Mammary bezlerinden ışınlanmış Organoidlerin büyüme ve karakterizasyonu
Summary
Fare meme bezlerinden geliştirilen organoidler ışınlanmış ve epitelyal özellikleri ve immün hücrelerle etkileşimleri değerlendirmek için karakterize edilmiştir. Işınlanmış organoids daha iyi radyal normal dokuda tümör hücre işe neden olabilir hücre hücre etkileşimleri değerlendirmek için kullanılabilir.
Abstract
Sindirilmiş dokudan elde edilen organoidler çok hücreli üç boyutlu (3D) daha iyi hücre monolayerlere kıyasla vivo koşullarda özetlemek yapıları vardır. Tamamen içinde vivo karmaşıklık modeli olamaz rağmen, onlar orijinal organ bazı işlevselliği korumak. Kanser modellerinde, organoids yaygın tümör hücre istilası çalışmak için kullanılır. Bu protokol, normal dokularda radyasyon tepkisi değerlendirmek için normal ve ışınlanmış fare meme bezi dokusu organoids geliştirmek ve karakterize amaçlamaktadır. Bu organoidler, radyasyonlu organoidlerle tümör hücresi etkileşimlerini değerlendirmek için gelecekteki in vitro kanser çalışmalarına uygulanabilir. Mammary bezleri, 20 GY ‘ye ışınlanmış ve kolajenaz VIII çözeltisi içinde sindirilmiş, rezeke edildi. Epitelyal organoidler Santrifüjlü farklılaşma yoluyla ayrıldı ve 96-iyi düşük yapışkanlık mikroplaklarda 3D organoidler geliştirilmiştir. Organoids karakteristik epitelyal Marker Sito 14 ifade. Ortak kültür deneylerinde organoidlerle makrophaj etkileşimi gözlenmiştir. Bu model tümör-stromal etkileşimleri, bağışıklık hücrelerinin infiltrasyonu ve radyasyonlu bir mikroçevre içinde makrophaj polarizasyon okumak için yararlı olabilir.
Introduction
Üçlü negatif meme kanseri (TNBC) hastalarının yaklaşık% 60 ‘ i meme arıtma terapisi (BCT) tedavi formu olarak seçilir1. Bu tedavi modalitesi, meme dokusunun bir kısmını içeren tümör kaldırılır, ve çevredeki normal doku herhangi bir kalıntı tümör hücrelerini öldürmek için iyonlaştırıcı radyasyona maruz kalır. Tedavi meme kanseri nüfusunun çoğunu tekrarı azaltır; Ancak TNBC ile tedavi edilen hastaların yaklaşık% 13,5 ‘ si, bölgesel nüks2. Bu nedenle, radyasyonun nasıl dolaşabilir tümör hücrelerini (ctcs) araştırarak yerel nüks3,4içine önemli anlayışlar yol açacaktır.
Önceki çalışma normal doku radyasyonun çeşitli hücre türleri işe artırdığını göstermiştir5. TNBC ‘nin klinik öncesi modellerinde, normal dokuların ışınlanması makrophaj ve sonra tümör hücresi alımı normal dokulara5‘ e yükseldi. İmmün durum bağışıklık sistemi etkilenen konularda gözlenen tümör hücre göç ile, ışınlanmış sitelere tümör hücre işe etkilediği. Meme bezlerinden elde edilen organoidleri kullanarak bu etkileşimlerin reapitasyonu, hücre göçü ve hücre-stromal etkileşimlerini gerçek zamanlı olarak mikroskopi ve canlı hücre görüntüleme ile gözlemlemek, radyasyon hasarının rolünü belirlemek için tümör hücre davranışı.
Fare meme organoids Meme bezinin gelişiminde önemli adımlar aydınlatmak yardımcı oldu. Bir meme nevuslardır, 50 μm6,7,8,9,10‘ dan daha büyük olan yalıtılmış meme epitelin bir çok hücreli, üç boyutlu yapısıdır. Primer epitelyal organoidleri kullanarak, Simian ve al. meme bezinde dallanma için gerekli faktörler değerlendirildi7. Shamir ve ark. yaygınlaştırma, epitelyal geçiş için epitel olmadan ortaya çıkabilir, metastaz Cascade8içine anlayış sağlayan keşfetti. Meme bezi dokusundan organoidlerin oluşturulması ve karakterize edilmesi için yöntemler iyi kurulmuştur6,11,12,13. Ancak, bilgimize, meme bezlerinden ışınlanmış organoidlerin büyüyen yöntemleri bildirilmemiştir. Radyasyon kaynaklı bağışıklık ve tümör hücresi işe alma reapitulating için bir protokol büyüyen ve ışınlanmış organoids karakterize için kritik bir adım olacaktır.
Bu yazıda, küre oluşumunu destekleyen bir hidrofilik polimer ile kaplı düşük yapışkanlık mikroplaklarda ışınlanmış meme epitelyal organoidleri büyüyen ve karakterize etmek için bir yöntem bildiriyoruz. Bu organoidler, immün hücre infiltrasyonu kinetiği incelemek için makrofajlar ile birlikte Kültürlenmiş. Bu çalışma, meme özellikleri, göğüs kanseri hücrelerinin tümör hücre işe alma görselleştirmek için adipoz hücreleri ile Co-kültürü organoids dahil etmek için genişletilebilir ve tümör-immün hücre etkileşimlerini incelemek için CD8 + T hücreleri. Daha önce kurulan protokoller ışınlanmış organoidleri değerlendirmek için kullanılabilir. Önceki modeller meme organoidleri ve bağışıklık hücrelerinin ortak kültür metastaz ve yayma mekanizmaları ışık dökmeye. DeNardo ve al. bu CD4 + T hücre yönetmeliğinin ilişkili makrofajlar meme adenokarsinomların metastatik phenoype geliştirilmiş bulundu14. Co-kültür modelleri de biyolojik gelişim mekanizmaları aydınlatmak için kullanılmıştır. Plaks ve ark., meme organogenezi15‘ in aşağı regülatörleri olarak CD4 + T hücrelerinin rolünü açıklığa kavuşturuldu. Ancak, grubumuz normal doku ışınlarının bağışıklık hücresi davranışlarını nasıl etkilediğini görselleştirerek ilk kez bir prosedür oluşturmaktır. Çünkü normal doku ışınlama tümör hücre işe alma geliştirmek için gösterilmiştir5, bu protokol daha büyük bir anlayış önde gelen, normal doku ve hücrelerin radyasyon ile nasıl değişmiş tümör hücre davranışını analiz etmek için geliştirilmiş olabilir Kanser nüks.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokolde, ışınlanmış meme organoidlerin tekrarlanabilir büyümesi ve karakterize edilmesi için bir yöntem geliştirdik (Şekil 1). Tümör hücresi işe alma5‘ in vivo modellerinin önceki yansımaları Için 20 GY ışınlama dozu uygulandı. Meme bezlerinin ışınlanması ex vivo önce nevuslardır oluşumu bağışıklık hücrelerinin karşılık gelen infiltrasyon olmadan radyasyon hasar etkileri yalıtım için izin. Bir in vitro ışınlanmış no…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz GFP ve dTomato etiketli RAW 264,7 macrofajlar sağlamak için Dr Laura L. Bronsart teşekkür ederiz. Bu araştırma NıH Grant #R00CA201304 tarafından mali olarak destekleniyordu.
Materials
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 16004-128 | |
| Anti-cytokeratin 14 | abcam | ab181595 | Lot: GR3200524-3 |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A1933-25G | |
| Collagen Type I | Corning | 354236 | |
| Collagenase from Clostridium Histolyticum, Type VIII | Sigma | C2139 | |
| Collagenase I | Gibco | 17018029 | |
| DMEM/F12 | Thermofisher | 11320-033 | |
| DNAse | Roche | 10104159001 | |
| DPBS | Fisher | 14190250 | |
| E-Cadherin | Cell Signaling | 24E10 | Lot: 13 |
| FBS | Sigma | F0926 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750 | |
| Goat anti-rabbit secondary | abcam | ab150077 | green Lot: GR3203000-1 |
| Goat anti-rabbit secondary | abcam | ab150080 | red Lot: GR3192711-1 |
| Hoechst 33342 | Fisher | 62249 | Lot: TG2611041 |
| Insulin (10 mg/mL) | Sigma | I9278 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium, 100x | Gibco | 51500-056 | |
| Matrigel Basement Membrane (basement membrane extracted from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma) | Corning | 356237 | |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| Nuclon Sphera 96 well plates | Thermo | 174927 | |
| PBS | VWR | 10128-856 | |
| Pen/strep | Fisher | 15140122 | |
| Phalloidin | abcam | ab176757 | Lot: GR3214582-16 |
| Tight Junction Protein 1 | Novus | NBP1-85047 | Lot: C115428 |
| Triton X-100 (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol) | Sigma | X100-100ML | |
| Trypsin | Gibco | 27250-018 | |
| Tween-20 (Polyethylene glycol sorbitan monolaurate) | Sigma | P1379-100ML |
References
- Lautner, M., et al. Disparities in the Use of Breast-Conserving Therapy Among Patients With Early-Stage Breast Cancer. Journal of the American Medical Association Surgery. 150 (8), 778-786 (2015).
- Lowery, A., Kell, M., Glynn, R., Kerin, M., Sweeney, K. Locoregional recurrence after breast cancer surgery a systematic review by receptor phenotype. Breast Cancer Research and Treatment. 133, 831-841 (2012).
- Kim, M. Y., et al. Tumor Self-Seeding by Circulating Cancer Cells. Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).
- Vilalta, M., Rafat, M., Giaccia, A. J., Graves, E. E. Recruitment of Circulating Breast Cancer Cells Is Stimulated by Radiotherapy. Cell Reports. 8 (2), 402-409 (2014).
- Rafat, M., et al. Macrophages Promote Circulating Tumor Cell-Mediated Local Recurrence following Radiotherapy in Immunosuppressed Patients. 암 연구학. 78 (15), 4241-4252 (2018).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
- Simian, M., Hirai, Y., Navre, M., Werb, Z., Lochter, A., Bissell, M. J. The interplay of matrix metalloproteinases, morphogens and growth factors is necessary for branching of mammary epithelial cells. Development. 128, 3117-3131 (2001).
- Shamir, E. R., et al. Twist1-induced dissemination preserves epithelial identity and requires E-cadherin. Journal of Cell Biology. 204 (5), 839-856 (2014).
- Ewald, A. J., Brenot, A., Duong, M., Chan, B. S., Werb, Z. Collective Epithelial Migration and Cell Rearrangements Drive Mammary Branching Morphogenesis. Developmental Cell. 14, 570-581 (2008).
- Nguyen-Ngoc, K. -. V., et al. ECM microenvironment regulates collective migration and local dissemination in normal and malignant mammary epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (19), E2595-E2604 (2012).
- Nguyen-Ngoc, K. -. V., Shamir, E. R., Huebner, R. J., Beck, J. N., Cheung, K. J., Ewald, A. J. 3D Culture Assays of Murine Mammary Branching Morphogenesis and Epithelial Invasion. Tissue Morphogenesis: Methods and Protocols. 1189, 135-162 (2015).
- Ewald, A. J. Isolation of mouse mammary organoids for long-term time-lapse imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 8 (2), 130-133 (2013).
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews. , (2018).
- DeNardo, D. G., et al. CD4+T Cells Regulate Pulmonary Metastasis of Mammary Carcinomas by Enhancing Protumor Properties of Macrophages. Cancer Cell. 16 (2), 91-102 (2009).
- Plaks, V., et al. Adaptive Immune Regulation of Mammary Postnatal Organogenesis. Developmental Cell. 34 (5), 493-504 (2015).
- Mandl, I., McLennan, J. D., Howes, E. L. Isolation and Characterization of Proteinase and Collagenase Fromcl. Histolyticum. The Journal of Clinical Investigation. 32, 1323-1329 (1953).
- Mandl, I., Zaffuto, S. F. Serological Evidence for a Specific Clostridium histolyticum Geltinase. The Journal of General Microbiology. 18, 13-15 (1958).
- Bond, M. D., Van Wart, H. E. Characterization of the Individual Collagenases from Clostridium histolyticum. 생화학. 23 (13), 3085-3091 (1984).
- Zhang, L., et al. Establishing estrogen-responsive mouse mammary organoids from single Lgr5+cells. Cellular Signalling. 29, 41-51 (2016).
- Sokol, E. S., Miller, D. H., Breggia, A., Spencer, K. C., Arendt, L. M., Gupta, P. B. Growth of human breast tissues from patient cells in 3D hydrogel scaffolds. Breast Cancer Research. 18 (1), 1-13 (2016).
- Richert, M. M., et al. An atlas of mouse mammary gland development. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (2), 227-241 (2000).
- Maier, P., Hartmann, L., Wenz, F., Herskind, C. Cellular pathways in response to ionizing radiation and their targetability for tumor radiosensitization. International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), (2016).
- LaBarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture. Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).
- Campbell, J. J., Botos, L. A., Sargeant, T. J., Davidenko, N., Cameron, R. E., Watson, C. J. A 3-D in vitro co-culture model of mammary gland involution. Integrative Biology (United Kingdom). 6, 618-626 (2014).
- Chanson, L., et al. Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 14 (7), 2293-2306 (2011).
- Chua, A. C. L., Hodson, L. J., Moldenhauer, L. M., Robertson, S. A., Ingman, W. V. Dual roles for macrophages in ovarian cycle-associated development and remodelling of the mammary gland epithelium. Development. 137, 4229-4238 (2010).
- Gregoire, F. M., Smas, C. M., Sul, H. S. Understanding Adipocyte Differentiation. Physiological Reviews. 78 (3), 783-809 (1998).
- Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current Methods of Adipogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).
- Gabryś, D., Greco, O., Patel, G., Prise, K. M., Tozer, G. M., Kanthou, C. Radiation Effects on the Cytoskeleton of Endothelial Cells and Endothelial Monolayer Permeability. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 69 (5), 1553-1562 (2007).
- Ewald, A. J. Practical considerations for long-term time-lapse imaging of epithelial morphogenesis in three-dimensional organotypic cultures. Cold Spring Harbor Protocols. 8, 100-117 (2013).
- Zhang, M., et al. A high M1/M2 ratio of tumor-associated macrophages is associated with extended survival in ovarian cancer patients. Journal of Ovarian Research. 7 (1), 1-16 (2014).
- Ma, J., Liu, L., Che, G., Yu, N., Dai, F., You, Z. The M1 form of tumor-associated macrophages in non-small cell lung cancer is positively associated with survival time. BioMed Central Cancer. 10, 112 (2010).
