Crescimento e caracterização de organóides irradiados de glândulas mamárias
Summary
Organóides desenvolvidos a partir de glândulas mamárias do camundongo foram irradiados e caracterizados para avaliar características epiteliais e interações com células imunes. Os organóides irradiados podem ser usados para melhor avaliar as interações célula-célula que podem levar ao recrutamento de células tumorais em tecido normal irradiado.
Abstract
Os organóides derivados do tecido digerido são construções tridimensionais multicelulares (3D) que melhor recapitulam as condições in vivo do que as monolayers celulares. Embora não possam modelar completamente a complexidade in vivo, mantêm alguma funcionalidade do órgão original. Em modelos de câncer, os organóides são comumente usados para estudar a invasão de células tumorais. Este protocolo tem como objetivo desenvolver e caracterizar organóides do tecido mamário do camundongo normal e irradiado para avaliar a resposta à radiação em tecidos normais. Estes organoids podem ser aplicados aos estudos in vitro futuros do cancro para avaliar interações da pilha do tumor com organoids irradiados. As glândulas mamárias resected, irradiadas a 20 GY e digeridas em uma solução do colagenase VIII. Os organoids epithelial foram separados através da diferenciação centrífuga, e os organoids 3D foram desenvolvidos em microplates da baixo-adesão do 96-well. Os organoids expressaram o marcador epithelial característico Cytokeratin 14. A interação dos macrófagos com os organóides foi observada em experimentos de cocultura. Este modelo pode ser útil para o estudo de interações tumor-estromal, infiltração de células imunes e polarização de macrófagos dentro de um microambiente irradiado.
Introduction
Aproximadamente 60% dos pacientes com câncer de mama triplo negativo (TNBC) escolhem a terapia conservadora da mama (BCT) como forma de tratamento1. Nesta modalidade do tratamento, o tumor que contem a parte do tecido do peito é removido, e o tecido normal circunvizinho é exposto à radiação ionizante para matar todas as pilhas residuais do tumor. O tratamento reduz a recorrência em grande parte da população de câncer de mama; Entretanto, aproximadamente 13,5% dos pacientes tratados com TNBC experimentam recidivas locoregionais2. Portanto, estudar como a radiação pode recrutar células tumorais circulantes (CTCs) levará a importantes insights sobre a recorrência local3,4.
O trabalho precedente mostrou que a radiação do tecido normal aumenta o recrutamento de vários tipos da pilha5. Em modelos pré-clínicos de TNBC, a irradiação do tecido normal aumentou o macrófago e subseqüentemente o recrutamento da pilha do tumor aos tecidos normais5. O estado imunológico influenciou o recrutamento de células tumorais a sítios irradiados, com migração de células tumorais observada em indivíduos imunocomprometidos. Recapitulando essas interações usando organóides derivados de glândulas mamárias permitirá a observação da migração celular e interações célula-stromal em tempo real com microscopia e imagens de células vivas para determinar o papel de dano de radiação na alteração comportamento de células tumorais.
Os organóides mamários do camundongo ajudaram a elucidar passos importantes no desenvolvimento da glândula mamária. Um organóide mamário é um construto tridimensional multicelular de epitélio mamário isolado que é maior que 50 μm6,7,8,9,10. Usando organóides epiteliais primários, Simian et al. avaliaram os fatores necessários para a ramificação na glândula mamária7. Shamir et al. descobriram que a disseminação pode ocorrer sem uma transição epitelial para mesenquimal, proporcionando uma visão da cascata metastática8. Os métodos para a geração e caracterização de organóides do tecido da glândula mamária estão bemestabelecidos6,11,12,13. Entretanto, a nosso conhecimento, os métodos para crescer organoids irradiados das glândulas mamária não foram relatados. Um protocolo para o cultivo e a caracterização de organóides irradiados seria um passo crítico na recapitulação do recrutamento de células imunes e tumorais induzidas por radiação.
Neste trabalho, nós relatamos um método para crescer e caracterizar os organoids epithelial mamária irradiados em microplates baixos da adesão revestidos com um polímero hidrófilo que apoie a formação de spheroids. Esses organóides foram cocultivados com macrófagos para examinar a cinética de infiltração de células imunológicas. Este trabalho pode ser estendido para incluir os organoids coculturing com pilhas adiposas para recapitular características mamária, pilhas do cancro da mama para visualizar o recrutamento da pilha do tumor, e CD8 + pilhas de T para estudar interações tumor-imunes da pilha. Protocolos previamente estabelecidos podem ser utilizados para avaliar organóides irradiados. Os modelos mais adiantados que cocultivam organoids mamária e pilhas imunes derramaram a luz em mecanismos da metástase e da disseminação. DeNardo et al. verificaram que a regulação da célula T CD4 + de macrófagos associados ao tumor aumentou um fenótipo metastático de adenocarcinomas mamários14. Modelos de cocultura também têm sido utilizados para elucidar mecanismos de desenvolvimento biológico. Plaks et al. esclareceram o papel das células T CD4 + como reguladores da organogênese mamária15. Entretanto, nosso grupo é o primeiro a estabelecer um procedimento de Visualizar como a irradiação normal do tecido influencia o comportamento da pilha imune. Porque a irradiação normal do tecido foi mostrada para realçar o recrutamento da pilha do tumor5, este protocolo pode mais ser desenvolvido para analisar como o comportamento da pilha do tumor é alterado pela irradiação do tecido e das pilhas normais, conduzindo a uma compreensão maior de recorrência do cancro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste protocolo, desenvolvemos um método de crescimento reprodutível e caracterização de organóides mamários irradiados (Figura 1). Uma dose da irradiação de 20 GY foi aplicada para espelhar modelos in vivo precedentes do recrutamento da pilha do tumor5. A irradiação de glândulas mamárias ex vivo antes da formação organoide permitiu o isolamento de efeitos de dano de radiação sem uma infiltração correspondente de células imunes. O desenvolvimento de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Dr. Laura L. Bronsart por fornecer GFP e dTomato-rotulados RAW 264,7 macrófagos. Esta pesquisa foi apoiada financeiramente pelo subsídio NIH #R00CA201304.
Materials
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 16004-128 | |
| Anti-cytokeratin 14 | abcam | ab181595 | Lot: GR3200524-3 |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A1933-25G | |
| Collagen Type I | Corning | 354236 | |
| Collagenase from Clostridium Histolyticum, Type VIII | Sigma | C2139 | |
| Collagenase I | Gibco | 17018029 | |
| DMEM/F12 | Thermofisher | 11320-033 | |
| DNAse | Roche | 10104159001 | |
| DPBS | Fisher | 14190250 | |
| E-Cadherin | Cell Signaling | 24E10 | Lot: 13 |
| FBS | Sigma | F0926 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750 | |
| Goat anti-rabbit secondary | abcam | ab150077 | green Lot: GR3203000-1 |
| Goat anti-rabbit secondary | abcam | ab150080 | red Lot: GR3192711-1 |
| Hoechst 33342 | Fisher | 62249 | Lot: TG2611041 |
| Insulin (10 mg/mL) | Sigma | I9278 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium, 100x | Gibco | 51500-056 | |
| Matrigel Basement Membrane (basement membrane extracted from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma) | Corning | 356237 | |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| Nuclon Sphera 96 well plates | Thermo | 174927 | |
| PBS | VWR | 10128-856 | |
| Pen/strep | Fisher | 15140122 | |
| Phalloidin | abcam | ab176757 | Lot: GR3214582-16 |
| Tight Junction Protein 1 | Novus | NBP1-85047 | Lot: C115428 |
| Triton X-100 (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol) | Sigma | X100-100ML | |
| Trypsin | Gibco | 27250-018 | |
| Tween-20 (Polyethylene glycol sorbitan monolaurate) | Sigma | P1379-100ML |
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