Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Microfocus X-ray CT (microCT) avbildning av Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe SP. (Annelida), och xenoturbella japonica (xenacoelomorpha)

Published: August 6, 2019 doi: 10.3791/59161
Automatic Translation
1, 2, 3, 3
1Mammalian Genetics Laboratory, National Institute of Genetics, 2Misaki Marine Biological Station, The University of Tokyo, 3Shimoda Marine Research Center, University of Tsukuba

Summary

Här förklaras protokoll för att utföra mikrofokus röntgenbild behandling av tre Marina ryggradslösa djur i detalj. Denna studie beskriver steg som exempel fixering, färgning, montering, skanning, bild rekonstruktion, och dataanalyser. Förslag på hur protokollet kan justeras för olika prover tillhandahålls också.

Abstract

Traditionellt har biologer tvingats förlita sig på destruktiva metoder som snittning för att undersöka de inre strukturerna hos ogenomskinliga organismer. Icke-förstörande med röntgen datortomografi (MicroCT) Imaging har blivit ett kraftfullt och framväxande protokoll i biologi, på grund av tekniska framsteg i provet färgning metoder och innovationer i MicroCT hårdvara, bearbetning av datorer och data analysprogramvara. Detta protokoll används dock inte ofta, eftersom det är inom de medicinska och industriella områdena. En av anledningarna till denna begränsade användning är avsaknaden av en enkel och begriplig manual som täcker alla nödvändiga steg: provtagning, fixering, färgning, montering, skanning och dataanalyser. En annan orsak är den stora mångfalden av metazoaner, särskilt Marina ryggradslösa djur. På grund av Marina ryggradslösa djur olika storlekar, morfologier och fysiologier, är det viktigt att justera experimentella förhållanden och hårdvarukonfigurationer vid varje steg, beroende på provet. Här beskrivs microCT Imaging metoder i detalj med hjälp av tre fylogenetiskt olika Marina ryggradslösa djur: Actinia equina (anthozoa, Cnidaria), Harmothoe SP. (polychaeta, Annelida), och xenoturbella japonica ( Xenoturbellida, Xenacoelomorpha). Förslag på hur man utför microCT Imaging på olika djur tillhandahålls också.

Introduction

Biologiska forskare har i allmänhet varit tvungna att göra tunna sektioner och utföra observationer av ljus eller elektronmikroskopi för att undersöka de inre strukturerna av ogenomskinliga organismer. Dessa metoder är dock destruktiva och problematiska när de appliceras på sällsynta eller värdefulla exemplar. Dessutom är flera steg i metoden, till exempel inbäddning och snittning, tidskrävande och det kan ta flera dagar att observera ett prov, beroende på protokollet. Dessutom, vid hantering av många sektioner, det finns alltid en möjlighet att skada eller förlora vissa sektioner. Vävnads röjnings tekniker finns tillgängliga för vissa exemplar1,2,3,4,5 men är ännu inte tillämpliga för många djurarter.

För att övervinna dessa problem, har vissa biologer börjat använda med röntgen datortomografi (MicroCT) Imaging6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15. I röntgen CT är preparatet bestrålat med röntgenstrålar från olika vinklar som genereras från en röntgenkälla som rör sig runt provet, och de överförda röntgenstrålar övervakas av en detektor som också rör sig runt provet. De erhållna röntgen överföringsdata analyseras för att rekonstruera tvärsnittsbilder av preparatet. Denna metod möjliggör observation av interna strukturer utan förstörelse av provet. På grund av dess säkerhet och lätthet, det används ofta i medicinska och tandvård, och CT-system kan hittas på sjukhus och Dental centers över hela världen. Dessutom används industriell röntgen-CT ofta för att observera icke-medicinska prover för inspektion och metrologi på industriområdet. I motsats till medicinska CT, där röntgenkällan och detektorer är rörliga, de två delarna är fasta i industriella CT, med provet roterande under skanning. Industrial CT ger i allmänhet högre upplösning bilder än medicinska CT och kallas microCT (mikrometer-nivå upplösning) eller nanoCT (nanometer-nivå upplösning). Nyligen har forskning med MicroCT snabbt ökat inom olika områden av biologi14,15,16,17,18,19, 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34.

Biologiska studier med hjälp av CT initialt riktade interna strukturer som huvudsakligen består av hård vävnad, såsom ben. Framsteg inom infärgning tekniker med hjälp av olika kemiska ämnen aktiverat visualisering av mjuk vävnad i olika organismer6,7,8,9,14,15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34. av dessa reagenser, jod-baserade kontrastmedel är relativt säker, billig, och kan användas för visualisering av mjuk vävnad i olika organismer7,14. När det gäller Marina ryggradslösa djur har MicroCT använts i stor utsträckning på sådana djuren som blötdjur6,25,32,33, maskarna18,19, 20 , 28, och arthoropods21,23,29,31. Det har dock förekommit få rapporter om andra djur phyla, såsom bryozoer6, xenacoelomorphs26, och koraller24,30. I allmänhet, det har varit färre studier med microCT på Marina ryggradslösa djur än de på ryggradsdjur. En viktig orsak till denna begränsade användning av Marina ryggradslösa djur är den stora mångfalden som observerats hos dessa. På grund av sina olika storlekar, morfologier och fysiologier reagerar varje art annorlunda än olika experimentella procedurer. Därför är det avgörande vid provberedning att välja den lämpligaste fixering och Färgnings reagens, och att ställa in förhållanden vid varje steg, justerat för varje art. På samma sätt är det också nödvändigt att ställa in scanning konfigurationer, såsom monteringsmetod, spänning, ström, mekanisk förstoringsgrad, och utrymme upplösning makt, på lämpligt sätt för varje prov. För att övervinna detta problem, en enkel och begriplig manual som täcker alla nödvändiga steg, förklarar hur varje steg kan justeras beroende på preparatet, och visar detaljerade exempel från flera prover är viktigt.

I den nuvarande studien beskriver vi microCT Imaging Protocol steg för steg, från prov fixering till dataanalys, med hjälp av tre Marina ryggradslösa djurarter. Exemplar av havanemon Actinia equina (anthozoa, Cnidaria) samlades i närheten av Misaki Marine Biological Station, University of Tokyo. De hade en sfärisk, mjuk kropp som var ca 2 cm i diameter (figur 1A-C). Harmothoe SP. (polychaeta, Annelida) prover samlades också nära Misaki Marine Biological Station. De var smala maskar som var ca 1,5 cm i längd, med tuffa chaetae närvarande längs hela kroppen (figur 1d). En Xenoturbella japonica35 (xenoturbellida, Xenacoelomorpha) prov samlades nära Shimoda Marine Research Center, University of Tsukuba, under den 13: e Jambio Coastal organism gemensamma undersökningen. Det var en mjuk-arbetsföra mask som var ca 0,8 cm i längd (figur 1e). Justeringar som gjorts för de villkor och konfigurationer av varje prov beskrivs i detalj. Vår studie ger flera förslag på hur man utför microCT Imaging på Marina ryggradslösa djur, och vi hoppas att det kommer att inspirera biologer att utnyttja detta protokoll för sin forskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. fixering

  1. För Actinia equina, slappna av djuren i 10% mgcl2 havsvatten i ca 15 min vid rumstemperatur. Överför till 70% etanol och förvara i rumstemperatur.
  2. För harmothoe SP., söva djuren genom att placera dem i iskallt havsvatten i ca 15 min. överföring till 10% (v/v) formalin lösning med havsvatten och förvara i rumstemperatur.
  3. För Xenoturbella japonica, slappna av djuret med 7% mgcl2 i sötvatten. Fix i 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i filtrerat havsvatten över natten. Placera i 70% etanol och förvara vid 4 ° c.
    FÖRSIKTIGHET: PFA är farligt och måste hanteras varsamt.

2. färgning

  1. Överför proverna till 50% etanol och förvara i rumstemperatur i 15 h. Byt ut 50% etanol med 25% etanol och förvara i rumstemperatur i 2 h.
    Anmärkning: Detta är inte nödvändigt för Harmothoe SP. provet i 10% (v/v) formalin lösning med havsvatten.
  2. Byt ut lösningen med destillerat vatten (DW) och förvara proverna i DW vid rumstemperatur i 2 timmar. Upprepa det här steget tre gånger.
  3. Förbered 25% Lugol lösning genom att späda stamlösningen (nedan) till 25% med DW. Stamlösning (100% Lugol lösning) innehåller 10 g KI och 5 g i2, justerat till 100 ml med DW.
    Obs: Lugol lösning är ljuskänslig, så förvara och hantera den lösning som skyddas från ljus. Följ reglerna i varje land och institution för jod hantering och avfallshantering.
  4. Dekanera DW från proverna och häll i 25% Lugol lösning. Fläck för 24 h vid rumstemperatur.

3. montering på scen

  1. Förbered 0,5% aguppstod genom att lösa upp 500 mg aguppstod i 100 mL DW i en 250 mL e-kolv i en mikrovågsugn (800 W, ca 1-3 min). Kyl till ca 30-40 ° c genom att hålla i rumstemperatur.
    Varning: överhettas inte eller helt försegla kolven vid upphettning för att förhindra att Agros kokas över.
  2. Montera stora prover som a. equina med en 50 ml tub.
    Anmärkning: Använd 50 mL-rör för montering av stora prover som inte passar i en 1 000 μL mikropipett ' blå ' spets.
    1. Placera det färgade provet i en 60-mm maträtt med DW att tvätta bort överdriven färgning lösning från ytan.
    2. Häll försiktigt 5 mL 0,5% aguppstod i en 50 mL tub och härda aguppstod på isen. Var noga med att inte göra bubblor i aguppstod.
    3. Tillsätt försiktigt 20 mL 0,5% Agreste till 50 mL-röret och placera på isen tills aguppstod börjar härda. Placera preparatet inom 0,5% aguppstod med hjälp av pinps. Var noga med att inte göra bubblor i aguppstod.
    4. Justera placeringen och orienteringen av provet med pintrops och härda aguppstod på is.
    5. Placera lera på microCT monterings stadiet och Ställ 50 mL röret på leran (figur 2a).
  3. Montera små prover som Harmothoe SP. och X. japonica med hjälp av en 1 000 μl mikropipett ' blå ' spets.
    Anmärkning: för mindre prover kan 200 μL mikropipett ' gult ' spets användas. I detta fall, Använd 30 μL av aguppstod för pluggen och tillsätt 200 μL av Agreste eller destillerat vatten.
    1. Dra upp 100 μL av 0,5% aguppstod i en 1 000 μL mikropipett ' blå ' spets och härda aganset genom att hålla spetsen över isen, vilket gör en plugg i spetsen (figur 2B-a).
    2. Dekanera det färgade provet i en 60-mm maträtt utan att använda pinps.
    3. Överför försiktigt provet med hjälp av ring pincett till en annan 60-mm maträtt med DW för att tvätta bort överdriven färgning lösning från ytan.
    4. Tillsätt 1 000 μL av antingen 0,5% Agreste eller DW i den pluggas spetsen (steg 3.3.1) med en mikropipett.
      Anmärkning: användning av 0,5% Agreste rekommenderas, men Använd DW för ömtåliga eller värdefulla prover där aguppstod bör undvikas.
    5. Överför försiktigt provet från 60-mm skålen till aguppstod eller DW i den pluggas spetsen med hjälp av ring pincett.
    6. Justera försiktigt positionen och orienteringen av provet med en skaft nål eller precisionpincett. Var noga med att inte göra bubblor i monterings mediet. Se till att provet är stabilt mellan väggarna i spetsen när DW används som monteringsmedel (figur 2D-b). Placera spetsen på isen för att härda aguppstod om det används som monteringsmedel.
    7. Skär spetsen av en ny 1 000 μL mikropipett ' blå ' spets (figur 2b-b, c) och sätt spetsen på den pluggas spetsen i den nya spetsen.
    8. Placera leran på microCT monterings stadiet och Ställ in spetsarna med provet inne på leran (figur 2C, D).
      Anmärkning: färgningslösningen kommer att börja tvätta bort provet när det är placerat i DW, så fortsätt till nästa skannings steg omgående.

4. MicroCT skanning

  1. Slå på röntgenstrålen på 80 kV, 100 μA.
  2. Medan du observerar röntgenbilden i mitten av skärmen (figur 3a), flyttar du scenen så att hela provet kan ses genom att klicka på x -och Z-axelns knappar (bild 3a) och manuellt Justera Y-axelns ratt på monterings stadiet (bild 3b). Ställ in bildens kontrast så att de interna strukturerna kan observeras genom att justera kontrast förhållandena (figur 3A: bildkontrast).
  3. Justera provets orientering genom att ändra vinkeln på röret/spetsen i leran (figur 2A). Vrid scenen 90 ° genom att ställa in rotationsaxeln (figur 3a) till 90 och klicka på den relativa förflyttnings knappen (bild 3a). Utför samma manöver fyra gånger för att slutföra en full rotation.
    Märk: Stäng av röntgenstrålen manuellt varje gång prov luckan öppnas, om inte systemet stängs av automatiskt.
  4. Flytta scenen så att provet är i mitten av vyn genom att klicka på Z -axelknappen (bild 3a) och genom att manuellt justera Y-axelns knopp på monterings stadiet (bild 3B). Vrid scenen med 90 ° och gör detsamma. Vrid scenen 360 ° och kontrollera att provet är i mitten av vyn från alla riktningar.
  5. Flytta scenen längs x-axeln mot röntgenstråle källan genom att klicka på x -axelknappen (figur 3a) för att förstora provet och justera efter behov så att det bara passar i vyn (figur 3C).
  6. Vrid scenen 360 ° och justera efter behov så att provet passar inom vy från alla riktningar.
  7. Justera skannings förhållandena som visas i tabell 1.
  8. Börja skanna; Det tar ca 10 min.

5. bild rekonstruktion

  1. Starta microCT-systemets tillbehörsprogram (se material tabellen) och öppna skannade data.
  2. Justera skillnaderna i provets rotationsaxel under skanningen genom att klicka på knappen för automatisk växlings värdeberäkning (bild 4A: grön ruta).
  3. Justera bildens orientering genom att vrida på de orangefärgade pilarna (bild 4B). Om orienteringen ändrades upprepar du steg 5,2.
  4. Klicka på fliken område (figur 4c: Magenta rutan) och trimma områden där prover inte finns (figur 4c: gul ruta).
  5. Klicka på fliken omkonfiguration (figur 4D: Magenta rutan) och Ställ in filtren enligt följande för att ta bort brus. Ring artefakt minska filter: median filter-3; Brus eliminering filter: Genomsnittligt filter-1.
  6. Utför omkonfigurering genom att klicka på knappen omkonfigurering (bild 4D: grön ruta).
  7. Justera bildens ljusstyrka och kontrast genom att ställa in svarta och vita värden som svart värde 0, vit värde 250 (figur 4D: blå ruta).
  8. Spara den rekonstruerade TIFF-bilddatauppsättningen som en 8-bitars TIFF-fil genom att klicka på knappen Spara. Byt namn på TIFF-filer enligt följande: Date_sample_resolution (μm) _ Number. TIFF.
    Obs: de ursprungliga microCT-datauppsättningarna från denna studie finns tillgängliga i Figshare-förvaret, Doi: 10.6084/M9. figshare. 767083736.

6. data analyser

  1. Starta dataanalysprogram varan (se tabellen med material) och aktivera import av TIFF-filer genom att klicka på databas ikonen (bild 5A: Magenta rutan) och stänga av rutan som visas i figur 5B.
  2. Klicka på import ikonen (bild 5C: Magenta rutan), Välj den datauppsättning som sparats i avsnitt 5 och klicka på Öppna.
  3. Klicka på knappen Kopiera länkar (bild 5D) för att importera data.
  4. Visa 2D-tvärsnittet genom att klicka på 2D -Visningsikonen (figur 5C: blå ruta).
  5. Kalibrera datamängden genom att klicka på 3D -visningsfliken (bild 5E: Magenta-ruta) och ange upplösnings värdet vid skanning (vilket var 0,018 i denna studie [figur 5F]).
  6. Klicka på ikonen för ljusstyrka/kontrast (figur 5E grön ruta). Justera ljusstyrkan och kontrasten genom att flytta markören inuti den visade 2D-bilden och ändra Fönsternivå och fönsterbredd (figur 5G).
  7. Kontrollera andra tvärsnittsbilder genom att flytta rullningslisten (figur 5G: ruta).
  8. Ändra tvärsnitts orienteringen genom att klicka på orienterings ikonen (bild 5E: blå ruta) och kontrollera bilderna i alla riktningar (bild 5H).
  9. Klicka på bilden som visas och välj fliken Exportera för att lagra bilder i tvärsnitt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi utförde microCT Imaging på A. equina (anthozoa, Cnidaria), Harmothoe SP. (polychaeta, Annelida), och X. japonica (Xenoturbellida, xenacoelomorpha) efter färgning proverna med 25% lugol lösning. Infärgning förbättrade framgångsrikt kontrasten hos de interna strukturerna i alla exemplar, vilket möjliggör observationer av inre mjukdelar (figur 6). Tillsammans med tidigare rapporter6,7,16,19,22,23,24,25,26 , 28 , 30 , 31 , 32 , 33, detta visar att MicroCT kan användas på olika Marina ryggradslösa djur för att visualisera deras morfologi, inklusive mjuka inre vävnader. Tydliga bilder erhölls även med X. japonica -exemplaret, vars epidermis var svårt skadat (figur 6F, G), som visar att denna metod är tillämplig på ömtåliga preparat med yttre skada.

Om du skannar endast regionen av intresse, i motsats till ett bredare område, kraftigt ökad tydlighet och upplösning av bilden (jämför figur 6F och figur 6G). Men en enda högupplöst datauppsättning av ett helt exemplar rekonstruerades för harmothoe SP. (figur 6C) och X. japonica (figur 6F) från flera skanningar utförda på olika (men överlappande) delar av preparatet. Sömmarna mellan varje skanning var inconspicuous i de rekonstruerade bilderna. Vår studie visar att enstaka högupplösta bilder kan erhållas med kon-beam microCT system. Genom att scanna ett större område med hög upplösning, finns det en mindre risk att ha utsikt över små strukturer. En annan fördel är att det är lättare att lokalisera de relativa positionerna av strukturer som ligger långt ifrån varandra, såsom främre och bakre spetsar av en långsträckt glölid.

Figure 1
Figur 1 : Marina ryggradslösa djur som observerats i denna studie. (a-C) Auktor (Anthozoa, Cnidaria). (A) distala änden av ett levande djur avslappnad i 10% mgcl2 havsvatten. Distala (B) och proximala (C) slutar efter fixering i 70% etanol. (D) levande sövda Harmothoe SP. (polychaeta, Annelida), dorsala Visa med Anterior till vänster. De flesta av Elytra saknades redan i detta skede, med endast fyra kvar nära den bakre änden. (E) xenoturbella japonica (xenoturbellida, Xenacoelomorpha) fast i 70% etanol. Höger vy, med Anterior till toppen. På grund av omständigheterna vid insamlingen, dess epidermis började lossas. Skalstreck = 3 mm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Montering prover på med röntgen-datortomografi system. A) monteringsprov i en 50 ml tub med lera. Inriktningen av provet kan justeras med hjälp av leran. Bberedning av en 1 000 μl mikropipett blå spets för montering av små prover. a: spets med sin ände inkopplad med 100 μL av 0,5% Agreste (diagonala linjer). Proverna placerades i detta tips. Spetsen med provet sattes in i en annan 1 000 μL mikropipett ' blå ' spets (b, c) för montering. b användes för Xenoturbella japonica, och c användes för Harmothoe SP. (c) monterad X. japonica prov, översikt (vänster) och närbild (höger). Röntgenkällan kan ses till höger om provet. D) diagram för montering av prover i en 1 000 μl mikropipett ' blå ' spets. a: X. japonica prov i destillerat vatten. b: provet var i kontakt med spets väggen (pilar), så att den inte rör sig under skanning. c: Harmothoe SP. prov i 0,5% aguppstod. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Skanna prover på med röntgen datortomografi system. (A) manöver skärmen under skanning av med röntgen datortomografi system som visar en röntgenbild av ett Actinia equina -preparat. Justera kontrasten och ljusstyrkan med "bildkontrasten" längst nere till vänster. (B) vy över monteringsfasen som visar Y-axelns knopp. Cröntgenbild av A. equina -preparatet efter att monteringsfasen flyttats närmare röntgenstrålen. Observera att det är förstorat jämfört med bilden i mitten av (A). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : Drift skärm av bilden återuppbyggnads system. (A) skärm för att justera skillnader i rotationsaxeln av provet under skanning, visar en Actinia equina prov. Magenta låda: Shift Tab; grön ruta: automatisk växling värde beräknings knapp. (B) skärm för att justera bildens orientering, med Harmothoe SP. visas. (C) skärm under bilden rekonstruktion av A. equina, trimma området utanför den gula rutan där inga prover finns. Magenta Box: fliken område. (D) skärm under bild rekonstruktion, som visar den rekonstruerade bilden av A. equina. Magenta låda: omkonfiguration Tab; grön låda: omkonfigurering knapp; blå ruta: svart och vit värde justering. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 : Bildanalys systemets manöver skärm. (A) preferens fönster. Databasikonen (magenta cirkel) klickade för att öppna fönstret databas fils hantering. (B) fönstret databas fils hantering. I det här programmet måste rutan som visas med en pil vara avstängd för att kunna importera TIFF-filer. (C) meny-och Verktygsstaplar på databas skärmen. Magenta låda = importera ikon; blå ruta = 2D Viewer ikon. (D) fönstret datamängds import. Magenta cirkel = knappen Kopiera länkar. (E) meny-och verktygsfält på 2D-visningsskärmen. Magenta låda = 3D Viewer Tab; grön ruta = ljusstyrka/kontrast ikon; blå ruta = orienterings ikon. (F) kalibrerings inställningsfönster. Ange önskade upplösningsvärden inom kolumnerna i rutan magenta. (G) tvärsnitt av ett Actinia equina -preparat som visas i 2D-visningsfönstret för att justera ljusstyrka och kontrast. Magenta rutan: rullningslist för att kontrollera andra tvärsnitt. (H) tvärsnitt av a. equina visas i 2D-visningsfönstret med en annan orientering till (G). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6 : Skannade och rekonstruerade bilder av Marina ryggradslösa djur. Atvärgående ochBlängsgående sektioner av Actinia equina. Området innanför den prickade gula rutan i (B) förstoras i insetet. Förkortningar: DM, par i direktiv mesenteries; m, par perfekta mesenteries; MF, mesenterial glödtråden; p, farynx; SI, siphonoglyphs; t, Tentacle; pilar, oral disk; vita pilspetsar, pedal skiva; svarta pilspetsar, sphincter muskler. Skalstreck i A, B = 3 mm. (C-E) Harmothoe SP. (c) sagittal avsnitt i den främre delen. (D, E) Tvärgående sektion vid de streckade linjerna d och e i (C). Förkortningar: ACI = aciculum; Acim = nålformig muskel; COE = coelom; DLM = dorsala longitudinella muskler; ELP = elytrophore; öga = öga; int = tarmen; käken = käken; mant = median antenn; Mo = mun; MP = muskler av snabel; palp = palp; Pha = farynx; prob = snabel; VLM = ventrala longitudinella muskler; VNC = ventrala nerv sladden. Skalstreck: C = 1 mm; D, E = 0,3 mm. (F, G) xenoturbella japonica. Fsagittal i hela provet. (G) sagittal avsnitt av den främre delen. bl = basal lamina; int = tarmen; ml = muskel skikt; Mo = mun; NN = intraepidermal nerv netto; vit pil = statocyst; svart pil = frontal pore; vita pilspetsar = ventrala körtel nätverk; svarta pilspetsar = oocyter. Skalstreck: F = 1 mm, G = 0,5 mm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Table 1
Tabell 1: provberedning och scanning protokoll för varje provexemplar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Fixativ med formalin, såsom 10% (v/v) formalin lösning i havsvatten som används i denna studie, är kända för att bevara morfologin av olika Marina ryggradslösa djur och används ofta för MicroCT Imaging18,24,25 ,26,28,30,33. Restriktioner för användningen av denna kemikalie har dock blivit stränga i vissa länder under de senaste åren, och substitut som PARAFORMALDEHYD eller glutaraldehyd kan användas. Om det finns planer på att extrahera DNA efter skanning, är det bättre att undvika att använda formalin som fixativ, eftersom det är känt att fragment DNA. I detta fall rekommenderas användning av fixeringsmedel som bevarar DNA, till exempel 70% etanol. I denna studie var artikel om A. equina fast med hjälp av 70% etanol, och tydliga MicroCT bilder erhölls från 70% etanol-fasta prover (figur 6A, B).

I en tidigare studie som utförde MicroCT skanning av olika artikel om taxa, många prover var uttorkad i 100% etanol, och vissa var kritisk-Point-torkade före skanning24. Även mjuka inre organ såsom tentakel kluster, muskler, och gonader observerades framgångsrikt i sin studie, dehydrering och torkning processer är kända för att resultera i stora artefakter såsom deformation och sammandragning av mjuk vävnad11 , 21. i den nuvarande studien kunde vi Observera den interna strukturer artikel om A. equina fast i 70% etanol och färgas med 25% lugol lösning (figur 6A, B). Vårt protokoll, utan dehydrering eller torkning, är att föredra, och bör utföras när det är möjligt för att minska risken för skador på prover och artefakter under skanning.

Lugol lösning, jodlösning, och fosfotungstic syra (PTA) är infärgning lösningar som ofta används på biologiska prover i MicroCT Imaging6,7, 9,14,16, 17,20,26,27,38. Från vår erfarenhet av att använda olika biologiska prover, Lugol lösning som de bästa resultaten för många prover, med mörkfärgning i en relativt kort tid. Jod lösning gav endast mycket svaga fläckar, och PTA krävde en lång tid för tillräcklig färgning och de färgade exemplaren visade starka sammandragningar. Därför var alla prover färgas med Lugol lösning i denna studie. Men även om Lugol-lösningen rekommenderas, skiljer sig lämplig Färgnings lösning mellan proverna, och vi föreslår att försök med andra infärgnings lösningar utförs om det finns tillräckligt med prover. Oberoende av infärgnings lösning, prover gör kontrakt under färgning37,38, så det är viktigt att hålla infärgnings tiden kort.

Ett kritiskt steg i microCT-skanning är att montera provet för att förhindra att det rör sig. I denna studie utfördes detta i två steg, först med Agreste som direkt monteringsmedium, och sedan använda lera för att montera röret som innehöll provet till scenen. För det första steget har olika lågdensitetsmonteringsmedia använts i tidigare studier, inklusive etanol6,17,20,25,30, aguppstod9,29 , och blommig skum15,22,31. Aguppstod valdes i denna studie eftersom det är en låg kostnad kemikalie som är tillgänglig över hela världen. En nackdel med aguppstod är att det kan vara svårt att hämta provet från den härdade aguppstod efter skanning men med låg smältpunkt aguppstod gör detta hämtnings steg lättare. För det andra steget används ofta kläm klämmor eller skruvar6,9,17. Clay valdes i denna studie eftersom det möjliggör finjusteringar i orientering och vinkel av provet. Försiktighet behövs för experiment med långa skannings tider, eftersom möjligheten att provet rör sig är högre vid användning av lera snarare än käftklammer eller skruvar.

En tidigare studie genomfördes MicroCT skanning på sju havs borst arter med kropps längder på 2-8 mm, mindre än harmothoe SP. används i denna studie16. De kunde generera högupplösta bilder, och visade organ såsom vaskulära system och individuella chaeta tydligare än i den nuvarande studien. Den främsta orsaken till denna skillnad var inte protokollet, men specifikationerna för de microCT-system som används. Det system som användes i den tidigare studien var utrustad med en 11-megapixel laddning-kopplad enhet kamera (4000 x 2672 pixlar) med en maximal upplösning på < 0,8 μm/pixel16. Den aktiva bild matrisens storlek för det system som användes i denna studie var 992 x 992 pixlar, med en maximal upplösning på > 5 μm/pixel. Därför var den rumsliga upplösningen av microCT-systemet som används i denna studie sämre än den högpresterande microCT system som används i Faulwetter et al.16. Denna skillnad var särskilt märkbar vid skanning av prover mindre än 8 mm, där vi upplevde en brist på upplösning (data som inte visas). Men eftersom färre data erhölls under skanning i denna studie var skanningstiden mycket kortare än i den tidigare studien16 (data: 992 x 992 och 4000 x 2672 pixlar, respektive; skannings tid: 10 till 26 min och 30 min till flera timmar, respektive). En kort skannings tid minskar missfärgning av jod färgning, vilket gör att användningen av Lugol lösning, vilket är en bra Färgnings lösning med en hög penetrationshastighet, men lätt sprider sig i DW34. En kort skannings tid minskar också möjligheten att provet rör sig under skanning, vilket möjliggjorde användning av en enkel monteringsmetod med aguppstod eller DW (figur 2). Längre skannings tider har också nackdelen med möjliga prov krympning oskärpa i bilder. Flera andra mekaniska och hårdvaruproblem som kan uppstå under långa skanningar har också rapporterats39. Därför, när du använder microCT system, är det viktigt att noggrant förstå specifikationen för varje system, och att välja rätt system i form av provstorlek eller forskningsmål. I vissa fall kan det räcka med ett microCT-system med låg upplösning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi skulle vilja tacka Toshihiko Shiroishi för hans hjälp och för att tillhandahålla forskningsmiljön under denna studie. Vi är tacksamma till Kensuke Yanagi och Takato Izumi för råd om A. equina, och Masaatsu Tanaka för råd om Harmothoe SP. specimen. Vi vill tacka Personalen på Shimoda Marine Research Center, University of Tsukuba och Misaki Marine Biological Station, University of Tokyo för deras hjälp med provsamlingar. Vi vill tacka Editage (www.editage.jp) för engelsk språk redigering. Detta arbete stöddes av JSPS Grant-in-Aid för unga vetenskapsmän (A) (JP26711022) till HN, och JAMBIO, japanska föreningen för marinbiologi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
250-ml Erlenmeyer flask Corning CLS430183
5-ml Sampling tube ST-500 BIO-BIK 103010
50-ml Polypropylene tube Greiner Bio One International 227261
60-mm Non-treated Dish IWAKI 1010-060
Agarose Promega V3125
Ecological grade tip (blue) 1000 µl BMBio BIO1000RF
Ethanol Wako Pure Chemical Industries 057-00451
Formalin Wako Pure Chemical Industries 061-00416
Iodine Wako Pure Chemical Industries 094-05421
Magnesium chloride hexahydrate Wako Pure Chemical Industries 135-00165
OsiriX DICOM Viewer Pixmeo SARL OsiriX MD v10.0 https://www.osirix-viewer.com
Paraformaldehyde Wako Pure Chemical Industries 163-25983
Petiolate needle AS ONE 2-013-01
Pipetman P200 Micropipette GILSON F123601
Pipetman P1000 Micropipette GILSON F123602
Potassium iodide Wako Pure Chemical Industries 166-03971
Precision tweezers 5 DUMONT 0302-5-PS
QuickRack MultI fit tip (yellow) 200 ul Sorenson 10660
Razor blades Feather FA-10
Ring tweezers NAPOX A-26
Stereoscopic microscope Leica MZ95
X-ray Micro-CT imaging system Comscantechno ScanXmate-E090S105

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Susaki, E. A., Tainaka, K., Perrin, D., Yukinaga, H., Kuno, A., Ueda, H. R. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
  2. Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23, 137-157 (2016).
  3. Silvestri, L., Costantini, I., Sacconi, L., Pavone, F. S. Clearing of fixed tissue: a review from a microscopist's perspective. Journal of Biomedical Optics. 21, 081205 (2016).
  4. Greenbaum, A., et al. Bone CLARITY: clearing, imaging, and computational analysis of osteoprogenitors within intact bone marrow. Science Translational Medicine. 9, (2017).
  5. Konno, A., Okazaki, S. Aqueous-based tissue clearing in crustaceans. Zoological Letters. 4, 13 (2018).
  6. Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiology. 9, 11 (2009).
  7. Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: a versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).
  8. Degenhardt, K., Wright, A. C., Horng, D., Padmanabhan, A., Epstein, J. A. Rapid 3D phenotyping of cardiovascular development in mouse embryos by micro-CT with iodine staining. Circulation Cardiovascular Imaging. 3 (3), 314-322 (2010).
  9. Metscher, B. D. X-ray microtomographic imaging of intact vertebrate embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 12, 1462-1471 (2011).
  10. Boistel, R., Swoger, J., Kržič, U., Fernandez, V., Gillet, B., Reynaud, E. G. The future of three-dimensional microscopic imaging in marine biology. Marine Ecology. 32, 438-452 (2011).
  11. Mizutani, R., Suzuki, Y. X-ray microtomography in biology. Micron. 43, 104-115 (2012).
  12. Merkle, A. P., Gelb, J. The ascent of 3D X-ray microscopy in the laboratory. Microscopy Today. 21, 10-15 (2013).
  13. Ziegler, A., Menze, B. H. Accelerated acquisition, visualization, and analysis of zooanatomical data. Computation for humanity. Information technology to advance society. Zander, J., Mosterman, P. J. , CRC Press. Boca Raton, USA. 233-260 (2013).
  14. Gignac, P. M., et al. Diffusible iodine-based contrast-enhanced computed tomography (diceCT): an emerging tool for rapid, high-resolution, 3-D imaging of metazoan soft tissues. Journal of Anatomy. 228 (6), 889-909 (2016).
  15. du Plessis, A., Broeckhoven, C., Guelpa, A., le Roux, S. G. Laboratory x-ray micro-computed tomography: a user guideline for biological samples. GigaScience. 6 (6), 1-11 (2017).
  16. Faulwetter, S., Vasileiadou, A., Kouratoras, M., Dailianis, T., Arvanitidis, C. Micro-computed tomography: Introducing new dimensions in taxonomy. ZooKeys. 263, 1-45 (2013).
  17. Staedler, Y. M., Masson, D., Schonenberger, J. Plant tissues in 3D via X-ray tomography: simple contrasting methods allow high resolution imaging. PLoS One. 8 (9), 75295 (2013).
  18. Fernández, R., Kvist, S., Lenihan, J., Giribet, G., Ziegler, A. Sine Systemate Chaos? A Versatile Tool for Earthworm Taxonomy: Non-Destructive Imaging of Freshly Fixed and Museum Specimens Using Micro-Computed Tomography. PLoS One. 9 (5), 96617 (2014).
  19. Paterson, G. L. J., et al. The pros and cons of using micro-computed tomography in gross and microanatomical assessments of polychaetous annelids. Memoirs of Museum Victoria. 71, 237-246 (2014).
  20. Faulwetter, S., Dailianis, T., Vasileiadou, K., Kouratoras, M., Arvanitidis, C. Can micro-CT become an essential tool for the 21st century taxonomist? An evaluation using marine polychaetes. Microscopy and Analysis. 28, 9-11 (2014).
  21. Sombke, A., Lipke, E., Michalik, P., Uhl, G., Harzsch, S. Potential and limitations of X-ray micro-computed tomography in arthropod neuroanatomy: a methodological and comparative survey. Journal of Comparative Neurology. 523, 1281-1295 (2015).
  22. Landschoff, J., Plessis, A., Griffiths, C. L. A dataset describing brooding in three species of South African brittle stars, comprising seven high-resolution, micro X-ray computed tomography scans. GigaScience. 4 (1), 52 (2015).
  23. Keiler, J., Richter, S., Wirkner, C. S. The anatomy of the king crab Hapalogaster mertensii Brandt, 1850 (Anomura: Paguroidea: Hapalogastridae) - new insights into the evolutionary transformation of hermit crabs into king crabs. Contributions to Zoology. 84 (2), 149-165 (2015).
  24. Holst, S., Michalik, P., Noske, M., Krieger, J., Sötje, I. Potential of X-ray micro-computed tomography for soft-bodied and gelatinous cnidarians with emphasis on scyphozoan and cubozoan statoliths. Journal of Plankton Research. 38, 1225-1242 (2016).
  25. Moles, J., Wägele, H., Ballesteros, M., Pujals, Á, Uhl, G., Avila, C. The End of the Cold Loneliness: 3D Comparison between Doto antarctica and a New Sympatric Species of Doto (Heterobranchia: Nudibranchia). PLoS One. 11 (7), 0157941 (2016).
  26. Nakano, H., et al. A new species of Xenoturbella from the western Pacific Ocean and the evolution of Xenoturbella. BMC Evolutionary Biology. 17, 245 (2017).
  27. Tsuda, K., et al. KNOTTED1 Cofactors, BLH12 and BLH14, Regulate Internode Patterning and Vein Anastomosis in Maize. Plant Cell. 29 (5), 1105-1118 (2017).
  28. Parapar, J., Candás, M., Cunha-Veira, X., Moreira, J. Exploring annelid anatomy using micro-computed tomography: A taxonomic approach. Zoologischer Anzeiger. 270, 19-42 (2017).
  29. Akkari, N., Ganske, A. S., Komerički, A., Metscher, B. New avatars for Myriapods: Complete 3D morphology of type specimens transcends conventional species description (Myriapoda, Chilopoda). PLoS One. 13 (7), 0200158 (2018).
  30. Gusmao, L. C., Grajales, A., Rodriguez, E. Sea anemones through X-rays: visualization of two species of Diadumene (Cnidaria, Actiniaria) using micro-CT. American Museum Novitates. 3907, (2018).
  31. Landschoff, J., Komai, T., du Plessis, A., Gouws, G., Griffiths, C. L. MicroCT imaging applied to description of a new species of Pagurus Fabricius, 1775 (Crustacea: Decapoda: Anomura: Paguridae), with selection of three-dimensional type data. PLoS One. 13 (9), 0203107 (2018).
  32. Machado, F. M., Passos, F. D., Giribet, G. The use of micro-computed tomography as a minimally invasive tool for anatomical study of bivalves (Mollusca: Bivalvia). Zoological Journal of the Linnean Society. , (2018).
  33. Sasaki, T., et al. 3D visualization of calcified and non-calcified molluscan tissues using computed tomography. Biomineralization. Endo, K., Kogure, T., Nagasawa, H. , Springer. Singapore. 83-93 (2018).
  34. Maeno, A., Tsuda, K. Micro-computed Tomography to Visualize Vascular Networks in Maize Stems. Bio-protocol. 8 (1), 2682 (2018).
  35. Nakano, H., et al. Correction to: A new species of Xenoturbella from the western Pacific Ocean and the evolution of Xenoturbella. BMC Evolutionary Biology. 18, 83 (2018).
  36. Maeno, A., Kohtsuka, H., Takatani, K., Nakano, H. MicroCT files from 'Microfocus X-ray computed tomography (microCT) imaging of Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida), and Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha)'. figshare. , (2019).
  37. Vickerton, P., Jarvis, J., Jeffery, N. Concentration-dependent specimen shrinkage in iodine-enhanced microCT. Journal of Anatomy. 223 (2), 185-193 (2013).
  38. Buytaert, J., Goyens, J., De Greef, D., Aerts, P., Dirckx, J. Volume shrinkage of bone, brain and muscle tissue in sample preparation for micro-CT and light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Microscopy and Microanalysis. 20 (4), 1208-1217 (2014).
  39. Sasov, A., Liu, X., Salmon, P. L. Compensation of mechanical inaccuracies in micro-CT and nano-CT. Proceedings of SPIE. 7078, 70781 (2008).

Tags

Miljövetenskap microCT Lugol lösning jod Actinia Cnidaria Harmothoe Annelida xenoturbella xenacoelomorpha ryggradslösa djur
Microfocus X-ray CT (microCT) avbildning av <em>Actinia equina</em> (Cnidaria), <em>Harmothoe</em> SP. (Annelida), och <em>xenoturbella japonica</em> (xenacoelomorpha)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Maeno, A., Kohtsuka, H., Takatani,… More

Maeno, A., Kohtsuka, H., Takatani, K., Nakano, H. Microfocus X-ray CT (microCT) Imaging of Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida), and Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha). J. Vis. Exp. (150), e59161, doi:10.3791/59161 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter