Summary

Рост и характеристика облученных органоидов из молочных желез

Published: May 03, 2019
doi:

Summary

Органоиды, разработанные из молочных желез мышей были облучены и характеризуется для оценки эпителиальных признаков и взаимодействий с иммунными клетками. Облученных органоиды могут быть использованы для более эффективного оценки клеточных взаимодействий клеток, которые могут привести к набору опухолевых клеток в облучении нормальной ткани.

Abstract

Органоиды, получаемые из переваренной ткани, представляют собой многоклеточные трехмерные (3D) конструкции, которые лучше повторяют условия естественных условий, чем моноайеры клеток. Хотя они не могут полностью моделировать в естественных условиях сложности, они сохраняют некоторую функциональность оригинального органа. В моделях рака, органоиды обычно используются для изучения вторжения опухолевых клеток. Этот протокол направлен на разработку и характеристику органоидов из нормальной и облученных мышей молочной железы ткани для оценки радиационной реакции в нормальных тканях. Эти органоиды могут быть применены к будущему в пробирке рака исследований для оценки взаимодействия опухолевых клеток с облученных органоидов. Молочные железы были resected, облученных до 20 гр и усваивается в коллагеназы VIII раствора. Эпителиальные органоиды были отделены через центробежные дифференцировки, и 3D органоиды были разработаны в 96-хорошо низкой адгезии микропластин. Органоиды выразили характерный эпителиальный маркер цитокератина 14. Взаимодействие макрофагов с органоидами наблюдалось в экспериментах со-культуры. Эта модель может быть полезна при изучении опухолей-стромальных взаимодействий, инфильтрации иммунных клеток и поляризации макрофагов в облученном микроокружении.

Introduction

Примерно 60% от тройной отрицательный рак молочной железы (TNBC) пациенты выбирают грудного сохранения терапии (BCT) в качестве одной из форм лечения1. В этом модальности лечения, опухоль, содержащая часть ткани молочной железы удаляется, и окружающие нормальные ткани подвергается воздействию ионизирующего излучения, чтобы убить любые остаточные опухолевые клетки. Лечение уменьшает рецидив в большей части населения рака молочной железы; Тем не менее, примерно 13,5% пациентов с TNBC опыт локализрегионарно рецидивов2. Таким образом, изучая, как излучение может набирать циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК) приведет к важным понимание местных рецидивов3,4.

Предыдущая работа показала, что излучение нормальных тканей увеличивает набор различных типов клеток5. В доклинических моделях TNBC, облучение нормальных тканей увеличенного макрофага и впоследствии набора опухолевых клеток к нормальным тканям5. Иммунный статус повлиял на набор опухолевых клеток в облученных участках, с миграцией опухолевых клеток наблюдается у субъектов с ослабленным иммунитетом. Резюме этих взаимодействий с использованием органоидов, полученных из молочных желез позволит наблюдение клеточной миграции и клеток стромальных взаимодействий в режиме реального времени с микроскопией и живой визуализации клеток, чтобы определить роль радиационного повреждения в изменении поведение опухолевых клеток.

Органоиды молочных мышей помогли прояснить ключевые шаги в развитии молочной железы. Оргаоид молочной железы представляет собой многоклеточный, трехмерный конструкт изолированного молочной эпителия, который больше 50 мкм6,7,8,9,10. Используя первичные эпителиальные органоиды, Симиан и др. оценивали необходимые факторы для ветвления в молочной железе7. Шамир и др. обнаружили, что распространение может происходить без эпителиального мезенхимального перехода, обеспечивая понимание метастатического каскада8. Методы генерации и характеристики органоидов из ткани молочной железы хорошо созданы6,11,12,13. Однако, насколько нам известно, о методах выращивания облученных органоидов из молочных желез не сообщалось. Протокол для выращивания и характерирования облученных органоидов был бы критическим шагом в переподборе индуцированных радиацией иммунных и опухолевых клеток.

В данной статье мы сообщаем о методе выращивания и характеризующих облученных в низкоадгезиальных микропластиках молочных эпителиоидов, покрытых гидрофильным полимером, поддерживающего формирование сфероидов. Эти органоиды были совместно культивировали с макрофагами, чтобы изучить кинетику проникновения иммунной клетки. Эта работа может быть расширена за включение совместного культивирования органоиды с жировой клетки, чтобы резюмировать молочных характеристик, клетки рака молочной железы для визуализации опухоли клеток набора, и CD8 + т-клеток для изучения опухоли иммунных взаимодействий клеток. Ранее установленные протоколы могут использоваться для оценки облученных органоидов. Более ранние модели совместного культивирования молочных органоидов и иммунных клеток проливают свет на механизмы метастазов и распространения. Денардо и др. обнаружили, что CD4 + т-клеточной регуляции опухоли связанных макрофагов расширенной метастатического фенотипа молочной аденокарциномы14. Для выяснения механизмов биологического развития использовались также модели сокультуры. Плакс и др. уточнили роль CD4 + т-клеток в качестве регуляторов молочной оргагенеза15. Тем не менее, наша группа является первой, чтобы установить процедуру визуализации, как нормальное облучение тканей влияет на поведение иммунной клетки. Потому что нормальное облучение ткани было показано, что увеличить набор опухолевых клеток5, этот протокол может быть дополнительно разработан, чтобы проанализировать, как поведение опухолевых клеток изменяется путем облучения нормальных тканей и клеток, что приводит к большему пониманию рецидива рака.

Protocol

Исследования на животных проводились в соответствии с институциональными руководящими принципами и протоколами, утвержденными Комитетом по уходу и использованию животных Университета Вандербильта. 1. Подготовка мышей и приобретение клеток (адаптировано из Нгуен-Нгок и…

Representative Results

Облученных эпителиальных молочных органоидов были успешно получены из молочных желез мыши, обработанные, и культивировали на низко-адгезии пластин (рис. 1). Урожайность оргадоидов была протестирована посевом в различных средах роста (рисунок 2A-G). Посев клеток н…

Discussion

В этом протоколе мы разработали метод воспроизводимых темпов роста и характеризации облученных молочных органоидов (рис. 1). Доза облучения 20 гр был применен для зеркала предыдущего в естественных условиях модели набора опухолевых клеток5. Облучение молочн…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим д-р Лаура л. Бронсар для обеспечения GFP и Dтомат-помечены RAW 264,7 макрофагов. Это исследование было финансово поддержано субсидии низ #R00CA201304.

Materials

10% Neutral Buffered Formalin VWR 16004-128
Anti-cytokeratin 14 abcam ab181595 Lot: GR3200524-3
Bovine Serum Albumin Sigma A1933-25G
Collagen Type I Corning 354236
Collagenase from Clostridium Histolyticum, Type VIII Sigma C2139
Collagenase I Gibco 17018029
DMEM/F12 Thermofisher 11320-033
DNAse Roche 10104159001
DPBS Fisher 14190250
E-Cadherin Cell Signaling 24E10 Lot: 13
FBS Sigma F0926
Gentamicin Gibco 15750
Goat anti-rabbit secondary abcam ab150077 green
Lot: GR3203000-1
Goat anti-rabbit secondary abcam ab150080 red
Lot: GR3192711-1
Hoechst 33342 Fisher 62249 Lot: TG2611041
Insulin (10 mg/mL) Sigma I9278
Insulin-Transferrin-Selenium, 100x Gibco 51500-056
Matrigel Basement Membrane (basement membrane extracted from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma) Corning 356237
Normal Goat Serum Vector Laboratories S-1000
Nuclon Sphera 96 well plates Thermo 174927
PBS VWR 10128-856
Pen/strep Fisher 15140122
Phalloidin abcam ab176757 Lot: GR3214582-16
Tight Junction Protein 1 Novus NBP1-85047 Lot: C115428
Triton X-100 (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol) Sigma X100-100ML
Trypsin Gibco 27250-018
Tween-20 (Polyethylene glycol sorbitan monolaurate) Sigma P1379-100ML

References

  1. Lautner, M., et al. Disparities in the Use of Breast-Conserving Therapy Among Patients With Early-Stage Breast Cancer. Journal of the American Medical Association Surgery. 150 (8), 778-786 (2015).
  2. Lowery, A., Kell, M., Glynn, R., Kerin, M., Sweeney, K. Locoregional recurrence after breast cancer surgery a systematic review by receptor phenotype. Breast Cancer Research and Treatment. 133, 831-841 (2012).
  3. Kim, M. Y., et al. Tumor Self-Seeding by Circulating Cancer Cells. Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).
  4. Vilalta, M., Rafat, M., Giaccia, A. J., Graves, E. E. Recruitment of Circulating Breast Cancer Cells Is Stimulated by Radiotherapy. Cell Reports. 8 (2), 402-409 (2014).
  5. Rafat, M., et al. Macrophages Promote Circulating Tumor Cell-Mediated Local Recurrence following Radiotherapy in Immunosuppressed Patients. 암 연구학. 78 (15), 4241-4252 (2018).
  6. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
  7. Simian, M., Hirai, Y., Navre, M., Werb, Z., Lochter, A., Bissell, M. J. The interplay of matrix metalloproteinases, morphogens and growth factors is necessary for branching of mammary epithelial cells. Development. 128, 3117-3131 (2001).
  8. Shamir, E. R., et al. Twist1-induced dissemination preserves epithelial identity and requires E-cadherin. Journal of Cell Biology. 204 (5), 839-856 (2014).
  9. Ewald, A. J., Brenot, A., Duong, M., Chan, B. S., Werb, Z. Collective Epithelial Migration and Cell Rearrangements Drive Mammary Branching Morphogenesis. Developmental Cell. 14, 570-581 (2008).
  10. Nguyen-Ngoc, K. -. V., et al. ECM microenvironment regulates collective migration and local dissemination in normal and malignant mammary epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (19), E2595-E2604 (2012).
  11. Nguyen-Ngoc, K. -. V., Shamir, E. R., Huebner, R. J., Beck, J. N., Cheung, K. J., Ewald, A. J. 3D Culture Assays of Murine Mammary Branching Morphogenesis and Epithelial Invasion. Tissue Morphogenesis: Methods and Protocols. 1189, 135-162 (2015).
  12. Ewald, A. J. Isolation of mouse mammary organoids for long-term time-lapse imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 8 (2), 130-133 (2013).
  13. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews. , (2018).
  14. DeNardo, D. G., et al. CD4+T Cells Regulate Pulmonary Metastasis of Mammary Carcinomas by Enhancing Protumor Properties of Macrophages. Cancer Cell. 16 (2), 91-102 (2009).
  15. Plaks, V., et al. Adaptive Immune Regulation of Mammary Postnatal Organogenesis. Developmental Cell. 34 (5), 493-504 (2015).
  16. Mandl, I., McLennan, J. D., Howes, E. L. Isolation and Characterization of Proteinase and Collagenase Fromcl. Histolyticum. The Journal of Clinical Investigation. 32, 1323-1329 (1953).
  17. Mandl, I., Zaffuto, S. F. Serological Evidence for a Specific Clostridium histolyticum Geltinase. The Journal of General Microbiology. 18, 13-15 (1958).
  18. Bond, M. D., Van Wart, H. E. Characterization of the Individual Collagenases from Clostridium histolyticum. 생화학. 23 (13), 3085-3091 (1984).
  19. Zhang, L., et al. Establishing estrogen-responsive mouse mammary organoids from single Lgr5+cells. Cellular Signalling. 29, 41-51 (2016).
  20. Sokol, E. S., Miller, D. H., Breggia, A., Spencer, K. C., Arendt, L. M., Gupta, P. B. Growth of human breast tissues from patient cells in 3D hydrogel scaffolds. Breast Cancer Research. 18 (1), 1-13 (2016).
  21. Richert, M. M., et al. An atlas of mouse mammary gland development. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (2), 227-241 (2000).
  22. Maier, P., Hartmann, L., Wenz, F., Herskind, C. Cellular pathways in response to ionizing radiation and their targetability for tumor radiosensitization. International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), (2016).
  23. LaBarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture. Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).
  24. Campbell, J. J., Botos, L. A., Sargeant, T. J., Davidenko, N., Cameron, R. E., Watson, C. J. A 3-D in vitro co-culture model of mammary gland involution. Integrative Biology (United Kingdom). 6, 618-626 (2014).
  25. Chanson, L., et al. Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 14 (7), 2293-2306 (2011).
  26. Chua, A. C. L., Hodson, L. J., Moldenhauer, L. M., Robertson, S. A., Ingman, W. V. Dual roles for macrophages in ovarian cycle-associated development and remodelling of the mammary gland epithelium. Development. 137, 4229-4238 (2010).
  27. Gregoire, F. M., Smas, C. M., Sul, H. S. Understanding Adipocyte Differentiation. Physiological Reviews. 78 (3), 783-809 (1998).
  28. Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current Methods of Adipogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).
  29. Gabryś, D., Greco, O., Patel, G., Prise, K. M., Tozer, G. M., Kanthou, C. Radiation Effects on the Cytoskeleton of Endothelial Cells and Endothelial Monolayer Permeability. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 69 (5), 1553-1562 (2007).
  30. Ewald, A. J. Practical considerations for long-term time-lapse imaging of epithelial morphogenesis in three-dimensional organotypic cultures. Cold Spring Harbor Protocols. 8, 100-117 (2013).
  31. Zhang, M., et al. A high M1/M2 ratio of tumor-associated macrophages is associated with extended survival in ovarian cancer patients. Journal of Ovarian Research. 7 (1), 1-16 (2014).
  32. Ma, J., Liu, L., Che, G., Yu, N., Dai, F., You, Z. The M1 form of tumor-associated macrophages in non-small cell lung cancer is positively associated with survival time. BioMed Central Cancer. 10, 112 (2010).
check_url/kr/59293?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Hacker, B. C., Gomez, J. D., Batista, C. A. S., Rafat, M. Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands. J. Vis. Exp. (147), e59293, doi:10.3791/59293 (2019).

View Video