעו אם יש מספיק דגימות. ללא קשר לפתרון ההכתמים, דגימות לעשות חוזה במהלך הצביעת37,38, כך חשוב לשמור על מכתים זמן קצר.

צעד קריטי בסריקת microCT הוא לטעון את המדגם כדי למנוע את הזזת. במחקר זה, זה נעשה בשני שלבים, הראשון באמצעות agarose כמדיום ההרכבה ישירה, ולאחר מכן באמצעות חימר כדי לטעון את הצינור שהכיל את המדגם על הבמה. עבור השלב הראשון, מדיה הרכבה בצפיפות נמוכה שונים שימשו במחקרים קודמים, כולל אתנול6,17,20,25,30, agarose9,29 , וקצף פרחוני15,22,31. Agarose נבחרה במחקר זה כפי שהוא כימיקל בעלות נמוכה כי הוא נגיש ברחבי העולם. חיסרון של agarose הוא שזה עלול להיות קשה כדי לאחזר את המדגם מן המתקשה לאחר סריקה, אבל באמצעות agarose נמוך נקודה ההיתוך עושה את זה צעד האחזור קל. עבור השלב השני, מלחציים או ברגים משמשים לעתים קרובות6,9,17. קליי נבחר במחקר זה כפי שהוא מאפשר כוונונים עדינים בכיוון וזווית של המדגם. יש לשים לב לניסויים בזמני סריקה ארוכים, שכן האפשרות למעבר לדוגמה גבוהה יותר כאשר משתמשים בחימר במקום בתפסים או בברגים.

מחקר קודם שנערך סריקת microct על שבע מינים רב זיפיות עם אורכי הגוף של 2-8 מ"מ, קטן יותר harmothoe sp. בשימוש זה מחקר16. הם הצליחו לייצר תמונות ברזולוציה גבוהה, והראו איברים כגון מערכות כלי דם וברורים הפרט ברור יותר מאשר במחקר הנוכחי. הגורם העיקרי להבדל זה לא היה הפרוטוקול, אבל המפרט של מערכות microCT השתמשו. המערכת בשימוש במחקר הקודם היה מצויד מצלמה 11 מגה פיקסל מצמידים המכשיר (4000 x 2672 פיקסלים) עם רזולוציה מקסימלית של < 0.8 μm/פיקסל16. גודל מטריצה התמונה הפעילה של המערכת בשימוש במחקר זה היה 992 x 992 פיקסלים, עם רזולוציה מקסימלית של > 5 μm/פיקסל. לכן, הרזולוציה המרחבית של מערכת microCT בשימוש במחקר זה היה נחות למערכת מיקרו-ct ביצועים גבוהים המשמשים בתוך מערכת שימוש ב-t.16. הבדל זה היה מורגש במיוחד בעת סריקת דגימות קטן יותר 8 מ"מ, שבו חווינו חוסר החלטה (נתונים לא מוצגים). עם זאת, כי פחות נתונים הושגו במהלך סריקה במחקר זה, זמן הסריקה היה הרבה יותר קצר מאשר במחקר הקודם16 (נתונים: 992 x 992 ו 4000 x 2672 פיקסלים, בהתאמה; סריקת זמן: 10 כדי 26 דקות ו 30 דקות עד כמה שעות, בהתאמה). זמן סריקה קצר מפחית את שינוי הצבע של כתמים יוד, המאפשר שימוש בפתרון Lugol, שהוא פתרון טוב מכתים עם שיעור חדירה גבוהה, אבל בקלות מפזרת ב-DW34. זמן סריקה קצר גם מקטין את האפשרות של לדוגמה נע במהלך סריקה, אשר איפשר את השימוש בשיטה הרכבה פשוטה באמצעות agarose או DW (איור 2). זמן סריקה ארוך גם יש את החיסרון של הצטמקות לדוגמה אפשרי טשטוש תמונות. מספר בעיות מכניות וחומרה אחרות שעלולות להתרחש במהלך סריקות ארוכות דווחו גם39. לכן, בעת שימוש במערכות microCT, חשוב להבין במדויק את המפרט של כל מערכת, ולבחור את המערכת הנכונה מבחינת גודל הדגימה או המטרה המחקר. במקרים מסוימים, מערכת microCT עם רזולוציה נמוכה עשויה להספיק.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

אנו רוצים להודות לתוספקו שירושי לעזרתו ולמתן את סביבת המחקר במהלך מחקר זה. אנו אסירי תודה לקנסוקה יאנאגי ולטקאל איזמי לקבלת ייעוץ בנוגע ל -A. זנב, ומסיוסו טנקה לקבלת ייעוץ בנוגע לדגימה . אנו מודים לצוות במרכז המחקר הימי של שימודה, באוניברסיטת טסוקובה ובתחנה הביולוגית של מיססאקי, אוניברסיטת טוקיו לעזרתם באוספי מדגם. אנחנו רוצים להודות לנומרולאין (www.editage.jp) לעריכת שפה באנגלית. עבודה זו נתמכת על ידי ה-JSPS גרנט בסיוע עבור מדענים צעירים (א) (JP26711022) ל-HN, ו-JAMBIO, האגודה היפנית לביולוגיה ימית.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
250-ml Erlenmeyer flask Corning CLS430183
5-ml Sampling tube ST-500 BIO-BIK 103010
50-ml Polypropylene tube Greiner Bio One International 227261
60-mm Non-treated Dish IWAKI 1010-060
Agarose Promega V3125
Ecological grade tip (blue) 1000 µl BMBio BIO1000RF
Ethanol Wako Pure Chemical Industries 057-00451
Formalin Wako Pure Chemical Industries 061-00416
Iodine Wako Pure Chemical Industries 094-05421
Magnesium chloride hexahydrate Wako Pure Chemical Industries 135-00165
OsiriX DICOM Viewer Pixmeo SARL OsiriX MD v10.0 https://www.osirix-viewer.com
Paraformaldehyde Wako Pure Chemical Industries 163-25983
Petiolate needle AS ONE 2-013-01
Pipetman P200 Micropipette GILSON F123601
Pipetman P1000 Micropipette GILSON F123602
Potassium iodide Wako Pure Chemical Industries 166-03971
Precision tweezers 5 DUMONT 0302-5-PS
QuickRack MultI fit tip (yellow) 200 ul Sorenson 10660
Razor blades Feather FA-10
Ring tweezers NAPOX A-26
Stereoscopic microscope Leica MZ95
X-ray Micro-CT imaging system Comscantechno ScanXmate-E090S105

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Susaki, E. A., Tainaka, K., Perrin, D., Yukinaga, H., Kuno, A., Ueda, H. R. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
  2. Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23, 137-157 (2016).
  3. Silvestri, L., Costantini, I., Sacconi, L., Pavone, F. S. Clearing of fixed tissue: a review from a microscopist's perspective. Journal of Biomedical Optics. 21, 081205 (2016).
  4. Greenbaum, A., et al. Bone CLARITY: clearing, imaging, and computational analysis of osteoprogenitors within intact bone marrow. Science Translational Medicine. 9, (2017).
  5. Konno, A., Okazaki, S. Aqueous-based tissue clearing in crustaceans. Zoological Letters. 4, 13 (2018).
  6. Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiology. 9, 11 (2009).
  7. Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: a versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).
  8. Degenhardt, K., Wright, A. C., Horng, D., Padmanabhan, A., Epstein, J. A. Rapid 3D phenotyping of cardiovascular development in mouse embryos by micro-CT with iodine staining. Circulation Cardiovascular Imaging. 3 (3), 314-322 (2010).
  9. Metscher, B. D. X-ray microtomographic imaging of intact vertebrate embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 12, 1462-1471 (2011).
  10. Boistel, R., Swoger, J., Kržič, U., Fernandez, V., Gillet, B., Reynaud, E. G. The future of three-dimensional microscopic imaging in marine biology. Marine Ecology. 32, 438-452 (2011).
  11. Mizutani, R., Suzuki, Y. X-ray microtomography in biology. Micron. 43, 104-115 (2012).
  12. Merkle, A. P., Gelb, J. The ascent of 3D X-ray microscopy in the laboratory. Microscopy Today. 21, 10-15 (2013).
  13. Ziegler, A., Menze, B. H. Accelerated acquisition, visualization, and analysis of zooanatomical data. Computation for humanity. Information technology to advance society. Zander, J., Mosterman, P. J. , CRC Press. Boca Raton, USA. 233-260 (2013).
  14. Gignac, P. M., et al. Diffusible iodine-based contrast-enhanced computed tomography (diceCT): an emerging tool for rapid, high-resolution, 3-D imaging of metazoan soft tissues. Journal of Anatomy. 228 (6), 889-909 (2016).
  15. du Plessis, A., Broeckhoven, C., Guelpa, A., le Roux, S. G. Laboratory x-ray micro-computed tomography: a user guideline for biological samples. GigaScience. 6 (6), 1-11 (2017).
  16. Faulwetter, S., Vasileiadou, A., Kouratoras, M., Dailianis, T., Arvanitidis, C. Micro-computed tomography: Introducing new dimensions in taxonomy. ZooKeys. 263, 1-45 (2013).
  17. Staedler, Y. M., Masson, D., Schonenberger, J. Plant tissues in 3D via X-ray tomography: simple contrasting methods allow high resolution imaging. PLoS One. 8 (9), 75295 (2013).
  18. Fernández, R., Kvist, S., Lenihan, J., Giribet, G., Ziegler, A. Sine Systemate Chaos? A Versatile Tool for Earthworm Taxonomy: Non-Destructive Imaging of Freshly Fixed and Museum Specimens Using Micro-Computed Tomography. PLoS One. 9 (5), 96617 (2014).
  19. Paterson, G. L. J., et al. The pros and cons of using micro-computed tomography in gross and microanatomical assessments of polychaetous annelids. Memoirs of Museum Victoria. 71, 237-246 (2014).
  20. Faulwetter, S., Dailianis, T., Vasileiadou, K., Kouratoras, M., Arvanitidis, C. Can micro-CT become an essential tool for the 21st century taxonomist? An evaluation using marine polychaetes. Microscopy and Analysis. 28, 9-11 (2014).
  21. Sombke, A., Lipke, E., Michalik, P., Uhl, G., Harzsch, S. Potential and limitations of X-ray micro-computed tomography in arthropod neuroanatomy: a methodological and comparative survey. Journal of Comparative Neurology. 523, 1281-1295 (2015).
  22. Landschoff, J., Plessis, A., Griffiths, C. L. A dataset describing brooding in three species of South African brittle stars, comprising seven high-resolution, micro X-ray computed tomography scans. GigaScience. 4 (1), 52 (2015).
  23. Keiler, J., Richter, S., Wirkner, C. S. The anatomy of the king crab Hapalogaster mertensii Brandt, 1850 (Anomura: Paguroidea: Hapalogastridae) - new insights into the evolutionary transformation of hermit crabs into king crabs. Contributions to Zoology. 84 (2), 149-165 (2015).
  24. Holst, S., Michalik, P., Noske, M., Krieger, J., Sötje, I. Potential of X-ray micro-computed tomography for soft-bodied and gelatinous cnidarians with emphasis on scyphozoan and cubozoan statoliths. Journal of Plankton Research. 38, 1225-1242 (2016).
  25. Moles, J., Wägele, H., Ballesteros, M., Pujals, Á, Uhl, G., Avila, C. The End of the Cold Loneliness: 3D Comparison between Doto antarctica and a New Sympatric Species of Doto (Heterobranchia: Nudibranchia). PLoS One. 11 (7), 0157941 (2016).
  26. Nakano, H., et al. A new species of Xenoturbella from the western Pacific Ocean and the evolution of Xenoturbella. BMC Evolutionary Biology. 17, 245 (2017).
  27. Tsuda, K., et al. KNOTTED1 Cofactors, BLH12 and BLH14, Regulate Internode Patterning and Vein Anastomosis in Maize. Plant Cell. 29 (5), 1105-1118 (2017).
  28. Parapar, J., Candás, M., Cunha-Veira, X., Moreira, J. Exploring annelid anatomy using micro-computed tomography: A taxonomic approach. Zoologischer Anzeiger. 270, 19-42 (2017).
  29. Akkari, N., Ganske, A. S., Komerički, A., Metscher, B. New avatars for Myriapods: Complete 3D morphology of type specimens transcends conventional species description (Myriapoda, Chilopoda). PLoS One. 13 (7), 0200158 (2018).
  30. Gusmao, L. C., Grajales, A., Rodriguez, E. Sea anemones through X-rays: visualization of two species of Diadumene (Cnidaria, Actiniaria) using micro-CT. American Museum Novitates. 3907, (2018).
  31. Landschoff, J., Komai, T., du Plessis, A., Gouws, G., Griffiths, C. L. MicroCT imaging applied to description of a new species of Pagurus Fabricius, 1775 (Crustacea: Decapoda: Anomura: Paguridae), with selection of three-dimensional type data. PLoS One. 13 (9), 0203107 (2018).
  32. Machado, F. M., Passos, F. D., Giribet, G. The use of micro-computed tomography as a minimally invasive tool for anatomical study of bivalves (Mollusca: Bivalvia). Zoological Journal of the Linnean Society. , (2018).
  33. Sasaki, T., et al. 3D visualization of calcified and non-calcified molluscan tissues using computed tomography. Biomineralization. Endo, K., Kogure, T., Nagasawa, H. , Springer. Singapore. 83-93 (2018).
  34. Maeno, A., Tsuda, K. Micro-computed Tomography to Visualize Vascular Networks in Maize Stems. Bio-protocol. 8 (1), 2682 (2018).
  35. Nakano, H., et al. Correction to: A new species of Xenoturbella from the western Pacific Ocean and the evolution of Xenoturbella. BMC Evolutionary Biology. 18, 83 (2018).
  36. Maeno, A., Kohtsuka, H., Takatani, K., Nakano, H. MicroCT files from 'Microfocus X-ray computed tomography (microCT) imaging of Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida), and Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha)'. figshare. , (2019).
  37. Vickerton, P., Jarvis, J., Jeffery, N. Concentration-dependent specimen shrinkage in iodine-enhanced microCT. Journal of Anatomy. 223 (2), 185-193 (2013).
  38. Buytaert, J., Goyens, J., De Greef, D., Aerts, P., Dirckx, J. Volume shrinkage of bone, brain and muscle tissue in sample preparation for micro-CT and light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Microscopy and Microanalysis. 20 (4), 1208-1217 (2014).
  39. Sasov, A., Liu, X., Salmon, P. L. Compensation of mechanical inaccuracies in micro-CT and nano-CT. Proceedings of SPIE. 7078, 70781 (2008).

Tags

מדעי הסביבה סוגיה 150 microCT לוגול פתרון יוד הטאריניה cנדבך הארמוליא אנאידה xenoturbella xenacoelomorpha חסרי חוליות
מיקרופוקוס X-ray CT (Microfocus) הדמיה <em>של</em> ההדמיה הסינית ( <em>כיום)</em> , <em>וקסנוטורבלה ג'ניקה</em> (קסנואקואלאמפין)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Maeno, A., Kohtsuka, H., Takatani,… More

Maeno, A., Kohtsuka, H., Takatani, K., Nakano, H. Microfocus X-ray CT (microCT) Imaging of Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida), and Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha). J. Vis. Exp. (150), e59161, doi:10.3791/59161 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter