Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Микрофокус рентгеновских КТ (микроКТ) Изображение Эктинии эквины (Cnidaria), Harmothoe sp. (Аннелида), и Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha)

Published: August 6, 2019 doi: 10.3791/59161
Automatic Translation
1, 2, 3, 3
1Mammalian Genetics Laboratory, National Institute of Genetics, 2Misaki Marine Biological Station, The University of Tokyo, 3Shimoda Marine Research Center, University of Tsukuba

Summary

Здесь подробно описаны протоколы для выполнения микрофокусированной рентгеновской компьютерной томографии (микроКТ) изображений трех морских беспозвоночных животных. В этом исследовании описаны такие этапы, как фиксация образцов, окрашивание, монтаж, сканирование, реконструкция изображений и анализ данных. Предложения о том, как протокол может быть скорректирован для различных образцов также представлены.

Abstract

Традиционно биологам приходилось полагаться на разрушительные методы, такие как секционирование, чтобы исследовать внутренние структуры непрозрачных организмов. Неразрушающая микрофокусная рентгеновская компьютерная томография (microCT) стала мощным и зарождающимся протоколом в биологии, благодаря технологическим достижениям в методах окрашивания образцов и инновациях в оборудовании микрокТ, обработке компьютеров и данных аналитического программного обеспечения. Однако этот протокол обычно не используется, как и в медицинской и промышленной областях. Одной из причин такого ограниченного использования является отсутствие простого и понятного руководства, которое охватывает все необходимые этапы: сбор образцов, фиксацию, окрашивание, монтаж, сканирование и анализ данных. Другой причиной является огромное разнообразие метазоанов, особенно морских беспозвоночных. Из-за различных размеров, морфологий и физиологий морских беспозвоночных крайне важно корректировать экспериментальные условия и аппаратные конфигурации на каждом этапе, в зависимости от образца. Здесь методы микроктовой визуализации подробно описаны с помощью трех филогенетически разнообразных морских беспозвоночных: Actinia equina (Антхозоа, Книдария), Harmothoe sp. (Polychaeta, Annelida) и Xenoturbella japonica ( Ксенотурбеллида, Ксенакоэломорфа). Предложения по выполнению микрокт-изображений на различных животных также предоставляются.

Introduction

Биологические исследователи, как правило, были вынуждены делать тонкие секции и выполнять наблюдения с помощью световой или электронной микроскопии для того, чтобы исследовать внутренние структуры непрозрачных организмов. Однако эти методы являются разрушительными и проблематичными при применении к редким или ценным особям. Кроме того, несколько этапов в методе, таких как встраивание и секция, отнимают много времени, и это может занять несколько дней, чтобы наблюдать образец, в зависимости от протокола. Кроме того, при обработке многочисленных секций всегда есть возможность повреждения или потери некоторых секций. Техника очистки тканей доступнадля некоторых образцов 1,2,3,4,5, но еще не применимы для многих видов животных.

Чтобы преодолеть эти проблемы, некоторые биологи начали использовать микрофокус рентгеновскойкомпьютерной томографии (микроКТ) изображений 6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15. В рентгеновской КТ, образец облучается рентгеновскими лучами с различных углов, которые генерируются из рентгеновского источника, движущегося вокруг образца, и передаваемые рентгеновские лучи контролируются детектором, который также движется вокруг образца. Полученные данные о передаче рентгеновских лучей анализируются для восстановления поперечных изображений образца. Этот метод позволяет наблюдать внутренние структуры без разрушения образца. Из-за своей безопасности и легкости, он широко используется в медицинских и стоматологических приложений, и КТ системы могут быть найдены в больницах и стоматологических центрах по всему миру. Кроме того, промышленный рентгеновский КТ часто используется для наблюдения за немедицинскими образцами для осмотра и метрологии в промышленной сфере. В отличие от медицинской КТ, при которой рентгеновский источник и детекторы подвижны, две части фиксируются в промышленной КТ, при этом образец вращается во время сканирования. Промышленный КТ обычно производит изображения с более высоким разрешением, чем медицинский КТ, и называется микроКТ (разрешение уровня микрометра) или nanoCT (разрешение уровня нанометра). В последнее время исследования с использованием микроCT быстро увеличилось в различных областях биологии14,15,16,17,18,19, 20 , 21 год , 22 Г. , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 год , 31 год , 32 год , 33 , 34.

Биологические исследования с использованием КТ первоначально целевых внутренних структур, которые в основном состоят из твердых тканей, таких как кости. Достижения в области методов окрашивания с использованием различных химических агентов позволили визуализировать мягкие ткани в различных организмах6,7,8,9,14,15 , 16 Год , 17 Лет , 18 лет , 19 лет , 20 , 21 год , 22 Г. , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 год , 31 год , 32 год , 33 , 34. Из этих реагентов контрастные агенты на основе йода относительно безопасны, недороги и могут быть использованы для визуализации мягких тканей в различных организмах7,14. Что касается морских беспозвоночных, микрокт широко используется на таких животных, как моллюски6,25,32,33, annelids18,19, 20 , 28, и тортоподы21,23,29,31. Тем не менее, было несколько сообщений о других животных phyla, таких как bryozoans6, xenacoelomorphs26, и книдарий24,30. В целом, было меньше исследований с использованием микроКТ на морских беспозвоночных, чем на позвоночных. Одной из основных причин такого ограниченного использования морских беспозвоночных является огромное разнообразие, наблюдаемое у этих животных. Из-за своих разнообразных размеров, морфологии и физиологии, каждый вид по-разному реагирует на различные экспериментальные процедуры. Поэтому при подготовке к образу отбора крайне важно выбрать наиболее подходящую фиксацию и окрашивающий реагент, а также установить условия на каждом шагу, скорректированные для каждого вида. Аналогичным образом, необходимо также установить конфигурации сканирования, такие как метод монтажа, напряжение, текущая, механическая скорость увеличения и мощность разрешения пространства, соответствующая для каждого образца. Для решения этой проблемы необходимо простое и понятное руководство, которое охватывает все необходимые шаги, объясняет, как каждый шаг может быть скорректирован в зависимости от образца, и показывает подробные примеры из нескольких образцов.

В настоящем исследовании мы описываем протокол микрокт-изображения шаг за шагом, от фиксации образцов до анализа данных с использованием трех видов морских беспозвоночных. Образцы морского анемона Actinia equina (Антхозоа, Книдария) были собраны вблизи морской биологической станции Мисаки, Токийский университет. У них было сферическое, мягкое тело диаметром около 2 см(рисунок 1A-C). Вблизи морской биологической станции Мисаки были также собраны образцы Harmothoe sp. (Polychaeta, Annelida). Они были стройные черви, которые были около 1,5 см в длину, с жесткими chaetae настоящее время вдоль всего тела (Рисунок 1D). Образец Xenoturbella japonica35 (Xenoturbellida, Xenacoelomorpha) был собран вблизи морского исследовательского центра Симода, Университет Цукуба, во время 13-го совместного обследования прибрежных организмов JAMBIO. Это был мягкотелый червь длиной около 0,8 см(рисунок 1E). Подробно разъясняются корректировки условий и конфигураций каждого образца. Наше исследование содержит несколько предложений о том, как выполнять микрокт изображения морских беспозвоночных, и мы надеемся, что это вдохновит биологов использовать этот протокол для своих исследований.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Фиксация

  1. Для Эквинии Actinia,расслабьте животных в 10% морской воды MgCl2 в течение примерно 15 минут при комнатной температуре. Перенесите на 70% этанол и храните при комнатной температуре.
  2. Для Harmothoe sp., анестезирует животных, поместив их в ледяную морскую воду в течение примерно 15 мин. Передача до 10% (v/v) формалина раствора с морской водой и хранить при комнатной температуре.
  3. Для Xenoturbella japonica,расслабьте животное, используя 7% MgCl2 в пресной воде. Исправить в 4% параформальдегида (PFA) в фильтрообразуемых морской воды на ночь. Поместите в 70% этанола и хранить при 4 градусах Цельсия.
    ВНИМАНИЕ: PFA является опасным и должны быть обработаны с осторожностью.

2. Окрашивание

  1. Перенесите образцы на 50% этанола и храните при комнатной температуре 15 ч. Замените 50% этанола на 25% этанола и храните при комнатной температуре 2 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это не обязательно для Harmothoe sp. образца в 10% (v/v) формуляциновый раствор с морской водой.
  2. Замените раствор дистиллированной водой (DW) и храните образцы в DW при комнатной температуре в течение 2 ч. Повторите этот шаг три раза.
  3. Приготовьте 25% раствор Lugol, разбавив бульонный раствор (ниже) до 25% с Помощью DW. Фондовый раствор (100% Люгольский раствор) содержит 10 г KI и 5 г I2,с поправкой на 100 мл с DW.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор Lugol является светочувствительным, поэтому храните и обрабатываем решение, защищенное от света. Соблюдайте правила каждой страны и учреждения по обращению с йодом и утилизации отходов.
  4. Декант DW из образцов и влить в 25% Раствор Луголя. Пятно на 24 ч при комнатной температуре.

3. Сценический монтаж

  1. Подготовка 0,5% агарозы путем растворения 500 мг агарозы в 100 мл DW в 250 мл конической колбы в микроволновой печи (800 Вт, около 1-3 мин). Охладите до 30-40 градусов по Цельсию, сохраняя при комнатной температуре.
    ВНИМАНИЕ: Не перегревайте и не запечатывайте колбу при нагревании, чтобы агароза не закипела.
  2. Монтируй большие образцы, такие как A. equina, используя трубку 50 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте 50 мл труб для монтажа больших образцов, которые не вписываются в 1000 микропайпет "синий" наконечник.
    1. Поместите окрашенные образца в 60-мм блюдо с DW, чтобы смыть чрезмерное окрашивающее раствор с поверхности.
    2. Аккуратно залить 5 мл 0,5% агарозы в трубку 50 мл и затвердеть агарозу на льду. Будьте осторожны, чтобы не сделать пузыри в агарозе.
    3. Аккуратно добавьте 20 мл 0,5% агарозы в трубку 50 мл и поместите на лед, пока агароза не начнет затвердевать. Поместите образец в пределах 0,5% агарозы с помощью щипков. Будьте осторожны, чтобы не сделать пузыри в агарозе.
    4. Отрегулируйте положение и ориентацию образца с помощью щипков и затвердейте агарозу на льду.
    5. Поместите глину на сцену установки microCT и установите трубку 50 мл на глину(рисунок 2А).
  3. Смонтировать небольшие образцы, такие как Harmothoe sp. и X. japonica, используя микропипет (синий) наконечник микропайпета в 1000 л.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для небольших образцов можно использовать 200 микропайпетов «желтый» наконечник. В этом случае используйте 30 кл.л агарозы для штепсельной вилки и добавьте 200 л агарозы или дистиллированной воды.
    1. Нарисуйте 100 л 0,5% агарозы в 1000 мл микропайпета 'голубой' наконечник и затвердеть агарозы, удерживая наконечник над льдом, делая вилку в кончике (Рисунок 2B-a).
    2. Декант окрашенных образца в 60-мм блюдо без использования щипки.
    3. Аккуратно перенесите образец с помощью кольца пинцетом в другую 60-мм тарелку с DW, чтобы смыть с поверхности чрезмерное окрашивающее раствор.
    4. Добавьте 1000 л агарозы или DW в подключенный наконечник (шаг 3.3.1) с помощью микропипети.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Использование 0,5% агарозы рекомендуется, но использовать DW для хрупких или драгоценных образцов, в которых агарозы следует избегать.
    5. Аккуратно перенесите образец из 60-мм блюда в агарозу или DW в подключенном наконечнике с помощью ринг-пинцета.
    6. Аккуратно отрегулируйте положение и ориентацию образца с помощью петилатной иглы или точного пинцета. Будьте осторожны, чтобы не сделать пузыри в монтажной среде. Убедитесь, что образец стабилен между стенами наконечника, когда DW используется в качестве монтажа среды(рисунок 2D-b). Поместите кончик на лед, чтобы затвердеть агарозу, если он используется в качестве монтажа среды.
    7. Отрежьте наконечник от нового микропипетика 1000 л 'голубой' наконечник(Рисунок 2B-B,c)и вставьте кончик подключенного наконечника в новый наконечник.
    8. Поместите глину на стадии установки microCT и установить советы с образцом внутри на глине(Рисунок 2C,D).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашивая раствор начнет смывать образец, как только он помещается в DW, так что приступайте к следующему шагу сканирования быстро.

4. Сканирование микроКТ

  1. Включите рентгеновский луч при 80 кВ, 100 КВ.
  2. При наблюдении изображения рентгеновской передачи в центре экрана(рисунок 3A), переместить сцену так, что весь образец можно увидеть, нажав на x и оси кнопки (Рисунок 3A), и вручную регулировка ручки оси Y на монтажной стадии(рисунок 3B). Установите контраст изображения так, чтобы внутренние структуры можно было наблюдать, регулируя условия контраста(Рисунок 3A: Контрастизображения).
  3. Отрегулируйте ориентацию образца, изменив угол трубки/наконечника в глине(рисунок 2A). Поверните этап 90 ", установив ось вращения (Рисунок 3A) до 90 и нажав на кнопку относительного движения (рисунок3A). Выполните один и тот же маневр четыре раза, чтобы завершить полное вращение.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вручную выключать рентгеновский луч каждый раз, когда дверь образца открыта, если система не выключит его автоматически.
  4. Переместите сцену так, чтобы образец находился в центре представления, нажав на кнопку оси (рисунок 3А) и вручную регулировав ручку оси Y на монтажной стадии (рисунок3B). Поверните сцену на 90 градусов и сделайте то же самое. Поверните сцену на 360 градусов и проверьте, находится ли образец в центре обзора со всех сторон.
  5. Переместите сцену вдоль x-оси к источнику рентгеновского луча, нажав на кнопку X оси (Рисунок3A), чтобы увеличить образец и настроить по мере необходимости, чтобы он просто вписывается в вид (Рисунок 3C).
  6. Поверните этап 360 и отрегулируйте по мере необходимости так, чтобы образец соответствовал виду со всех сторон.
  7. Отрегулируйте условия сканирования, как показано в таблице1.
  8. Начало сканирования; это занимает около 10 минут.

5. Реконструкция изображения

  1. Запустите вспомогательное программное обеспечение системы microCT (см. таблицуматериалов) и откройте отсканированные данные.
  2. Отрегулируйте различия в оси вращения образца во время сканирования, нажав на кнопку автоматического расчета значения сдвига(рисунок 4A:зеленый ящик).
  3. Отрегулируйте ориентацию изображения, вращая оранжевые стрелки(рисунок 4B). Если ориентация была изменена, повторите шаг 5.2.
  4. Нажмите на вкладку области(рисунок 4C: пурпурный ящик) и отделки областях, где образцы не присутствуют (Рисунок 4C: желтый ящик).
  5. Нажмите на вкладку перенастройки(Рисунок 4D:пурпурная коробка) и установите фильтры следующим образом, чтобы удалить шум. Артефакт кольца уменьшает фильтр: Медианный фильтр -3; Фильтр устранения шума: Средний фильтр-1.
  6. Выполните перенастройку, нажав на кнопку реконфигурации(рисунок 4D: зеленый ящик).
  7. Отрегулируйте яркость и контрастность изображения, установив черно-белые значения как черное значение 0, белое значение 250(рисунок 4D:синяя коробка).
  8. Сохраните реконструированный набор данных изображений TIFF в виде 8-битного TIFF, нажав на кнопку сохранения. Переименуйте файлы TIFF следующим образом: Дата »образец»разрешение (мкм)-число.tiff.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оригинальные наборы данных microCT из этого исследования доступны в репозитории Figshare, doi:10.6084/m9.figshare.767083736.

6. Анализ данных

  1. Запустите программное обеспечение для анализа данных (см. таблицуматериалов) и позволите импортировать файлы TIFF, нажав на значок базы данных (рисунок5A: пурпурная коробка) и выключив коробку, показанную на рисунке 5B.
  2. Нажмите на значок импорта (рисунок5C:пурпурная коробка), выберите набор данных, сохраненный в разделе 5, и нажмите открытым.
  3. Нажмите на кнопку ссылки на копию (Рисунок5D) для импорта данных.
  4. Отобразите 2D-сечение, нажав на значок 2D-зрителя (рисунок5C: синяя коробка).
  5. Откалибровать набор данных, нажав на вкладку 3D-зрителя (рисунок 5E: пурпурная коробка) и введя значение разрешения при сканировании (которое было 0.018 в этом исследовании -Рисунок 5F).
  6. Нажмите на значок яркости/контрастности (рисунок5E зеленый ящик). Отрегулируйте яркость и контрастность, переместив курсор внутри отображаемого 2D-изображения и изменив уровень окна и ширину окна(рисунок 5G).
  7. Проверьте другие изображения поперечного сечения, перемещая прокрутку(рисунок 5G: коробка).
  8. Измените ориентацию поперечного сечения, нажав на значок ориентации(рисунок 5E: синий ящик) и проверьте изображения на всех направлениях (рисунок5H).
  9. Нажмите на отображаемые изображения и выберите вкладку экспорта для хранения изображений поперечного сечения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Мы провели микрокт-изображение на A. equina (Антхозоа, Книдария), Harmothoe sp. (Polychaeta, Annelida) и X. japonica (Xenoturbellida, Xenacoelomorpha) после окрашивания образцов с 25% раствором Lugol. Окрашивание успешно усилило контраст внутренних структур во всех образцах, что позволило наблюдать за внутренними мягкими тканями(рисунок6). Вместе спрошлыми отчетами 6,7,16,19,22,23,24,25,26 , 28 , 30 год , 31 год , 32 год , 33, это показывает, что микроКТ может быть использован на различных морских беспозвоночных для визуализации их морфологии, в том числе мягких внутренних тканей. Четкие изображения были получены даже с образцом X. japonica, эпидермис которого был сильно поврежден(рисунок 6F,G), показывая, что этот метод применим к хрупким особям с внешним ивнешним повреждением.

Сканирование только области интереса, в отличие от более широкой области, значительно увеличили четкость и разрешение изображения (сравните Рисунок 6F и Рисунок 6G). Тем не менее, один набор данных высокого разрешения целого образца был реконструирован для Harmothoe sp.(рисунок 6C)и X. japonica (рисунок6F) из нескольких сканирований, выполненных на разных (но перекрывающихся) части образца. Швы между каждым сканированием были незаметны в реконструированных изображениях. Наше исследование показывает, что одновыто высокое разрешение изображения могут быть получены с конусообразной микрокт систем. При сканировании большей площади с высоким разрешением, существует меньший риск с видом на небольшие структуры. Еще одним преимуществом является то, что легче найти относительное положение структур, расположенных далеко друг от друга, таких как передние и задние кончики удлиненный аннелид.

Figure 1
Рисунок 1 : Морские беспозвоночные животные наблюдаются в этом исследовании. (A-C) Актиния эквина (Антозоа, Книдария). (A) Дистальный конец живого животного расслабленным в 10% MgCl2 морской воды. Дисталь (B) и проксимальный (C) заканчивается после фиксации в 70% этанола. (D) Live анестезируется Harmothoe sp. (Polychaeta, Аннелида), дорсальный вид с передней слева. Большинство элитра уже отсутствовали на данном этапе, и только четыре остались вблизи заднего конца. (E) Xenoturbella japonica (Xenoturbellida, Xenacoelomorpha) зафиксировано в 70% этанола. Правый вид, с передней к вершине. Из-за обстоятельств при сборе, его эпидермис начал отрываться. Шкала баров 3 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2 : Монтаж образцов на микрофокусе рентгеновской компьютерной томографии. (A) Монтаж образцов в 50 мл трубки с использованием глины. Ориентация образца может быть скорректирована с помощью глины. (B) Подготовка 1000 микропайпет "синий" наконечник для монтажа небольших образцов. a: Совет с его концом подключен с 100 л 0,5% агарозы (диагональные линии). Образцы были помещены в этот наконечник. Наконечник с образцом был вставлен в другой 1000 микропайпет "синий" наконечник (b, c) для монтажа. b был использован для Xenoturbella japonica, и c был использован для Harmothoe sp. (C) Консед X. japonica образец, обзор (слева) и крупным планом (справа). Рентгеновский источник можно увидеть справа от образца. (D) Диаграммы для монтажа образцов в 1000 микропайпет "синий" наконечник. a: X. japonica образец в дистиллированной воде. b: образец был в контакте со стенкой наконечника (стрелки), так что он не двигается во время сканирования. c: Harmothoe sp. образец в 0,5% агарозы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3 : Сканирование образцов на микрофокусе рентгеновской компьютерной томографии. (A) Операционный экран во время сканирования микрофокуса рентгеновской компьютерной томографии системы, показывающие рентгеновское изображение передачи образца эквины Актиния. Отрегулируйте контраст ность и яркость с помощью «Контрастизображения» в левом нижнем нижнем. (B) Вид на монтажной стадии, показывающей ручку оси Y. (C) Рентгеновское изображение передачи образца A. equina после того, как монтажная стадия была перенесена ближе к источнику рентгеновского луча. Обратите внимание, что он увеличивается по сравнению с изображением в центре (A). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4 : Операционный экран системы реконструкцииизображения. (A) Экран для регулировки различий в оси вращения образца во время сканирования, показывая образец эквинии Actinia. Magenta поле: сдвиг вкладке; зеленая коробка: автоматическая кнопка расчета значения сдвига. (B) Экран для регулировки ориентации изображения, с Harmothoe sp. показано. (C) Экран во время реконструкции изображения A. equina, обрезки области за пределами желтого окна, где нет образцов присутствуют. Magenta поле: площадь вкладки. (D) Экран во время реконструкции изображения, показывая реконструированное изображение A. equina. Magenta поле: перенастройка вкладке; зеленая коробка: кнопка реконфигурации; синий ящик: черно-белая регулировка значения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5 : Операционный экран системы анализа изображений. (A) Окно предпочтений. Значок базы данных (magenta circle) был нажат, чтобы открыть окно управления файлами базы данных. (B) Окно управления файлами базы данных. В этом программном обеспечении, поле показано со стрелой должна быть выключена, чтобы включить импорт файлов TIFF. (C) Меню и панели инструментов экрана базы данных. Magenta коробка и значок импорта; синяя коробка - значок 2D-зрителя. (D) Окно импорта набора данных. Magenta круг и кнопка копирования ссылок. (E) Меню и инструмент баров 2D экран просмотра. Magenta поле 3D вкладка зрителя; зеленая коробка - яркость/контрастный значок; синий значок коробки и ориентации. (F) Окно настройки калибровки. Введите желаемые значения разрешения в столбцах в пурпурном поле. (G) Поперечное сечение образца эквины Actinia отображается в 2D окно зрителя для регулировки яркости и контрастности. Magenta поле: прокрутка для проверки других поперечных сечений. (H) Поперечное сечение A. equina отображается в 2D окно зрителя с другой ориентацией на (G). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 6
Рисунок 6 : Отсканированные и реконструированные изображения морских беспозвоночных. (A) Поперечные и (B) продольные разделы эквинии Актиния . Область внутри пунктирной желтой коробке в (B) увеличена в вставке. Аббревиаты: дм, пара директивных месэнтеци; м, пара совершенных mesenteries; mf, мезенциальная нить; р, фаринкс; си, сифогоглифы; t, щупальце; стрелки, устный диск; белые наконечники стрел, педаль диска; черные наконечники стрел, мышцы сфинктера. Шкала баров в A, B 3 мм. (C-E) Harmothoe sp. (C) Стрельца секции передней части. (D, E) Поперечная секция на пунктирных линиях d и e in (C). Аббревиатуры: aci и ацикулум; ацим и ацикулярная мышца; coe и coelom; dlm - дорсальная продольная мышца; elp и элитрофор; глаз и глаз; инт и кишечник; челюсть и челюсть; мант - медианная антенна; мо и рот; mp - мышцы хоботка; пальп и пальп; фа и фаринкс; prob и хоботок; vlm - вентральная продольная мышца; vnc и брюшной нервный шнур. Шкала баров: C 1 мм; D, E 0,3 мм. (F, G) Xenoturbella japonica. (F) Сагиттальная секция всего образца. (G) Сагиттальная секция передней части. бла-базальная ламина; инт и кишечник; мл и мышечный слой; мо и рот; nn - интраэпидермальная нервная сеть; белая стрелка и статоксист; черная стрелка и лобная пора; белые наконечники стрел - брюшная железная сеть; черные наконечники стрел и ооциты. Шкала баров: F 1 мм, G й 0,5 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Table 1
Таблица 1: Протокол подготовки и сканирования образцов для каждого образца.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Фиксatives использованием формалина, таких как 10% (v/v) формалин решение в морской воде, используемой в этом исследовании, как известно, сохранить морфологию различных морских беспозвоночных и часто используются для микроct-изображений18,24,25 ,26,28,30,33. Однако в последние годы в некоторых странах ограничения на применение этого химического вещества стали строгими, и могут использоваться такие заменители, как параформальдегид или глютаральдегид. Если есть планы по извлечению ДНК после сканирования, то лучше избегать использования формалина в качестве фиксатора, так как известно, что она фрагментирует ДНК. В этом случае рекомендуется использовать фиксаторы, которые сохраняют ДНК, такие как 70% этанола. В этом исследовании, книдарий A. equina был исправлен с помощью 70% этанола, и четкие микро-изображения были получены из 70% этанола фиксированных образцов(Рисунок 6A, B).

В предыдущем исследовании, которое выполнило микрокТ сканирование различных книдарных таксонов, многие образцы были обезвожены в 100% этанола, а некоторые из них были критически-точка сушеные до сканирования24. Хотя мягкие внутренние органы, такие как щупальца кластеров, мышц и гонад ы были успешно наблюдались в их исследовании, обезвоживание и процессы сушки, как известно, приводит к крупным артефактов, таких как деформация и сокращение мягких тканей11 , 21. В настоящем исследовании, мы смогли наблюдать внутренние структуры книдарии A. equina фиксированной в 70% этанола и окрашенных с 25% Люголь раствор (Рисунок6A,B). Наш протокол, без каких-либо мер обезвоживания или сушки, является предпочтительным, и должен быть выполнен по возможности, чтобы уменьшить риск повреждения образцов и артефактов во время сканирования.

Люгольраствор, йодный раствор и фосхотунгстовая кислота (ПТА) являются окрашивающими растворами, которые часто используются на биологических образцах в микрокт-изображении6,7,9,14,16, 17,20,26,27,38. Из нашего опыта использования различных биологических образцов, Lugol решение обеспечило лучшие результаты для многих образцов, с темным окрашиванием в относительно короткий промежуток времени. Раствор йода давал только очень слабые пятна, и PTA требовало длиннее время для достаточного окрашивания и запятнанные образцы показали сильные сокращения. Таким образом, все образцы были окрашены раствором Луголя в этом исследовании. Однако, хотя раствор Lugol рекомендуется, соответствующее решение окрашивания отличается между образцами, и мы предлагаем, чтобы испытания с использованием других растворов окрашивания были выполнены, если есть достаточно образцов. Независимо от окрашивая разрешения, образцы делать контракт во время окрашивания37,38, поэтому важно, чтобы держать время окрашивания коротким.

Важным шагом в микрокванет-сканировании является монтаж образца, с тем чтобы предотвратить его перемещение. В этом исследовании, это было выполнено в два этапа, сначала с использованием агарозы в качестве прямого монтажа среды, а затем с помощью глины для установки трубки, которые содержали образец на сцену. Для первого шага, различные низкой плотности монтажа средств были использованы в предыдущих исследованиях, в том числе этанол6,17,20,25,30, агароуз9,29 , и цветочная пена15,22,31. Agarose был выбран в этом исследовании, как это недорогое химическое вещество, которое доступно во всем мире. Недостатком агарозы является то, что это может быть трудно получить образец из закаленной агарозы после сканирования, но с помощью низкоплавленного точки агарозы делает этот шаг поиска легче. Для второго шага, челюсти зажимыили винты часто используются 6,9,17. Глина была выбрана в этом исследовании, поскольку она позволяет тонкой корректировки в ориентации и угол образца. Осторожность необходима для экспериментов с длительным временем сканирования, так как возможность перемещения образца выше при использовании глины, а не челюсти зажимы или винты.

Предыдущее исследование проводилось микрокТ сканирование на семь видов полихетов с длиной тела 2-8 мм, меньше, чем Harmothoe sp. используется в этом исследовании16. Они были в состоянии генерировать изображения высокого разрешения, и показали органов, таких как сосудистые системы и отдельные хета яснее, чем в настоящем исследовании. Основной причиной этого различия был не протокол, а спецификации используемых систем микроКТ. Система, использоваваемые в предыдущем исследовании, была оснащена 11-мегапиксельной камерой устройства с зарядом (4000 x 2672 пикселей) с максимальным разрешением 0,8 мкм/пиксель16. Активный размер матрицы изображения системы, используемой в данном исследовании, составил 992 х 992 пикселя, с максимальным разрешением 5 мкм/пиксель. Таким образом, пространственное разрешение системы микроКТ, используемой в данном исследовании, уступало высокопроизводительной системе микрокТ, используемой в Faulwetter et al.16. Эта разница была особенно заметна при сканировании образцов меньше 8 мм, в которых мы испытывали недостаток разрешения (данные не показаны). Однако, поскольку в ходе сканирования в данном исследовании было получено меньше данных, время сканирования было намного короче, чем в предыдущем исследовании16 (данные: 992 x 992 и 4000 x 2672 пикселей соответственно; время сканирования: от 10 до 26 мин и от 30 мин до нескольких часов, соответственно). Короткое время сканирования уменьшает обесцвечивание окрашивания йода, что позволяет использовать раствор Lugol, который является хорошим окрашивающим раствором с высокой скоростью проникновения, но легко рассеивается в DW34. Короткое время сканирования также уменьшает возможность перемещения образца во время сканирования, что позволило использовать простой метод монтажа с использованием агарозы или DW (Рисунок 2). Более длительное время сканирования также имеет недостаток возможного размытия усадки образца в изображениях. Несколько других механических и аппаратных проблем, которые могут возникнуть во время длительного сканирования также были зарегистрированы39. Поэтому при использовании микрокт-систем важно точно понимать спецификацию каждой системы и выбирать правильную систему с точки зрения размера образца или цели исследования. В некоторых случаях может быть достаточно микрокТ-системы с низким разрешением.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Мы хотели бы поблагодарить Тосихико Шириси за помощь и за предоставление исследовательской среды в ходе этого исследования. Мы благодарны Кенсукэ Янаги и Такато Идзуми за советы по A. equina, и Масаацу Танака за советом по Harmothoe sp. образца. Мы хотели бы поблагодарить сотрудников Морского исследовательского центра Симода, Университета Цукуба и морской биологической станции Мисаки, Токийского университета, за помощь в сборе проб. Мы хотели бы поблагодарить Editage (www.editage.jp) за редактирование английского языка. Эта работа была поддержана Грантом JSPS для молодых ученых (A) (JP26711022) для HN и JAMBIO, Японской ассоциацией морской биологии.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
250-ml Erlenmeyer flask Corning CLS430183
5-ml Sampling tube ST-500 BIO-BIK 103010
50-ml Polypropylene tube Greiner Bio One International 227261
60-mm Non-treated Dish IWAKI 1010-060
Agarose Promega V3125
Ecological grade tip (blue) 1000 µl BMBio BIO1000RF
Ethanol Wako Pure Chemical Industries 057-00451
Formalin Wako Pure Chemical Industries 061-00416
Iodine Wako Pure Chemical Industries 094-05421
Magnesium chloride hexahydrate Wako Pure Chemical Industries 135-00165
OsiriX DICOM Viewer Pixmeo SARL OsiriX MD v10.0 https://www.osirix-viewer.com
Paraformaldehyde Wako Pure Chemical Industries 163-25983
Petiolate needle AS ONE 2-013-01
Pipetman P200 Micropipette GILSON F123601
Pipetman P1000 Micropipette GILSON F123602
Potassium iodide Wako Pure Chemical Industries 166-03971
Precision tweezers 5 DUMONT 0302-5-PS
QuickRack MultI fit tip (yellow) 200 ul Sorenson 10660
Razor blades Feather FA-10
Ring tweezers NAPOX A-26
Stereoscopic microscope Leica MZ95
X-ray Micro-CT imaging system Comscantechno ScanXmate-E090S105

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Susaki, E. A., Tainaka, K., Perrin, D., Yukinaga, H., Kuno, A., Ueda, H. R. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
  2. Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23, 137-157 (2016).
  3. Silvestri, L., Costantini, I., Sacconi, L., Pavone, F. S. Clearing of fixed tissue: a review from a microscopist's perspective. Journal of Biomedical Optics. 21, 081205 (2016).
  4. Greenbaum, A., et al. Bone CLARITY: clearing, imaging, and computational analysis of osteoprogenitors within intact bone marrow. Science Translational Medicine. 9, (2017).
  5. Konno, A., Okazaki, S. Aqueous-based tissue clearing in crustaceans. Zoological Letters. 4, 13 (2018).
  6. Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiology. 9, 11 (2009).
  7. Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: a versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).
  8. Degenhardt, K., Wright, A. C., Horng, D., Padmanabhan, A., Epstein, J. A. Rapid 3D phenotyping of cardiovascular development in mouse embryos by micro-CT with iodine staining. Circulation Cardiovascular Imaging. 3 (3), 314-322 (2010).
  9. Metscher, B. D. X-ray microtomographic imaging of intact vertebrate embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 12, 1462-1471 (2011).
  10. Boistel, R., Swoger, J., Kržič, U., Fernandez, V., Gillet, B., Reynaud, E. G. The future of three-dimensional microscopic imaging in marine biology. Marine Ecology. 32, 438-452 (2011).
  11. Mizutani, R., Suzuki, Y. X-ray microtomography in biology. Micron. 43, 104-115 (2012).
  12. Merkle, A. P., Gelb, J. The ascent of 3D X-ray microscopy in the laboratory. Microscopy Today. 21, 10-15 (2013).
  13. Ziegler, A., Menze, B. H. Accelerated acquisition, visualization, and analysis of zooanatomical data. Computation for humanity. Information technology to advance society. Zander, J., Mosterman, P. J. , CRC Press. Boca Raton, USA. 233-260 (2013).
  14. Gignac, P. M., et al. Diffusible iodine-based contrast-enhanced computed tomography (diceCT): an emerging tool for rapid, high-resolution, 3-D imaging of metazoan soft tissues. Journal of Anatomy. 228 (6), 889-909 (2016).
  15. du Plessis, A., Broeckhoven, C., Guelpa, A., le Roux, S. G. Laboratory x-ray micro-computed tomography: a user guideline for biological samples. GigaScience. 6 (6), 1-11 (2017).
  16. Faulwetter, S., Vasileiadou, A., Kouratoras, M., Dailianis, T., Arvanitidis, C. Micro-computed tomography: Introducing new dimensions in taxonomy. ZooKeys. 263, 1-45 (2013).
  17. Staedler, Y. M., Masson, D., Schonenberger, J. Plant tissues in 3D via X-ray tomography: simple contrasting methods allow high resolution imaging. PLoS One. 8 (9), 75295 (2013).
  18. Fernández, R., Kvist, S., Lenihan, J., Giribet, G., Ziegler, A. Sine Systemate Chaos? A Versatile Tool for Earthworm Taxonomy: Non-Destructive Imaging of Freshly Fixed and Museum Specimens Using Micro-Computed Tomography. PLoS One. 9 (5), 96617 (2014).
  19. Paterson, G. L. J., et al. The pros and cons of using micro-computed tomography in gross and microanatomical assessments of polychaetous annelids. Memoirs of Museum Victoria. 71, 237-246 (2014).
  20. Faulwetter, S., Dailianis, T., Vasileiadou, K., Kouratoras, M., Arvanitidis, C. Can micro-CT become an essential tool for the 21st century taxonomist? An evaluation using marine polychaetes. Microscopy and Analysis. 28, 9-11 (2014).
  21. Sombke, A., Lipke, E., Michalik, P., Uhl, G., Harzsch, S. Potential and limitations of X-ray micro-computed tomography in arthropod neuroanatomy: a methodological and comparative survey. Journal of Comparative Neurology. 523, 1281-1295 (2015).
  22. Landschoff, J., Plessis, A., Griffiths, C. L. A dataset describing brooding in three species of South African brittle stars, comprising seven high-resolution, micro X-ray computed tomography scans. GigaScience. 4 (1), 52 (2015).
  23. Keiler, J., Richter, S., Wirkner, C. S. The anatomy of the king crab Hapalogaster mertensii Brandt, 1850 (Anomura: Paguroidea: Hapalogastridae) - new insights into the evolutionary transformation of hermit crabs into king crabs. Contributions to Zoology. 84 (2), 149-165 (2015).
  24. Holst, S., Michalik, P., Noske, M., Krieger, J., Sötje, I. Potential of X-ray micro-computed tomography for soft-bodied and gelatinous cnidarians with emphasis on scyphozoan and cubozoan statoliths. Journal of Plankton Research. 38, 1225-1242 (2016).
  25. Moles, J., Wägele, H., Ballesteros, M., Pujals, Á, Uhl, G., Avila, C. The End of the Cold Loneliness: 3D Comparison between Doto antarctica and a New Sympatric Species of Doto (Heterobranchia: Nudibranchia). PLoS One. 11 (7), 0157941 (2016).
  26. Nakano, H., et al. A new species of Xenoturbella from the western Pacific Ocean and the evolution of Xenoturbella. BMC Evolutionary Biology. 17, 245 (2017).
  27. Tsuda, K., et al. KNOTTED1 Cofactors, BLH12 and BLH14, Regulate Internode Patterning and Vein Anastomosis in Maize. Plant Cell. 29 (5), 1105-1118 (2017).
  28. Parapar, J., Candás, M., Cunha-Veira, X., Moreira, J. Exploring annelid anatomy using micro-computed tomography: A taxonomic approach. Zoologischer Anzeiger. 270, 19-42 (2017).
  29. Akkari, N., Ganske, A. S., Komerički, A., Metscher, B. New avatars for Myriapods: Complete 3D morphology of type specimens transcends conventional species description (Myriapoda, Chilopoda). PLoS One. 13 (7), 0200158 (2018).
  30. Gusmao, L. C., Grajales, A., Rodriguez, E. Sea anemones through X-rays: visualization of two species of Diadumene (Cnidaria, Actiniaria) using micro-CT. American Museum Novitates. 3907, (2018).
  31. Landschoff, J., Komai, T., du Plessis, A., Gouws, G., Griffiths, C. L. MicroCT imaging applied to description of a new species of Pagurus Fabricius, 1775 (Crustacea: Decapoda: Anomura: Paguridae), with selection of three-dimensional type data. PLoS One. 13 (9), 0203107 (2018).
  32. Machado, F. M., Passos, F. D., Giribet, G. The use of micro-computed tomography as a minimally invasive tool for anatomical study of bivalves (Mollusca: Bivalvia). Zoological Journal of the Linnean Society. , (2018).
  33. Sasaki, T., et al. 3D visualization of calcified and non-calcified molluscan tissues using computed tomography. Biomineralization. Endo, K., Kogure, T., Nagasawa, H. , Springer. Singapore. 83-93 (2018).
  34. Maeno, A., Tsuda, K. Micro-computed Tomography to Visualize Vascular Networks in Maize Stems. Bio-protocol. 8 (1), 2682 (2018).
  35. Nakano, H., et al. Correction to: A new species of Xenoturbella from the western Pacific Ocean and the evolution of Xenoturbella. BMC Evolutionary Biology. 18, 83 (2018).
  36. Maeno, A., Kohtsuka, H., Takatani, K., Nakano, H. MicroCT files from 'Microfocus X-ray computed tomography (microCT) imaging of Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida), and Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha)'. figshare. , (2019).
  37. Vickerton, P., Jarvis, J., Jeffery, N. Concentration-dependent specimen shrinkage in iodine-enhanced microCT. Journal of Anatomy. 223 (2), 185-193 (2013).
  38. Buytaert, J., Goyens, J., De Greef, D., Aerts, P., Dirckx, J. Volume shrinkage of bone, brain and muscle tissue in sample preparation for micro-CT and light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Microscopy and Microanalysis. 20 (4), 1208-1217 (2014).
  39. Sasov, A., Liu, X., Salmon, P. L. Compensation of mechanical inaccuracies in micro-CT and nano-CT. Proceedings of SPIE. 7078, 70781 (2008).

Tags

Экологические науки Выпуск 150 microCT Lugol решение йод Актиния Cnidaria Harmothoe Аннелида Xenoturbella Xenacoelomorpha беспозвоночных
Микрофокус рентгеновских КТ (микроКТ) Изображение <em>Эктинии эквины</em> (Cnidaria), <em>Harmothoe</em> sp. (Аннелида), и <em>Xenoturbella japonica</em> (Xenacoelomorpha)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Maeno, A., Kohtsuka, H., Takatani,… More

Maeno, A., Kohtsuka, H., Takatani, K., Nakano, H. Microfocus X-ray CT (microCT) Imaging of Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida), and Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha). J. Vis. Exp. (150), e59161, doi:10.3791/59161 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter