Summary
Aqui, os protocolos para executar a imagem latente do tomography computado do raio X do microfoco (microct) de três animais marinhos do invertebrados são explicados em detalhe. Este estudo descreve etapas tais como a fixação da amostra, a mancha, a montagem, a exploração, a reconstrução da imagem, e as análises de dados. Sugestões sobre como o protocolo pode ser ajustado para diferentes amostras também são fornecidos.
Abstract
Tradicionalmente, os biólogos tiveram que depender de métodos destrutivos, como o corte, a fim de investigar as estruturas internas de organismos opacos. A imagem latente não-destrutiva do tomography computado do raio X do microfoco (microCT) transformou-se um protocolo poderoso e emergente na biologia, devido aos avanços tecnológicos em métodos e nas inovações de coloração da amostra no hardware de microCT, em computadores de processamento, e em dados software de análise. No entanto, este protocolo não é comumente usado, como é nos campos médico e industrial. Uma das razões para esse uso limitado é a falta de um manual simples e compreensível que cubra todas as etapas necessárias: coleta de amostras, fixação, coloração, montagem, digitalização e análise de dados. Outra razão é a grande diversidade de metazoanos, particularmente invertebrados marinhos. Por causa dos diversos tamanhos, morfologias e fisiologias dos invertebrados marinhos, é crucial ajustar as condições experimentais e as configurações de hardware em cada etapa, dependendo da amostra. Aqui, os métodos da imagem latente de microct são explicados em detalhe usando três invertebrates marinhos filogeneticamente diversos: equina da de actinia (Anthozoa, Cnidaria), SP. de harmothoe (Polychaeta, Annelida), e japonica de Xenoturbella ( Xenoturbellida, Xenacoelomorpha). Sugestões sobre a realização de imagens microCT em vários animais também são fornecidos.
Introduction
Pesquisadores biológicos geralmente tiveram que fazer cortes finos e realizar observações por microscopia de luz ou eletrônica, a fim de investigar as estruturas internas de organismos opacos. No entanto, esses métodos são destrutivos e problemáticos quando aplicados a espécimes raros ou valiosos. Além disso, várias etapas no método, como incorporação e corte, são demoradas e pode demorar vários dias para observar uma amostra, dependendo do protocolo. Além disso, ao manusear inúmeras secções, existe sempre a possibilidade de danificar ou perder algumas secções. As técnicas do tecido-esclarecimento estão disponíveis para alguns espécimes1,2,3,4,5 mas não são ainda aplicáveis para muitas espécies animais.
Para superar esses problemas, alguns biólogos começaram a usar a tomografia computadorizada de raios X microfoco (microct) Imaging6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15. Na TC de raios-X, o espécime é irradiado com raios-X de vários ângulos que são gerados a partir de uma fonte de raios-X movendo-se em torno da amostra, e os raios-X transmitidos são monitorados por um detector que também se move em torno da amostra. Os dados de transmissão de raios-X obtidos são analisados para reconstruir imagens transversais do espécime. Este método possibilita a observação de estruturas internas sem destruição da amostra. Por causa de sua segurança e facilidade, é comumente usado em aplicações médicas e odontológicas, e os sistemas de TC podem ser encontrados em hospitais e centros odontológicos em todo o mundo. Além disso, o raio X Industrial CT é usado freqüentemente observando amostras não médicas para a inspeção e a metrologia no campo industrial. Em contraste com a TC médica, na qual a fonte de raios X e os detectores são móveis, as duas partes são fixadas em TC Industrial, com a amostra girando durante a digitalização. A TC Industrial geralmente produz imagens de maior resolução do que a TC médica e é referida como microCT (resolução em nível de micrômetro) ou nanoCT (resolução em nível de nanômetro). Recentemente, a pesquisa usando microct aumentou rapidamente em vários campos da biologia14,15,16,17,18,19, 20 anos de , 21 anos de , 22 anos de , 23 anos de , 24 de cada , 25 anos de , 26 anos de , 27 anos de , 28 anos de , 29. º , 30 anos de , 31 de dezembro , 32 , 33 , 34.
Os estudos biológicos que usam o CT inicialmente alvejou estruturas internas que consistem principalmente no tecido duro, tal como o osso. Avanços nas técnicas de coloração utilizando vários agentes químicos permitiram a visualização de tecidos moles em vários organismos6,7,8,9,14,15 , 16 anos de , 17 anos de , 18 anos de , 19 anos de , 20 anos de , 21 anos de , 22 anos de , 23 anos de , 24 de cada , 25 anos de , 26 anos de , 27 anos de , 28 anos de , 29. º , 30 anos de , 31 de dezembro , 32 , 33 , 34. destes reagentes, os agentes de contraste à base de iodo são relativamente seguros, baratos e podem ser utilizados para a visualização de tecidos moles em vários organismos7,14. No que diz respeito aos invertebrados marinhos, a microtomografia tem sido amplamente utilizada em animais como moluscos6,25,32,33, anípidos18,19, 20 anos de , 28, e arthorópodes21,23,29,31. No entanto, houve poucos relatos sobre outros animais phyla, como briozoários6, xenacoelomorphs26e cnidários24,30. Em geral, houve menos estudos usando microCT em invertebrados marinhos do que aqueles em vertebrados. Uma das principais razões para este uso limitado em invertebrados marinhos é a vasta diversidade observada nestes animais. Por causa de seus diversos tamanhos, morfologias e fisiologias, cada espécie reage diferentemente a diferentes procedimentos experimentais. Portanto, é crucial durante a preparação da amostra escolher o reagente de fixação e coloração mais adequado, e definir as condições em cada etapa, ajustadas para cada espécie. Da mesma forma, também é necessário definir as configurações de digitalização, como o método de montagem, tensão, corrente, taxa de ampliação mecânica e o poder de resolução de espaço, apropriadamente para cada amostra. Para superar esse problema, um manual simples e compreensível que abrange todas as etapas necessárias, explica como cada etapa pode ser ajustada dependendo da amostra, e mostra exemplos detalhados de várias amostras é essencial.
No presente estudo, descrevemos o protocolo de imagem microCT passo a passo, desde a fixação da amostra até a análise dos dados, utilizando-se três espécies de invertebrados marinhos. Os espécimes da Anemone de mar Actinia equina da (Anthozoa, Cnidaria) foram recolhidos perto da Estação Biológica Marinha de Misaki, Universidade de Tokyo. Eles tinham um corpo esférico e macio que tinha cerca de 2 cm de diâmetro (Figura 1a-C). As amostras de Harmothoe SP. (Polychaeta, Annelida) também foram coletadas perto da Estação Biológica Marinha Misaki. Eram vermes finos que tinham cerca de 1,5 cm de comprimento, com cerdas resistentes presentes ao longo de todo o corpo (Figura 1D). Um espécime Xenoturbella japonica35 (Xenoturbellida, Xenacoelomorpha) foi coletado perto do Shimoda Marine Research Center, da Universidade de Tsukuba, durante a 13ª pesquisa conjunta do organismo costeiro jambio. Era um verme macio-encorpado que tinha cerca de 0,8 cm de comprimento (Figura 1e). Os ajustes feitos para as condições e as configurações de cada amostra são explicados em detalhe. Nosso estudo fornece várias sugestões sobre como executar a imagem microCT em invertebrados marinhos, e esperamos que ele inspire os biólogos a utilizar este protocolo para sua pesquisa.
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Protocol
1. fixação
- Para Actinia equina da, relaxe os animais em 10% MgCl2 água do mar por cerca de 15 min à temperatura ambiente. Transfira para 70% etanol e armazene à temperatura ambiente.
- Para Harmothoe SP., anestesiar os animais, colocando-os em água do mar gelada por cerca de 15 min. transferência para 10% (v/v) solução de formalina com água do mar e armazenar à temperatura ambiente.
- Para Xenoturbella japonica, relaxe o animal usando 7% MgCl2 em água doce. Correção em 4% paraformaldeído (PFA) em água do mar filtrada durante a noite. Coloque em 70% de etanol e armazene a 4 ° c.
PRECAUÇÃO: o PFA é perigoso e deve ser manuseado com cuidado.
2. coloração
- Transfira as amostras para 50% de etanol e armazene à temperatura ambiente por 15 h. Substitua o etanol de 50% com etanol a 25% e armazene à temperatura ambiente por 2 h.
Nota: isto não é necessário para a amostra de Harmothoe SP. em solução de formalina a 10% (v/v) com água do mar. - Substitua a solução por água destilada (DW) e guarde as amostras em DW à temperatura ambiente durante 2 h. Repita este passo três vezes.
- Prepare 25% de solução de Lugol diluindo a solução de ações (abaixo) para 25% com DW. Solução de estoque (100% solução Lugol) contém 10 g de KI e 5 g de I2, ajustado para 100 ml com DW.
Nota: a solução Lugol é sensível à luz, para armazenar e manusear a solução protegida da luz. Siga os regulamentos de cada país e instituição para manuseio de iodo e descarte de resíduos. - Decantar o DW das amostras e despeje a solução de Lugol de 25%. Mancha para 24 h em temperatura ambiente.
3. montagem do estágio
- Prepare 0,5% de agarose dissolvendo 500 mg de agarose em 100 mL de DW em um balão cônico de 250 mL em um microondas (800 W, cerca de 1-3 min). Esfrie a aproximadamente 30-40 ° c mantendo na temperatura ambiente.
Cuidado: não sobreaqueça ou sele completamente o balão quando aquecer para impedir que o agarose ferve sobre. - Monte grandes amostras como a. equina da usando um tubo de 50 ml.
Nota: Utilize tubos de 50 mL para montar amostras grandes que não se encaixem numa ponteira de 1.000 μL de micropipeta "azul".- Coloque a amostra manchada em um prato de 60 mm com DW para lavar a solução de coloração excessiva da superfície.
- Despeje delicadamente 5 mL de agarose de 0,5% em um tubo de 50 mL e endureça o agarose no gelo. Tenha cuidado para não fazer bolhas no agarose.
- Adicione suavemente 20 mL de agarose de 0,5% ao tubo de 50 mL e coloque no gelo até que o agarose comece a endurecer. Coloc o espécime dentro do agarose de 0,5% usando o fórceps. Tenha cuidado para não fazer bolhas no agarose.
- Ajustar a posição e orientação da amostra com fórceps e endurecer o agarose no gelo.
- Coloque a argila no estágio de montagem do microCT e ajuste o tubo de 50 mL na argila (Figura 2a).
- Monte pequenas amostras como Harmothoe SP. e X. japonica usando uma ponta de 1.000 μl de micropipeta ' Blue '.
Nota: para amostras menores, 200 μL de micropipeta ' amarela ' pode ser usada. Neste caso, utilize 30 μL de agarose para a ficha e adicione 200 μL de agarose ou água destilada.- Elaborar 100 μL de agarose de 0,5% numa ponta de 1.000 μL de micropipeta "azul" e endurecer o agarose segurando a ponta sobre o gelo, fazendo uma ficha na ponta (Figura 2B-a).
- Decantar a amostra manchada em um prato de 60 mm sem usar fórceps.
- Transfira delicadamente a amostra usando pinças do anel em um outro prato 60-mm com DW para lavar fora a solução de mancha excessiva da superfície.
- Adicionar 1.000 μL de agarose 0,5% ou DW na ponta plugada (passo 3.3.1) usando uma micropipeta.
Nota: o uso de 0,5% de agarose é recomendado, mas use DW para amostras frágeis ou preciosas em que o agarose deve ser evitado. - Transfira delicadamente a amostra do prato de 60 milímetros no agarose ou no DW na ponta obstruída usando as pinças do anel.
- Ajuste suavemente a posição e a orientação da amostra com uma agulha petiolada ou pinças de precisão. Tenha cuidado para não fazer bolhas no meio de montagem. Certifique-se de que a amostra é estável entre as paredes da ponta quando DW é usado como meio de montagem (Figura 2D-b). Coloc a ponta no gelo para endurecer o agarose se é usado como o meio de montagem.
- Corte a ponta de uma nova ponta de 1.000 μL de micropipeta "azul" (Figura 2b-b, c) e insira a ponta da ponta plugada na nova ponta.
- Coloque a argila no estágio de montagem do microCT e defina as pontas com a amostra dentro da argila (Figura 2C, D).
Nota: a solução de coloração vai começar a lavar a amostra uma vez que é colocado em DW, Então prossiga para a próxima etapa de digitalização prontamente.
4. digitalização MicroCT
- Ligue o feixe de raios-X a 80 kV, 100 μA.
- Enquanto observa a imagem de transmissão de raios-X no centro da tela (Figura 3a),mova o palco para que toda a amostra possa ser vista clicando nos botões do eixo x e Z (Figura 3a) e manualmente ajustar o manípulo do eixo Y na fase de montagem (Figura 3B). Defina o contraste da imagem para que as estruturas internas possam ser observadas ajustando as condições de contraste (Figura 3a: contraste de imagem).
- Ajuste a orientação da amostra alterando o ângulo do tubo/ponta na argila (Figura 2a). Gire o estágio 90 ° definindo o eixo de rotação (Figura 3a) para90 e clicando no botão de movimento relativo (Figura 3a). Realize a mesma manobra quatro vezes para completar uma rotação completa.
Nota: desligue manualmente o feixe de raios-X cada vez que a porta da amostra é aberta, a menos que o sistema desliga-lo automaticamente. - Mova o palco para que a amostra esteja no centro da vista clicando no botão do eixo Z (Figura 3a) e ajustando manualmente o botão do eixo Y na fase de montagem (Figura 3B). Gire o palco por 90 ° e faça o mesmo. Gire o estágio 360 ° e verifique se a amostra está no centro da vista de todas as direções.
- Mova o palco ao longo do eixo x para a fonte de raio X clicando no botão do eixo x (Figura 3a) paraampliar a amostra e ajustar conforme necessário para que ele apenas se encaixe na vista (Figura 3C).
- Gire o estágio 360 ° e ajuste-o como necessário de modo que a amostra caiba dentro da vista de todas as direções.
- Ajuste as condições de digitalização, conforme mostrado na tabela 1.
- Iniciar a digitalização; demora cerca de 10 min.
5. reconstrução da imagem
- Inicie o software acessório do sistema microCT (consulte a tabela de materiais) e abra os dados digitalizados.
- Ajuste as diferenças no eixo de rotação da amostra durante a digitalização clicando no botão de cálculo do valor de deslocamento automático (Figura 4A: caixa verde).
- Ajuste a orientação da imagem girando as setas laranja (Figura 4B). Se a orientação foi alterada, repita a etapa 5,2.
- Clique na guia área (Figura 4c: caixa magenta) e aparar áreas onde as amostras não estão presentes (Figura 4c: caixa amarela).
- Clique na guia de reconfiguração (Figura 4D: caixa magenta) e defina os filtros da seguinte forma para remover o ruído. Artefato de anel reduzir filtro: filtro mediano-3; Filtro de eliminação de ruído: Average Filter-1.
- Execute a reconfiguração clicando no botão de reconfiguração (Figura 4D: caixa verde).
- Ajuste o brilho e o contraste da imagem definindo os valores preto e branco como valor preto 0, valor branco 250 (Figura 4D: caixa azul).
- Salve o conjunto de dados de imagem TIFF reconstruído como um TIFF de 8 bits clicando no botão salvar. Renomeie arquivos TIFF da seguinte forma: Date_sample_resolution (μm) _ Number. TIFF.
Nota: os conjuntos de dados originais do microCT deste estudo estão disponíveis no repositório Figshare, doi: 10.6084/M9. figshare. 767083736.
6. análise de dados
- Inicie o software de análise de dados (consulte a tabela de materiais) e ative a importação de arquivos TIFF clicando no ícone do banco de dados (Figura 5a: caixa magenta) e desativando a caixa mostrada na Figura 5B.
- Clique no ícone de importação (Figura 5C: caixa magenta), selecione o conjunto de dados salvo na seção 5 e clique em abrir.
- Clique no botão copiar vínculos (Figura 5D) para importar os dados.
- Exiba a seção transversal 2D clicando no ícone do Visualizador 2D (Figura 5C: Blue Box).
- Calibrar o conjunto de dados clicando na guia visualizador 3D (Figura 5e: caixa magenta) e inserindo o valor de resolução na digitalização (que foi 0, 18 neste estudo [Figura 5F]).
- Clique no ícone de brilho/contraste (Figura 5E caixa verde). Ajuste o brilho e o contraste movendo o cursor para dentro da imagem 2D exibida e alterando o nível da janela e a largura da janela (Figura 5G).
- Verifique outras imagens de seção transversal movendo a barra de rolagem (Figura 5G: caixa).
- Altere a orientação da seção transversal clicando no ícone de orientação (Figura 5e: caixa azul) e verifique as imagens em todas as orientações (Figura 5H).
- Clique na imagem exibida e escolha a guia exportar para armazenar imagens de seção cruzada.
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Representative Results
Nós executamos a imagem latente de microCT em a . equina da (Anthozoa, Cnidaria), SP. de Harmothoe (Polychaeta, Annelida), e X. japonica (Xenoturbellida, xenacoelomorpha) após ter manchar as amostras com a solução de Lugol de 25%. A coloração melhorou com sucesso o contraste das estruturas internas em todos os espécimes, possibilitando observações de tecidos moles internos (Figura 6). Juntamente com os relatórios passados6,7,16,19,22,23,24,25,26 , 28 anos de , 30 anos de , 31 de dezembro , 32 , 33, isto mostra que o microct pode ser usado em vários invertebrados marinhos para visualizar sua morfologia, incluindo tecidos internos macios. As imagens claras foram obtidas mesmo com o espécime de X. japonica , cuja a epiderme foi danificada mal (Figura 6F, G), mostrando que este método é aplicável aos espécimes frágeis com dano externo.
A digitalização apenas da região de interesse, em contraste com uma área mais ampla, aumentou consideravelmente a clareza e a resolução da imagem (compare a Figura 6F e a Figura 6G). No entanto, um único conjunto de dados de alta resolução de um espécime inteiro foi reconstruído para harmothoe SP. (Figura 6C) e X. japonica (Figura 6F) de várias varreduras executadas em diferentes (mas sobrepostas) partes da amostra. As emendas entre cada varredura eram inconspícuo nas imagens reconstruídas. Nosso estudo mostra que as únicas imagens de alta resolução podem ser obtidas com sistemas do microCT do cone-feixe. Ao digitalizar uma área maior em alta resolução, há um menor risco de negligenciando pequenas estruturas. Outra vantagem é que é mais fácil localizar as posições relativas das estruturas que estão situadas distantes, como as pontas anterior e posterior de um ananóide alongado.
Figura 1 : Animais invertebrados marinhos observados neste estudo. (A-C) Actinia equina da (Anthozoa, Cnidaria). (A) extremidade distal de um animal vivo relaxado em 10% MgCl2 água do mar. Extremidades distal (B) e proximal (C) após fixação em etanol a 70%. (D) Live anestesiados harmothoe SP. (Polychaeta, Annelida), vista dorsal com anterior à esquerda. A maioria dos élitros já estavam faltando nesta fase, com apenas quatro restantes perto da extremidade posterior. (E) Xenoturbella japonica (Xenoturbellida, Xenacoelomorpha) fixada em etanol a 70%. Vista direita, com anterior ao topo. Por causa das circunstâncias na coleção, sua epiderme estava começando a sair. Barras de escala = 3 mm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Amostras de montagem no sistema de tomografia computadorizada de raios X microfoco. (A) amostras de montagem em um tubo de 50 ml usando argila. A orientação da amostra pode ser ajustada usando a argila. B) preparação de uma ponta de 1.000 μl de micropipeta "azul" para a montagem de pequenas amostras. a: ponta com sua extremidade obstruída com 100 μL do agarose de 0,5% (linhas diagonais). As amostras foram colocadas nesta ponta. A ponta com a amostra foi inserida em outra ponta de 1.000 μL de micropipeta ' azul ' (b, c) para montagem. b foi utilizado para Xenoturbella japonica, e c foi usado para Harmothoe SP. (c) montado X. japonica amostra, visão geral (esquerda) e close-up (direita). A fonte de raios-X pode ser vista à direita da amostra. D) diagramas para a montagem de amostras numa ponteira de 1.000 μl de micropipeta "azul". a: amostra de X. japonica na água destilada. b: a amostra estava em contato com a parede da ponta (setas), de modo que não se mova durante a digitalização. c: Harmothoe SP. amostra em 0,5% agarose. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Amostras de digitalização no sistema de tomografia computadorizada de raios X microfoco. (A) tela de funcionamento durante a exploração do sistema do tomography computado do raio x do microfoco que mostra uma imagem da transmissão do raio x de um espécime do equina da de actinia . Ajuste o contraste e o brilho com o ' contraste de imagem ' no canto inferior esquerdo. (B) vista do estágio de montagem que mostra o botão do eixo Y. (C) a imagem da transmissão do raio x do espécime de a . equina da após o estágio da montagem foi movida mais perto da fonte do feixe de raio x. Observe que ele é ampliado quando comparado com a imagem no centro de (A). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Tela de funcionamento do sistema da reconstrução da imagem. (A) tela para ajustar as diferenças no eixo de rotação da amostra durante a digitalização, mostrando um espécime Actinia equina da . Caixa magenta: Shift Tab; caixa verde: botão de cálculo do valor de deslocamento automático. (B) tela para ajustar a orientação da imagem, com Harmothoe SP. mostrado. (C) tela durante a reconstrução da imagem de a . equina da, aparar a área fora da caixa amarela onde nenhuma amostra está presente. Caixa magenta: guia área. (D) tela durante a reconstrução da imagem, mostrando a imagem reconstruída de a. equina da. Caixa magenta: guia de reconfiguração; caixa verde: botão de reconfiguração; caixa azul: ajuste de valor preto e branco. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Tela de operação do sistema de análise de imagem. (A) janela de preferências. O ícone de banco de dados (círculo magenta) foi clicado para abrir a janela de gerenciamento de arquivo de banco de dados. (B) janela de gerenciamento de arquivos de banco de dados. Neste software, a caixa mostrada com uma seta precisa estar desativada para permitir a importação de arquivos TIFF. (C) menu e barras de ferramentas da tela do banco de dados. Caixa magenta = ícone de importação; caixa azul = ícone do visualizador 2D. (D) janela de importação de DataSet. Círculo magenta = botão copiar links. (E) barras de menu e ferramentas da tela do visualizador 2D. Caixa magenta = guia visualizador 3D; caixa verde = ícone de brilho/contraste; caixa azul = ícone de orientação. (F) janela de ajuste de calibração. Insira os valores de resolução desejados dentro das colunas na caixa magenta. (G) seção transversal de um espécime Actinia equina da exibido na janela do visualizador 2D para ajustar o brilho e o contraste. Caixa magenta: barra de rolagem para verificar outras seções transversais. (H) seção transversal de a. equina da exibida na janela do visualizador 2D com uma orientação diferente para (G). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 : Imagens digitalizadas e reconstruídas de invertebrados marinhos. (A) secções transversais e (B) longitudinais de actinia equina da. A área dentro da caixa amarela pontilhada em (B) é ampliada no embutido. Abreviaturas: DM, par de mesenterias de diretriz; m, par de mesenterias perfeitas; MF, filamento as; p, faringe; si, siphonoglyphs; t, tentáculo; setas, disco oral; pontas de seta brancas, disco do pedal; pontas de seta pretas, músculo do esfíncter. Barras de escala em A, B = 3 mm. (C-E) Harmothoe SP. (c) seção sagital da parte anterior. (D, E) Seção transversal nas linhas pontilhadas d e e em (C). Abreviaturas: ACI = aciculum; ACIM = músculo acicular; Coe = coelom; DLM = músculo longitudinal dorsal; ELP = elytrophore; olho = olho; int = intestino; mandíbula = mandíbula; Mant = antena mediana; mo = boca; MP = músculos de Proboscis; palp = palp; Pha = faringe; prob = Proboscis; VLM = músculo longitudinal ventral; VNC = cabo do nervo ventral. Barras de escala: C = 1 mm; D, E = 0,3 mm. (F, G) Xenoturbella japonica. F) secção sagital de toda a amostra. (G) secção sagital da parte anterior. BL = lâmina basal; int = intestino; ml = camada muscular; mo = boca; NN = rede nervosa intraepidérmica; seta branca = statocyst; seta preta = poro frontal; setas brancos = rede glandular ventral; pontas de seta pretas = oócitos. Barras de escala: F = 1 mm, G = 0,5 mm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: preparação da amostra e protocolo de digitalização para cada espécime.
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Discussion
Os fixadores que utilizam formalina, como a solução de formalina a 10% (v/v) em água salgada utilizada neste estudo, são conhecidos por preservar a morfologia de diversos invertebrados marinhos e são freqüentemente utilizados para a microtomografia computadorizada18,24,25 ,26,28,30,33. No entanto, restrições sobre o uso deste produto químico tornaram-se rigorosas em alguns países nos últimos anos, e substitutos como paraformaldeído ou glutaraldeído podem ser usados. Se há planos para extrair DNA após a digitalização, é melhor evitar o uso de formalina como um fixador, porque é conhecido por fragmento de DNA. Neste caso, recomenda-se o uso de fixativos que preservam o DNA, como o etanol a 70%. Neste estudo, o cnidário a. equina da foi fixado com 70% de etanol, e as imagens de microct claras foram obtidas a partir de 70% de amostras fixas de etanol (Figura 6A, B).
Em um estudo prévio que realizou a varredura de microct de vários táxons cnidários, muitas amostras foram desidratadas em etanol a 100%, e algumas foram críticas-ponto-secas antes da digitalização24. Embora os órgãos internos macios tais como aglomerados do tentáculo, os músculos, e as gônadas fossem observados com sucesso em seu estudo, os processos da desidratação e de secagem são sabidos para conduzir aos artefactos principais tais como a deformação e a contração de tecidos macios11 , 21. no presente estudo, pudemos observar as estruturas internas do cnidário a . equina da fixados em etanol a 70% e corados com solução de Lugol a 25% (Figura 6A, B). Nosso protocolo, sem qualquer desidratação ou etapas de secagem, é preferível, e deve ser realizada sempre que possível para reduzir o risco de danos aos espécimes e artefactos durante a digitalização.
Solução de Lugol, solução de iodo e ácido fosfotúngstico (PTA) são soluções de coloração que são freqüentemente usadas em amostras biológicas em microtomografia computadorizada6,7,9,14,16, 17,20,26,27,38. De nossa experiência de usar várias amostras biológicas, a solução de Lugol forneceu os melhores resultados para muitas amostras, com mancha escura em uma quantidade de tempo relativamente curta. A solução do iodo rendeu somente manchas muito fracas, e o PTA exigiu muito tempo para a mancha suficiente e os espécimes manchados mostraram contrações fortes. Portanto, todos os espécimes foram corados com solução de Lugol neste estudo. Entretanto, embora a solução de Lugol seja recomendada, a solução de coloração apropriada difere entre espécimes, e nós sugerimos que os testes que usam outras soluções de coloração estejam executados se há bastante espécimes. Independentemente da solução de coloração, as amostras do contrato durante a coloração37,38, por isso é importante manter o tempo de coloração curto.
Um passo crítico na digitalização microCT é montar a amostra de modo a impedi-lo de se mover. Neste estudo, este foi executado em duas etapas, primeiramente usando o agarose como o meio de montagem direto, e então usando a argila para montar o tubo que continha a amostra ao estágio. Para o primeiro passo, vários suportes de montagem de baixa densidade têm sido utilizados em estudos anteriores, incluindo etanol6,17,20,25,30, agarose9,29 , e espuma floral15,22,31. Agarose foi selecionado neste estudo, pois é um produto químico de baixo custo que é acessível em todo o mundo. Uma desvantagem do agarose é que pode ser difícil recuperar a amostra do agarose endurecido após a exploração mas usar o agarose do baixo-derretimento-ponto faz esta etapa da recuperação mais fácil. Para a segunda etapa, os grampos ou os parafusos da maxila são usados frequentemente6,9,17. A argila foi selecionada neste estudo, pois possibilita ajustes finos na orientação e ângulo da amostra. O cuidado é necessário para experimentos com longos tempos de digitalização, pois a possibilidade de movimento da amostra é maior quando se utiliza argila em vez de grampos ou parafusos de mandíbula.
Um estudo prévio realizou a varredura de microCT em sete espécies de polichaete com comprimentos corporais de 2-8 mm, menores que o Harmothoe SP. utilizados neste estudo16. Eles conseguiram gerar imagens de alta resolução, e mostraram órgãos como sistemas vasculares e chaeta individual mais claros do que no presente estudo. A principal causa dessa diferença não foi o protocolo, mas as especificações dos sistemas microCT utilizados. O sistema utilizado no estudo anterior foi equipado com uma câmera de 11 megapixels de dispositivo acoplado a carga (4000 x 2672 pixels) com uma resolução máxima de < 0,8 μm/pixel16. O tamanho da matriz de imagem ativa do sistema utilizado neste estudo foi de 992 x 992 pixels, com resolução máxima de > 5 μm/pixel. Portanto, a resolução espacial do sistema microCT utilizado neste estudo foi inferior ao sistema microCT de alto desempenho utilizado em Faulwetter et al.16. Esta diferença foi particularmente perceptível ao digitalizar espécimes menores que 8 mm, nos quais experimentamos uma falta de resolução (dados não mostrados). No entanto, como menos dados foram obtidos durante a varredura neste estudo, o tempo de varredura foi muito menor do que no estudo anterior16 (dados: 992 x 992 e 4000 x 2672 pixels, respectivamente; tempo de digitalização: 10 a 26 min e 30 min a várias horas, respectivamente). Um tempo curto da exploração reduz a descoloração da mancha do iodo, permitindo o uso da solução de Lugol, que é uma boa solução de mancha com uma taxa de penetração elevada, mas difunde facilmente em DW34. Um curto tempo de digitalização também diminui a possibilidade do movimento da amostra durante a digitalização, o que permitiu o uso de um método de montagem simples usando agarose ou DW (Figura 2). Tempos de digitalização mais longos também têm a desvantagem de possível borrão de encolhimento de amostra em imagens. Diversos outros problemas mecânicos e de hardware que podem ocorrer durante varreduras longas foram relatados igualmente39. Conseqüentemente, ao usar sistemas de microCT, é importante compreender exatamente a especificação de cada sistema, e escolher o sistema direito nos termos do tamanho do espécime ou do alvo da pesquisa. Em alguns casos, um sistema microCT com baixa resolução pode ser suficiente.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer a Toshihiko Shiroishi por sua assistência e por fornecer o ambiente de pesquisa durante este estudo. Estamos gratos a Kensuke Yanagi e Takato Izumi por conselhos sobre a . equina da, e Masaatsu Tanaka para aconselhamento sobre o espécime Harmothoe SP. Gostaríamos de agradecer aos funcionários do Shimoda Marine Research Center, da Universidade de Tsukuba, e Misaki Marine Biological Station, a Universidade de Tóquio para a sua ajuda em coleções de amostras. Gostaríamos de agradecer a Editage (www.editage.jp) para edição de idioma inglês. Este trabalho foi apoiado pelo JSPS Grant-in-Aid para jovens cientistas (A) (JP26711022) para HN, e JAMBIO, Associação Japonesa de biologia marinha.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 250-ml Erlenmeyer flask | Corning | CLS430183 | |
| 5-ml Sampling tube ST-500 | BIO-BIK | 103010 | |
| 50-ml Polypropylene tube | Greiner Bio One International | 227261 | |
| 60-mm Non-treated Dish | IWAKI | 1010-060 | |
| Agarose | Promega | V3125 | |
| Ecological grade tip (blue) 1000 µl | BMBio | BIO1000RF | |
| Ethanol | Wako Pure Chemical Industries | 057-00451 | |
| Formalin | Wako Pure Chemical Industries | 061-00416 | |
| Iodine | Wako Pure Chemical Industries | 094-05421 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Wako Pure Chemical Industries | 135-00165 | |
| OsiriX DICOM Viewer | Pixmeo SARL | OsiriX MD v10.0 | https://www.osirix-viewer.com |
| Paraformaldehyde | Wako Pure Chemical Industries | 163-25983 | |
| Petiolate needle | AS ONE | 2-013-01 | |
| Pipetman P200 Micropipette | GILSON | F123601 | |
| Pipetman P1000 Micropipette | GILSON | F123602 | |
| Potassium iodide | Wako Pure Chemical Industries | 166-03971 | |
| Precision tweezers 5 | DUMONT | 0302-5-PS | |
| QuickRack MultI fit tip (yellow) 200 ul | Sorenson | 10660 | |
| Razor blades | Feather | FA-10 | |
| Ring tweezers | NAPOX | A-26 | |
| Stereoscopic microscope | Leica | MZ95 | |
| X-ray Micro-CT imaging system | Comscantechno | ScanXmate-E090S105 |
References
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