Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att producera en oral vaccinkandidat mot Typ1-diabetes i en växt.
Abstract
Anläggningen molekylär jordbruk är användningen av växter att producera molekyler av intresse. I detta perspektiv kan växter användas både som bioreaktorer för produktion och efterföljande rening av slutprodukten och för direkta muntliga leverans av heterologa proteiner när du använder ätbara växtarter. I detta arbete presenterar vi utvecklingen av en kandidat oralt vaccin mot typ 1-Diabetes (T1D) i ätbar växt-system som använder dekonstrueras växt virus-baserat rekombinant DNA-teknik, levereras med vakuum infiltration. Våra resultat visar att en Rödbetssallad är en lämplig värd av övergående uttryck för en mänsklig härledda autoantigen associerade till T1D, betraktas som en lovande kandidat som T1D vaccin. Bladen som producerar autoantigen karakteriserades grundligt för deras motstånd mot gastric matsmältningen, förekomsten av kvarvarande bakteriell kostnad och deras sekundära metabola profilen, ger en översikt av processen produktionen för den potentiella användningen av växter för direkta muntliga leverans av ett heterologt protein. Vår analys visade nästan fullständig nedbrytning av den frystorkade kandidat oralt vaccin efter en simulerad gastric matsmältningen, vilket tyder på att det krävs en inkapsling strategi för tillverkning av det vegetabiliska GAD-vaccinet.
Introduction
Sedan anläggningen molekylärbiologiska revolutionen 1980-talet, kan växt-baserade system för produktion av biologiska läkemedel betraktas som ett alternativ till traditionella system baserat på mikrobiell och däggdjurs celler1. Växter visas flera fördelar jämfört med traditionella plattformar, med skalbarhet, kostnadseffektivitet och säkerheten är den mest relevanta2. Rekombinant produkten kan renas från transformerade växtvävnad och sedan administreras, antingen parenteralt eller peroralt och dessutom omvandlade ätliga växt kan användas direkt för muntliga leverans. Oralt främjar samtidigt slemhinnor och systemisk immunitet, och det eliminerar behovet av nålar och specialiserad medicinsk personal. Dessutom eliminerar muntliga leverans komplexa nedströms bearbetning, som normalt står för 80% av den totala tillverkningskostnaden för en rekombinant protein3. Alla dessa fördelar kan översättas till besparingar i produktion, leveranser och arbetskraft minskade kostnader för varje dos, vilket gör drogen överkomliga för de flesta av världens befolkning.
Flera strategier, både för stabil omvandling och övergående uttryck, utvecklades för produktion av rekombinanta proteiner i växter. Bland dem ger en hög avkastning dekonstrueras växt virus-baserade uttryck system (t.ex. magnICON) överlägsen prestanda leder hög avkastning av rekombinanta proteiner över relativt korta tidsskalor4. Många exempel på övergående uttryck med hjälp av växten virus-baserade uttryck systemet i Nicotiana benthamiana växter är rapporterade, att vara guldmyntfot produktion värden. Denna modell växt betraktas dock inte som en ätliga arter på grund av alkaloider och andra toxiska metaboliter som ackumuleras i dess blad.
I detta arbete, beskriver vi jämförelsen mellan två ätliga växt system, rödbeta (Beta vulgaris cv Moulin Rouge) och spenat (Spinacea oleracea cv Industria), av uttryck för två kandidat former av den 65 kDa isoformen av glutaminsyra dekarboxylas (GAD65), utförs av växten virus-baserat vektorer5. GAD65 är en större autoantigen som är associerade till typ 1-Diabetes (T1D) och det är för närvarande under utredning i kliniska prövningar att förhindra eller fördröja T1D genom att inducera tolerans6. Produktionen av GAD65 i växter har studerats i modell växtarter som Nicotiana tabacum och N. benthamiana4,5,6,7. Här, beskriver vi användningen av ätliga växter för framställning av molekylen i vävnader som kan vara tänkt för en muntlig direktleverans. Från en teknisk synpunkt, vi studerat och valt systemet för växt agroinfiltration och ätliga växt plattformen för GAD65 produktion genom att utvärdera olika parametrar: uttrycket rekombinant protein nivåer, kvarstående mikrobiell laddningen i anläggningen vävnad som betytt för muntliga leverans, motståndet av GAD65 att gastric matsmältningen och bioekvivalens mellan transformerade växterna med vild typ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. röda betor och spenat odling
- Växa Rödbetssallad (B. vulgaris cv Moulin Rouge) och spenat (S. oleracea cv Industria) växter i en kammare som tillväxt, med 150 µE ljusintensitet, 65% relativ luftfuktighet, 12 h ljus/mörk cykel i 23/21 ° C, respektive.
- Efter frögroning, gödsla växterna två gånger i veckan med en 1 g/L lösning av ett kommersiellt tillgängliga gödselmedel (Tabell för material). Använd fem veckor gamla spenat och sex veckor gamla Rödbetssallad växter för agroinfiltration.
2. övergående uttryck genom dekonstrueras växt virus-baserad teknik
- Byggandet av anläggningen uttryck vektorer
- Införa vektorer - 5' modulen (pICH20111), de 3' moduler (pICH31070.GAD65mut, pICH31070.∆87G65mut och pICH7410.eGFP), beredda som tidigare beskrivits1,2,7och Integras modulen (pICH14011)- Agrobacterium tumefaciens GV3101 stam med standardtekniker. Växer på LB medium innehållande 50 μg/mL rifampicin och lämpliga vektor-specifika antibiotika (50 μg/mL carbenicillin för pICH20111, pICH14011 och pICH7410.eGFP), 50 μg/mL kanamycin för pICH31070 för 2 dagar vid 28 ° C.
- Skärmen kolonierna av kolonin PCR med följande specifika primers för varje vektor: 5'-ATCTAAGCTAGGGTACCTCG-3' och 5'-ACACCGTAAGTCTATCTCTTC-3' för både 3' moduler pICH31070.GAD65mut och pICH31070.∆87G65mut, med en glödgning temperatur 55 ° c och en töjning tid av 110 s, 5'-TGAAGTTCATCTGCACCAC-3' och 5'-ACACCGTAAGTCTATCTCTTC-3' för den tredje 3' modul pICH7410.eGFP, med en glödgning temperatur av 53 ° C och en töjning 30 s, 5'-AATGTCGATAGTCTCGTACG-3' och 5'-TCCACCTTTAACGAAGTCTG-3' för 5' modulen, med en glödgning temperatur av 53 ° C och en töjning 20 s och 5'-GGCAACCGTTATGCGAATCC-3' och 5'-GATGCGTTCCGCAACGAACT-3' för Integras modulen med en glödgning temperatur på 57 ° C och en töjning 45 s.
- Utföra PCR-reaktionen i en total volym på 20 μL använder följande specifik reaktion cykel: 5 min inledande denaturering vid 95 ° C, 35 cykler av 30 s vid 95 ° C, 30 s vid glödgning temperatur och töjning steg vid 72 ° C (glödgning temperatur och töjning tid en Re som är specifika för varje primer par) och ett sista töjning steg 7 min vid 72 ° C.
- Spruta agroinfiltration
- Inokulera de tre A. tumefaciens transformants i 50 mL LB medium innehållande 50 μg/mL rifampicin och följande lämpliga vektor-specifika antibiotika: 50 μg/mL carbenicillin för A. tumefaciens omvandlas med pICH20111, pICH14011 eller pICH7410.eGFP, eller 50 μg/mL kanamycin för A. tumefaciens omvandlas med pICH31070. Växa genom att skaka över natten vid 28 ° C.
- Pellet övernattning bakteriekulturer genom centrifugering vid 4500 x g i 20 min och återsuspendera dem i 100 mL (eller två volymer av den ursprungliga bakteriella kulturen) infiltration buffert innehållande 10 mM 4-morpholineethanesulfonic syra (MES; pH 5,5) och 10 mM MgSO4, utan att beakta OD600. Inkubera upphängningarna vid rumstemperatur (RT) för 3 h.
- Blanda lika stora volymer av bakteriell suspensioner som innehåller en av de tre modulerna, GAD65mut, ∆87GAD65mut eller andra 3' modul, med 5' modul och Integras modul. Använda suspension mixen för spruta infiltration av röda betor och spenat blad.
- Placera 5 mL av suspensionen i en spruta utan nålen. Tryck på spetsen av sprutan mot undersidan av bladet för både spenat och rödbeta växter och samtidigt tillämpa en skonsam counterpressure till andra sidan av bladet.
- Infiltrera tre första helt utökad bladen från spetsen för varje planta. Etikett agroinfiltrated bladen med en papper-tagg på leaf stammen. Returnera växterna i en tillväxt kammare under standart villkorar.
Observera: För hälso-och säkerhetsskäl bära skyddsglasögon och handskar under infiltration process. - Samla agroinfiltrated lämnar från 4 till 14 dagar efter infektion (dpi) och frysa dem i flytande kväve. Store växtvävnad vid-80 ° C.
- Vakuum agroinfiltration
- Växa separat i tre A. tumefaciens transformants i 50 mL LB medium innehållande 50 μg/mL rifampicin och lämpliga vektor-specifika antibiotika genom att skaka över natten vid 28 ° C.
- Pellet övernattning bakteriekulturer genom centrifugering vid 4500 x g i 20 min. återsuspendera pelleten i 1 L infiltration buffert till en OD600 av 0,35 och inkubera upphängningarna på RT för 3 h.
- Lägga till 0,01% v/v i tvättmedel (polysorbat 20) varje suspension. Blanda lika stora volymer av bakteriell suspensioner som innehåller en av de tre modulerna, GAD65mut, ∆87GAD65mut eller andra 3' modul, med 5' modul och Integras modul.
- Infoga en växt (sex veckor gamla Rödbetssallad växt, se avsnitt 1) i hållaren. Invertera hållaren och placera ovanpå en bägare som innehåller infiltration badet (2 L) att doppa Bladen i infiltration avstängning.
Anmärkning: Se till att alla bladen helt doppas i bakteriesuspensionen. Höja nivån med tillägg av extra infiltration fjädring vid behov. - Överföra infiltration badet med nedsänkt växten till infiltration kammare och stänga den. Slå på vakuumpumpen och öppna vakuum insugsventilen på infiltration kammare.
- När trycket i infiltration kammare har minskat till 90 mbar, hålla vakuum för 3 min. Release vakuum för 45 s. När infiltration kammare har återgått till atmosfärstryck, öppna kammaren och ta bort infiltrerade anläggningen från bakteriell badet.
- Returnera växterna i en tillväxt kammare under standart villkorar.
- Samla agroinfiltrated blad på maximalt uttryck dpi, beroende på rekombinanta proteinet, och frysa dem i flytande kväve. Store växtvävnad vid-80 ° C.
3. rekombinant protein uttryck analys
- Totalt lösligt protein (TSP) utvinning
- Slipa på sprutan eller vakuum infiltrerat röda betor och spenat blad, som samlats in i steg 2.2.6 och 2.3.8, till fint pulver i flytande kväve med mortel. Överför pulvret till 15 mL plaströr och lagra materialet vid-80 ° C.
- Tillsätt 900 µL av utvinning buffert (50 mM natriumfosfat pH 8,0, 20 mM natriummetabisulfit) 300 mg bladpulver.
Obs: Valda förhållandet mellan växt vävnaden vikt (mg) till buffert volym (µL) är 1:3. - Homogenisera blandningen av vortexa för 1 min, sedan Centrifugera 30 000 x g under 40 minuter vid 4 ° C.
- Samla in supernatanten i en ren slang och lagra det vid-80 ° C.
- Anläggningen andra visualisering och kvantifiering
- Ladda 100 µL av varje tsk extrakt som erhålls från andra uttrycker blad, i tre tekniska replikat, på en plattan med 96 brunnar.
- Sätt plattan med 96 brunnar i en fluorescens läsare och starta mätningen. Använda filtret 485/535 nm inställd krävs för andra fluorescens upptäckt.
- För absolut kvantifiering, i samma platta förbereda en kalibreringskurva lastning olika kvantiteter (62,5, 125, 500, 750 och 1000 ng) av en renad andra.
- Bicinchoninic syra (BCA) analys för tsk kvantifiering
- Blanda 50 delar av reagens A (Tabell för material) med 1 del av reagens B (Tabell för material). Förbereda tillräcklig volym av färska BCA fungerande lösning för proverna analyseras och kalibrering standarder.
Obs: Volymen av BCA fungerande lösning krävs för varje prov är 1,9 mL. För det normala förfarandet med 9 normer (inklusive en tom), krävs 17,1 mL av BCA fungerande lösning. - Pipettera 0,1 mL av varje standard (inklusive en tom) och tsk extrakt i ett märkta rör.
Obs: Som kalibrering standarder, förbereda en ny uppsättning av bovint serumalbumin (BSA) standarder i intervallet 10-1000 μg/mL, helst med samma spädningsvätska som prover, såsom vatten. Tomrummet består av 0,1 mL av spädningsvätskan användas för kalibrering standard och provberedning. - Lägg till 1,9 mL arbetslösning BCA och blanda väl. Täck rören och inkubera vid 37 ° C i 30 min.
- Cool rören för att RT. mäta absorbansen vid 562 nm av alla prover inom 10 min.
Obs: Även vid RT, färgutvecklingen fortsätter. Inga betydande fel kommer att införas om absorbansen mätningar av alla rör är klar inom 10 min. - Subtrahera absorptionsvärdet 562 nm av Tom från avläsningarna av standarderna och tsk extrakt.
- Tomt i blank-korrigerade 562 nm läsning för varje standard på dess koncentration. Att bestämma proteinkoncentration varje tsk extrakt.
- Blanda 50 delar av reagens A (Tabell för material) med 1 del av reagens B (Tabell för material). Förbereda tillräcklig volym av färska BCA fungerande lösning för proverna analyseras och kalibrering standarder.
- Utföra Coomassie gel färgning som tidigare beskrivits i Gecchele et al.8.
- Western blot analys
- Utföra western blot analys som tidigare beskrivs i Gecchele et al.8.
- Efter elektroforetisk separation av proteiner, överföra dem på en nitrocellulosa membran med standardtekniker. Bered den blockerande genom att blanda 4% mjölk i fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) pH 7,4. Blockera membranet med 10 mL av blockerande lösningen på RT för 1 h.
- Förbereda den kanin primär antikroppen på 1:10,000 för anti-GAD65/67 och anti-LHCB2 och på 1:20,000 för den anti-andra i 5 mL blockerande lösning med 0,1% tvättmedel. Inkubera membranet med de förberedda primära antikropp lösningarna över natten vid 4 ° C eller 4 h på RT med ständig agitation.
- Kassera den primär antikroppen och tvätta membranet 3 gånger för 5 min varje med blockerande lösning innehållande 0,1% tvättmedel.
- Förbereda pepparrotsperoxidas (HRP)-konjugat anti-kanin-antikropp på 1:10,000 i att blockera lösning med 0,1% tvättmedel. Inkubera membranet för 1,5 h på RT med ständig agitation.
- Kassera den sekundära antikroppen och tvätta membranet 5 gånger för 5 min varje med PBS-T (PBS kompletteras med 0,1% tvättmedel).
- Inkubera membranet med en kommersiellt tillgänglig urin lösningen enligt tillverkarens anvisningar. Detektera signalen med en chemiluminescence bildsystem.
4. anläggningen bearbetning
- Skörd av vakuum agroinfiltrated ∆87GAD65mut-uttryckande röd betorna avgår uttryck peak (11 dpi) och frysa dem i flytande kväve.
- Lyophilize frysta bladen för 72 h vid-50 ° C och 0,04 mbar. Lagra dem vid-80 ° C.
- Slipa bladen till fint pulver och lagra den på RT i förseglade behållare med silikagel att utesluta fukt.
5. gastric matsmältningen simulering och cell integritet analys
- Gastric matsmältningen simulering
- Väger 100 mg av slipade frystorkade Rödbetssallad blad och återsuspendera det i 6 mL PBS (pH 7,4).
- Justera prov pH 2 med 6 M HCl.
- Lägga till 4 mg/mL pepsin från svin magslemhinnan i 10 mM HCl att få en sista pepsin koncentration av 1 mg/mL eller ett förhållande på 1:20 till totala lösliga proteiner. Skaka provet vid 37 ° C i 120 min.
- Justera pH 8 med 1 M NaOH att inaktivera pepsin proverna.
- Centrifugera 750 µL portioner av varje prov på 20 000 x g i 20 min vid 4 ° C. Samla in separat supernatanten och återsuspendera pelleten i en supernatant volym för lastning buffert (1,5 M Tris HCl, pH 6.8, 3% SDS, 15% glycerol och 4% 2-merkaptoetanol).
Obs: För hälso-och säkerhetsskäl bär handskar och arbeta under spiskåpa för provberedning. - Analysera både supernatanten och den återsuspenderade pelleten genom western blot analys8.
- Cell integritet analys
- Förbered två prover av 100 mg av slipade frystorkade Rödbetssallad blad och resuspendera både i 6 mL PBS (pH 7,4).
- Justera pH-värdet i bara ett provexemplar till 2 med 6 M HCl. skaka båda prover vid 37 ° C i 120 min.
- Centrifugera 750 µL portioner av varje prov på 20 000 x g i 20 min vid 4 ° C. Samla in separat supernatanten och återsuspendera pelleten i en supernatant volym för lastning buffert.
- Analysera både supernatanten och den återsuspenderade pelleten genom western blot analys.
6. mikrobiell analys
- Väga 100 mg frystorkade Rödbetssallad blad. Återsuspendera pulver i 8 mL steril fosfatbuffrad Koksaltlösning (pH 7,4) och virvel för 1 min.
- Förbereda det LB mediet utan antibiotika eller innehåller a 50 µg/mL rifampicin, (ii) 50 µg/mL varje rifampicin och carbenicillin, (iii) 50 µg/mL varje rifampicin och kanamycin eller (iv) 50 µg/mL varje rifampicin, carbenicillin och kanamycin.
- Tallrik 1 mL varje frystorkad leaf Homogenatet i en av de 5 selektiva LB medierna.
- Inkubera alla plattorna i 3 dagar vid 28 ° C.
- Räkna Agrobacterium kolonierna odlas på varje platta.
- Beräkna och definiera de kvarvarande bakteriell avgiften som antalet kolonin bildar enheter (CFU) per mL frystorkat leaf Homogenatet (CFU/mL).
7. metabolit utvinning
- Primära metaboliten utvinning
- Väga 30 mg-80 ° c lagras, vakuum agroinfiltrated ∆87GAD65mut-uttryckande Rödbetssallad bladpulver i en 2 mL plaströr.
- Tillsätt 750 µL kallt 70/30 (v/v) metanol/kloroform och vortex för 30 s. Inkubera vid-20 ° C i 2 h.
Obs: Alla lösningsmedel och tillsatser måste vara LC-MS grade. - Tillsätt 600 µL av kallt vatten och centrifugera vid 17,900 x g vid 4 ° C i 10 min. samla in och överföra den övre Hydroalkoholextrakt fasen i en ny 2 mL tub. Kassera den lägsta chloroformic fasen och interphasen.
- Tas proverna i en vakuum koncentrator för 3 h att avdunsta lösningsmedel.
- Lös pelleten erhållits från steg 7.1.4 i 300 µL av 50/50 (v/v) och acetonitril vatten och sonikera proverna för 3 min.
- Passera 0,2 μm membranfilter lösningarna och sätta dem i en transparent fast 300 µL infoga glasrör.
- Sekundära metabolit utvinning
- Väga 300 mg-80 ° c lagras, vakuum agroinfiltrated ∆87GAD65mut-uttryckande Rödbetssallad bladpulver i en 15 mL plaströr.
- Tillsätt 3 mL metanol, virvel för 30 s, och sonikera vid 40 kHz i 15 min.
Obs: Alla lösningsmedel och tillsatser måste vara LC-MS grade. - Centrifugera proverna vid 4500 x g vid 4 ° C i 10 min och överför supernatanterna till nya 15 mL rör.
- Utspädd 100 µL av extraktet 1:3 (v/v) med vatten och låt lösningen rinna genom ett 0,2 μm membranfilter.
- Sätta lösningen i ett transparent fast 300 µL infoga glasrör.
- Polar lipid utvinning
- Väger 200 mg-80 ° c lagras, vakuum agroinfiltrated ∆87GAD65mut-uttryckande Rödbetssallad bladpulver i en 15 mL plaströr.
- Tillsätt 200 µL av vatten och sedan 2 mL metanol, och sedan hålla på is för 1 h.
Obs: Alla lösningsmedel och tillsatser måste vara LC-MS grade. - Virvel för 30 s och sonikera vid 40 kHz i 15 min.
- Centrifugera proverna vid 4500 x g vid 4 ° C i 25 min. samla in och överföra kloroformfasens i 2 mL rör. Kassera den övre Hydroalkoholextrakt fasen och interphasen.
- Tas proverna i en vakuum koncentrator för 3 h att avdunsta lösningsmedlet.
- Lös pelleten erhållits från steg 7.3.5 med 600 µL av metanol.
- Utspädd 100 µL av extraktet 1:5 (v/v) med metanol och låt lösningen rinna genom ett 0,2-μm membranfilter.
- Sätta lösningen i ett transparent fast 300 µL infoga glasrör.
8. flytande kromatografi masspektrometri analys och databehandling
- Ställa in LC-MS systemet som rekommenderas av leverantören.
Obs: LC sektionen består av en autosampler tillsammans med HPLC utrustad med en C18 guard kolumn (75 x 2,1 mm, partikel storlek 5 µm) framför en C18 kolumn (150 x 2,1 mm, partikel storlek 3 µm) för analys av sekundära metaboliter och polära lipider , medan en HILIC vakt-kolumn (7,5 x 2,1 mm, 3 µm) framför en HILIC kolumn (150 x 2,1 mm, partikel storlek 2.7 µm). MS är en ion trap masspektrometer försedd med antingen en elektrospray jonisering (ESI) eller ett atmosfäriskt tryck kemisk jonisering (APCI) källor. - Förbereda de lämpliga lösningsmedel för HPLC Övertoningarna. För primära metabolit analys, Använd 20 mM ammonium formate som lösningsmedel A; 95% acetonitril, 5% vatten plus 10 mM ammonium formate som lösningsmedel B. För sekundära metabolit analys, använda vatten plus 0,05% myrsyra (A) och acetonitril plus 0,05% myrsyra (B). För polar lipid analys, använda vatten plus 0,05% myrsyra (A) och 100% acetonitril (B).
Obs: De lösningsmedel och tillsatser måste vara LC-MS grade. - Använd de lutningar som redovisas i tabell 1 för metaboliten eluering. Ställ den flödeshastighet på 0,2 mL/min. injicera 10 µL av varje prov för både sekundära metaboliter och polära lipider, medan injicera 5 µL för primära metaboliter.
- Förbered en kvalitetskontroll (QC) provet genom att blanda lika delar av olika prover att ha en representativ blandning av varje experimentella villkor. Analysera QC provet under experimentet att övervaka instrument effektivitet. Specifikt, infoga en QC provanalys efter varje 10 prov-parti.
- Randomize proverna för att undvika instrument-driven effekter.
- Efter 9 analyser, infoga en kolumn rengöring metod och en tom analys omedelbart efter.
Obs: Utföra en långsam övertoning mellan de två lösningsmedel med en Isokratisk eluering på hög andel det starkaste lösningsmedlet. Tomrummet består av en injektion av en ren metanol: vatten (50/50, v/v) att förbättra retention time reproducerbarhet i följande analys. - Ställ in instrumentet att förvärva masspektra i alternativa positiva och negativa jonisering lägen med hjälp av parametrar som visas i tabell 2.
Observera: Andra parametrar är beroende av specifika plattformen. - Utför nästa behandling som förklaras i Dal Santo et al.9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I detta arbete presenteras arbetsflödet för utvecklingen av ett oralt vaccin i ätbar växt vävnader. Fokus i detta arbete är ett uttryck för ett målprotein i en ätlig värd växtarter och karakterisering av de potentiella oralt vaccinet.
Det första steget innebar utvärdering av lämpligheten av växten virus-baserade uttryck tekniken att producera rekombinanta proteiner i ätbar växt-system. För detta syfte använder vi först andra som en modell protein och vi uttryckte det i två ätbara lummiga växt system: rödbeta och spenat. Plantorna var manuellt agroinfiltrated med suspensioner av A. tumefaciens transporterar andra rekombinant uttryck vektorer. Fluorescerande protein uttrycket var visualiserat genom western blot analys (figur 1A, B, D, E) och kvantifieras under UV-ljus. Resultaten visade att rödbeta systemet kännetecknas av en högre andra uttryck, att nå 544,9 ± 10,9 µg/g med färska blad vikt (FLW) vid 9 dpi (figur 1 c), än spenat, vilka maximala andra nivåer (113,4 ± 0,3 µg/g FLW) mättes på 11 dpi ( Figur 1F). Av dessa skäl valdes Rödbetssallad som uttryck värd för alla efterföljande experiment.
Enligt Chen et al.10testades andra övergående uttrycket av en vakuum metod för infiltration, som är mer lämplig för framställning av vaccin i stor skala. Olika spädningar av övernattnings A. tumefaciens kultur, allt från 10-1 till 10-3och olika koncentrationer av tvättmedel (0,005-0,05%) har testats genom att jämföra den andra ackumulering nivån vid maximal uttryck dpi (9 dpi). Resultatet finns att högre bakteriell titrar producerade större andra avkastning (10-1 ~ 0,35). Dock hittades inga signifikanta skillnader med hjälp av olika tvättmedel koncentrationer (inga data anges).
Då var plantorna vakuum infiltrerade med en A. tumefaciens suspension på 0,35 OD600 och 0,01% av tvättmedel. När uttrycket plattformen och leveranssystemet var etablerat, uttryckt av två former av GAD65, GAD65mut och en N-terminalt trunkerad form (∆87GAD65mut), jämfördes på dagen av högsta uttryck, 5 och 11 dpi, respektive, som tidigare etablerade11. Efter tsk utvinning från agroinfiltrated blad, alla prover analyserades av western blot och rekombinanta proteinet kvantifierades relativt genom densitometry analys (figur 2). Resultat markerade 20-fold högre prestanda i formuläret ∆87GAD65mut över GAD65mut. Stympad form valdes därför Rekommenderad oralt vaccinkandidat, ackumulera så högt som 201,4 ± 29,3 µg/g FLW i röda betor blad 11 dpi.
Slutligen, parametrar för utvecklingen av en potentiell oralt vaccin utvärderades. Rekombinant protein integritet efter frystorkning av vakuum infiltrerat Rödbetssallad bladen uttrycker ∆87GAD65mut bedömdes i jämförelse med den obehandlade (endast frusen) vävnad, genom western blot analys. Som visas i figur 3A, Målproteinet visat sig vara stabil efter att frystorka den.
Simulering av gastric matsmältningen genomfördes på det frystorkade materialet genom att lägga till svin mag enzymet pepsin en slutlig koncentration av 1 mg/mL eller i förhållandet 1:20 till tsk. Båda mag behandling villkor medförde rekombinant protein nedbrytningen, manifesterad genom western blot analys (figur 3 c, D, E, data rapporteras endast för pepsin slutliga koncentration av 1 mg/mL). Avsaknad av en specifik signal i pellet prover efter pepsin matsmältningen (körfält pepsin, p 1-3), föreslog att växtcellerna efter frystorkning behandling, förlorat sin integritet, vilket leder till mål protein nedbrytningen.
Utvärderingen av cellernas integritet visade att när torkade växtvävnad var resuspended i buffert med neutralt pH (pH 7,4), ∆87GAD65mut var delvis solubilized, vilket tyder på att åtminstone några celler bröts under leaf malning och torkning. Resuspension av torkade växtvävnad i sura förhållanden, ledde i stället till upptäckt av ∆87GAD65mut endast i olösliga fraktionen. Detta berodde förmodligen på ∆87GAD65mut nederbörden orsakade av låga pH, förutom proteinhalten i obruten celler11. Dessa analyser visar att frysa torkning kan väljas som behandling för beredning av vaccinet kandidaten.
Dessutom utvärderades kvarstående mikrobiell laddningen i agroinfiltrated röd-betor bladen.
Mikrobiell analysen visas att de behandlingar som utnyttjas för kandidat vaccin beredning elimineras bakteriehalten11.
Metaboliska bioekvivalens mellan ∆87GAD65mut och kontroll Rödbetssallad växter bedömdes av fingeravtryck av primära och sekundära metaboliter och polära lipider genereras av LC-MS från nio Rödbetssallad växter att uttrycka ∆87GAD65mut, nio agroinfiltrated kontroller och nio vildtyps-kontroller. PCA statistik visade ett vildtyps-växt kluster separerad från alla andra prover. Inga signifikanta skillnader belystes i stället mellan ∆87GAD65mut och infiltrerade och negativa kontrollplantorna. Dessutom var ingen signifikant skillnad mellan de tre grupperna av växter i form av polar lipidprofiler identifierade11.
Figur 1: jämförelse av andra uttryck nivåer i agroinfiltrated röda betor och spenat lämnar. Western blot analys (A, D) och motsvarande lastning kontroller (RuBisCO stora subenheten) färgas med Coomassie Brilliant Blue (B, E) av protein utdrag ur andra-uttryckande leaf prover samlas in under tidsförloppet analysen från 4 till 14 dagar efter infektion (dpi). Andra innehållet i varje protein bladextraktet kvantifierades genom fluorescens mätning (C, F). Resultaten från agroinfiltrated red-betor blad prover visas i den vänstra panelen, där agroinfiltrated spenat proverna visas i rätta. Lika mängder protein extrakt har lästs in, 3,5 µg för western blot och 30 µg för Coomassie färgningen. En anti-andra antikropp har använts som en sond i western blot analys. Sida nummer indikerar molekylär massa markörer i kDa. p.c., positiv kontroll, 10 ng av kommersiella rekombinant humant GAD65; NC, negativ kontroll, extrakt från bladen infiltrerade enbart med A. tumefaciens bär den 5'- och Integras moduler. Felstaplar representera standardavvikelsen från tre oberoende experiment. Denna siffra har ändrats från Bertini et al.11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: GAD65mut och Δ87GAD65mut nivåer i röda betor blad. Western blot analys (A) och motsvarande lastning kontroll (RuBisCo stora subenheten) färgas med Coomassie Brilliant Blue (B) av protein utdrag ur tre röda betor blad uttrycker Δ87GAD65mut (vänster) och GAD65mut (höger). En anti GAD-antikroppar har använts som en sond i western blot analys (köer som var lastade med 20 μL av extrakt för GAD65mut och 1 μL av extrakt för Δ87GAD65mut). I den Coomassie färgade gel, lästes samma volym av protein extrakt (10 μL/lane) för GAD65mut och Δ87GAD65mut. Sida nummer indikerar molekylär massa markörer i kDa. p.c., positiv kontroll, 10 ng av kommersiella rekombinant humant GAD65; NC, negativ kontroll, extrakt från bladen infiltrerade endast med A. tumefaciens bär det 5'- och Integras moduler. (C) använda western blot positiv kontroll som en referens för en Densitometrisk analys, de relativa uttrycksnivåerna för de två protein formerna är ritade. Felstaplar representera standardavvikelsen från tre oberoende experiment. Denna siffra har ändrats från Bertini et al.11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Oralt vaccin kandidat utvärdering. På vänster sida, analyser av protein stabilitet efter frystorkning behandling (A, B). Western blot analys (A) och motsvarande gel fläckade Coomassie Brilliant Blue (B) som representerar tre oberoende extrakt från bladen som uttrycker Δ87GAD65mut. Skördade blad var direkt fryst (färsk) eller frystorkade vid-50 ° C, 0,04 mbar för 72 h (frystorkad). Olika vävnader: buffert nyckeltal var anställda vid tsk utvinning för att överväga vattenförlust på grund av uttorkning. Lika stor volym av extrakt var lastade, 0,25 och 10 µL, för western blot och Coomassie färgning respektive. En anti GAD-antikroppar har använts för western blot sondera sida nummer indikerar molekylär massa markörer i kDa. NC, negativ kontroll, extrakt från bladen infiltrated enbart med A. tumefaciens bär den 5'- och Integras moduler. På höger sida, in vitro-simulerade gastric nedbrytning av Δ87GAD65mut (C, D, E). Western blot analyser (C, D) och motsvarande gel fläckade Coomassie Brilliant Blue (E) som representerar tre oberoende extrakt av blad uttrycker Δ87GAD65mut efter simulerade gastric matsmältningen. 1 mg/mL pepsin har lagts till 100 mg frystorkade vävnad, medan ett kontrollprov utan enzym har använts. 24 µL och 16 µL, för supernatanterna (s) och pellets (p) respektive erhållits i slutliga centrifugering steg, har använts för SDS-PAGE analys. Anti GAD (C) och anti-LHCB2 (D) antikroppar användes som sonder i western blot analys. Sida nummer indikerar molekylär massa markörer i kDa. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Primära metaboliter (100 min) | Tid (min) | % A | % B | Längd (min) | Typ |
| Inledande | 0 | 100 | - | Ursprungliga skick | |
| 0 | 0 | 100 | 10 | Isokratisk | |
| 10 | 15 | 85 | 15 | Lutning | |
| 25 | 15 | 85 | 5 | Isokratisk | |
| 30 | 50 | 50 | 10 | Lutning | |
| 40 | 50 | 50 | 30 | Isokratisk | |
| 70 | 0 | 100 | 1 | Lutning | |
| 71 | 0 | 100 | 29 | Isokratisk (re-equilibrium) | |
| Sekundära metaboliter (60 min) | Tid (min) | % A | % B | Längd (min) | Typ |
| Inledande | 98 | 2 | - | Ursprungliga skick | |
| 0 | 90 | 10 | 2 | Lutning | |
| 2 | 80 | 20 | 10 | Lutning | |
| 12 | 75 | 25 | 2 | Lutning | |
| 14 | 30 | 70 | 7 | Lutning | |
| 21 | 30 | 70 | 5 | Isokratisk | |
| 26 | 10 | 90 | 1 | Lutning | |
| 27 | 10 | 90 | 14 | Isokratisk | |
| 41 | 98 | 2 | 1 | Lutning | |
| 42 | 98 | 2 | 18 | Isokratisk (re-equilibrium) | |
| Polära lipider (90 min) | Tid (min) | % A | % B | Längd (min) | Typ |
| Inledande | 50 | 50 | - | Ursprungliga skick | |
| 0 | 0 | 100 | 10 | Lutning | |
| 10 | 0 | 100 | 65 | Isokratisk | |
| 75 | 50 | 50 | 1 | Lutning | |
| 76 | 50 | 50 | 14 | Isokratisk (re-equilibrium) |
Tabell 1: Gradient villkor för metaboliten eluering i LC-MS-analys.
| Masspektrometer komponenter | Funktion | Parametrar | ||||
| Primära metaboliter | Sekundära metaboliter | Polära lipider | ||||
| Elektrospray jonisering (ESI) Källa | Nebulisatorer gas | 50 psi, 350 ° C | 50 psi, 350 ° C | - | ||
| Snabbtorkande gas | 10 L min-1 | 10 L min-1 | ||||
| Atmosfäriskt tryck kemisk jonisering (APCI) Källa | Nebulisatorer gas | - | - | 50 psi, 350 ° C | ||
| Snabbtorkande gas | 10 L min-1 | |||||
| SPRIDARE | 450 ° C | |||||
| Ion trap och detektor Skanna | Fullständig genomsökning-läge | 13.000 m/z per sekund | 13.000 m/z per sekund | 13.000 m/z per sekund | ||
| 50-1.500 m/z | 50-1.500 m/z | 50-1.500 m/z | ||||
| Avsöka | 200 m/z | 400 m/z | 700 m/z | |||
| Rikta massan | ||||||
| Kollision gas | Helium | |||||
| Vakuum | 1.4 x 10-5 mbar | |||||
| Kapillär källa | +4,500 V | +4,500 V | +4,000 V | |||
| Ändplatta offset | -500 V | -500 V | -500 V | |||
| Skimmer | 40 V | -40 V | 40 V | |||
| Cap exit | 106 V | -121 V | 143,5 V | |||
| Okt 1 DC | 12 V | -12 V | 12 V | |||
| Okt 2 DC | 1,7 V | -1,7 V | 2 V | |||
| Objektiv 1 | -5 V | 5 V | -5 V | |||
| Lins 2 | -60 V | 60 V | -60 V | |||
| ICC för positiva joniseringen läge | 20 | |||||
| ICC för negativ jonisering läge | 7 | |||||
Tabell 2: Parametrar för masspektra förvärv i alternativa positiva och negativa jonisering lägen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna studie visade vi en preliminär analys för utformningen av en kandidat oralt vaccin för autoimmun diabetes. Målproteinet för detta experiment var en muterad form av den mänskliga 65 kDa glutamat dekarboxylas, vilka produktion och funktionalitet som enkelt kan upptäckas och mätbara12. Dess uttryck i olika ätliga växt vävnader var medierad av vektorer5, som förmedlar en hög nivå av rekombinant proteinproduktion i en mycket kort tidsram. Valet av den bästa kandidat växten ätbara värd utfördes baserat på det andra uttrycket i rödbeta och spenat blad av manuell agroinfiltration. Detta steg kan vara kritiska för industriell skala upp på grund av det tidsödande förfarandet av manuell agroinfiltration och hårdhet i spenat blad vävnad infiltration.
Identifiering av specifika dpi för skörd som ger högsta rekombinant protein ackumulering för ett rekombinant protein är ett viktigt steg och måste testas och markerat på en fall-till-fall-basis. Analysen av fluorescerande proteinuttryck vid olika dpi (från 4 till 12), tillåtet för att identifiera dagen i högsta uttryck i varje växt-system. Jämförelsen mellan dessa maximala uttrycket dagar, andra koncentration (µg/g FLW), markeras det röda betor är den bästa plattform i form av rekombinant protein avkastning.
Därför testades ytterligare rödbeta för leverans av växten virus-baserat vektorer av ett vakuumsystem, som anses mer lämpade för vaccin industriell storskalig produktion13.
Eftersom protokollet standard vakuum infiltration är optimerad för tobak arter5, inrättandet av en rad parametrar för förfarandet anpassningen till de växtarter som betraktas är en kritisk punkt. Sedan optimerades protokollet Rödbetssallad vakuum agroinfiltration. Våra bevis visade att Agrobacterium utspädning är avgörande för att förbättra protein uttryck nivåer, medan tvättmedel koncentration att förbättra leaf permeabilitet. Resultatet visade att systemet växt och den teknik som passar med detta arbete.
Två olika former av GAD65, GAD65mut och ∆87GAD65mut, som karakteriserades tidigare för deras uttryck i N. benthamiana7, visar olika sub cellulär lokalisering, uttrycktes i Rödbetssallad av vakuum infiltration. Tre biologiska replikat var förberedda för varje prov. Varje biologisk replikat består av en pool av tre infiltrerade blad från olika växter, provtas från 2 till 14 dpi för både GAD65 former. Deras uttryck nivå jämfördes för att välja högsta ackumulera proteinet i växt vävnader.
Relativ kvantifiering av densitometry analys visade att ∆87GAD65mut har 20-fold uttryck högre än dess intakt motsvarighet. Detta kan på grund av dess cytosoliska lokalisering medan GAD65mut, på grund av dess resthalter som förankrar detta formulär till cellmembranet, har en lägre avkastning7, återspeglar en lägre protein stabilitet. ∆87GAD65mut genomsnittliga ackumulering nivå i rödbeta bladvävnad var 201,4 ± 29,3 µg/g FLW, vilket är tillräckligt för att börja med T1D oralt vaccinutveckling.
Slutligen, efter valet av den lämpligaste formen för plattform, teknik och protein, vi fortsatte genom att inrätta en efter skörd behandling av infekterade bladen. Eftersom bladvävnad består av 95% vatten, är en uttorkning behandling användbart för att förhindra mikroorganism förorening. Våra resultat visade att en frystorkning behandling skulle kunna tillämpas på urvalet, utan att påverka rekombinant proteinnivåer i bladen. 10-faldig vatten avlägsnande av frystorka den eliminerar den bakteriell kontamination (mikrobiell), inklusive den rekombinanta A. tumefaciens användas för agroinfiltration.
Analysen av protein bio inkapsling visade dessutom att ∆87GAD65mut helt rötas efter en simulerad gastric matsmältning. Detta tyder på att frystorkning behandling skadar växten cellväggen, utsätta de rekombinant proteinet sura och enzymatisk sammansättningen av gastric miljön.
Underhåll av protein eller peptid molekyl integritet över mag-tarmkanalen övergången till platsen av absorption representerar en fråga för oralt läkemedel leverans14. Därför efter uttorkning behandling, bör potentiella vaccinet vara korrekt formulerat för att övervinna den gastric miljön utan att förlora sin integritet. Vid framställning av vegetabiliska GAD vaccinet, skulle inkapsling i en relativt stabil skal kunna tillämpas som ett system för att förbättra dess effektivitet som gör det möjligt att vara skyddad och stabil längs muntliga leverans route15.
Olika tekniker har utforskats för att övervinna problemen med muntliga leverans av makromolekyler som vissa nyare studier på komplexering av syntetiska hydrogel med insulin som visade en hög inkapsling effektivitet och snabb insulin släpp i tarmen i en pH-beroende sätt16,17.
Både primär och sekundär metabolit bioekvivalens mellan växter att uttrycka ∆87GAD65mut i jämförelse med infiltrerade och icke-infiltrerade kontroller undersöktes med PCA statistik. Skillnaderna mellan de infiltrerade växter att uttrycka ∆87GAD65mut och infiltrerade kontrollerna var inte signifikant, medan icke-infiltrerade vildtyp växterna bildas ett separat kluster. Dessa resultat tyder på att de infiltrerade växterna särskiljs från obehandlade plantor av LC-MS analysen tack vare bakteriell metaboliter eller metaboliter som produceras av växter på grund av infiltration, som redan visas i litteratur13. Totalt visat denna analys att ansamling av ∆87GAD65mut har liten inverkan på den övergripande metabolismen.
Alldeles tyder dessa resultat på att de potentiella oralt vaccin, företrädd av frystorkade Rödbetssallad bladvävnad uttrycker ∆87GAD65mut erhållits att utnyttja den växt virus-baserade uttryck tekniken, är lämplig för experimentell T1D muntliga immunterapi prövningar. Plant virus uttryck vektor tekniken har blivit mycket attraktiv i fältet övergående uttryck, på grund av dess förmåga att producera främmande proteiner både snabbt och på höga nivåer. Denna teknik är baserad på en dekonstrueras vektor som bär endast RNA-polymeras RNA beroende och rörelse protein5 och därför förlorar sin smittsamhet i växter; som en följd, bör dess potentiella överföring till människor uteslutas.
Det experimentellt protokoll redovisas här skulle kunna utvidgas till många olika ätliga arter, såsom sallad, Chenopodium capitatum och Tetragonia expansa. Eftersom bladen av dessa arter, inklusive rödbeta och spenat, vars upptäcktes tidigare som bra uttryck växt system5, kan användas som okokt mat, den teknik som föreslås här kan användas för tillverkning ätbara vacciner eller för produktion av minimalt bearbetade funktionella livsmedel eller foder.
Kombinationen av rekombinant protein/växtarter, dpi av avverkning som ger högsta rekombinant protein ackumulering nivå behöver fortfarande fastställas empiriskt på ett fall från fall till fall beroende på rekombinant protein uttryckt och värden plantera arter18.
Tillämpningen av denna teknik för produktion av oralt vaccin håll stor potential att bli ett alternativ till konventionella vacciner inom en snar framtid, förutom bekämpa onkolytisk virus, autolog vacciner för lymfom och solida tumörer, och monoklonala antikroppar till målet cancer19,20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av det gemensamma projektet ”användning av växter för framställning av en autoimmun diabetes ätbara vaccin (eDIVA)” (projekt-ID: 891854) finansieras av universitetet i Verona inom ramen för anropet 2014.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2-μm Minisart RC4 membrane filters | Sartorius-Stedim | 17764 | |
| 2–mercaptoethanol | Sigma | M3148 | Toxic; 4 % to make loading buffer with glycerol, SDS and Tris-HCl |
| 4-Morpholineethanesulfonic acid (MES) | Sigma | M8250 | pH 5.5 |
| 96-well plate | Sarstedt | 833924 | |
| Acetic acid | Sigma | 27221 | Corrosive |
| Acetonitrile LC-MS grade | Sigma | 34967 | |
| Acetosyringone | Sigma | D134406 | Toxic – 0.1 M stock in DMSO |
| Agar Bacteriological Grade | Applichem | A0949 | 15 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Tryptone |
| Ammonium formate | Sigma | 70221 | |
| Anti-eGFP antibody | ABCam | ab290 | |
| Anti-GAD 65/67 antibody | Sigma | G5163 | |
| Anti-LHCB2 antibody | Agrisera | AS01 003 | |
| Brilliant Blue R-250 | Sigma | B7920 | |
| C18 Column | Grace | - | Alltima HP C18 (150 mm x 2.1 mm; 3 μm) Column |
| C18 Guard Column | Grace | - | Alltima HP C18 (7.5 mm x 2.1 mm; 5 μm) Guard Column |
| CalMag Grower | Peter Excel | 15-5-15 | Fertilizer |
| Carbenicillin disodium | Duchefa Biochemie | C0109 | Toxic |
| Chemiluminescence imaging system | BioRad | 1708370 | ChemiDoc Touch Imaging System |
| Chloroform | Sigma | C2432 | |
| Detergent | Sigma | P5927 | Polysorbate 20 |
| Fluorescence reader | Perkin-Elmer | 1420-011 | VICTOR Multilabel Counter |
| Formic acid LC-MS grade | Sigma | 94318 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | 15 % to make loading buffer with Tris-HCl, SDS and 2–mercaptoethanol |
| GoTaq G2 polymerase | Promega | M7841 | |
| HCl | Sigma | H1758 | Corrosive |
| HILIC Column | Grace | - | Ascentis Express HILIC (150 mm x 2.1 mm; particles size 2.7 μm) Column |
| HILIC Guard Column | Grace | - | Vision HT HILIC (7.5 mm x 2.1 mm; 3 μm) Guard Column |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugate anti-rabbit antibody | Sigma | A6154 | Do not freeze/thaw too many times |
| HPLC Autosampler | Beckman Coulter | - | System Gold 508 Autosampler |
| HPLC System | Beckman Coulter | - | System Gold 128 Solvent Module HPLC |
| Isopropanol | Sigma | 24137 | Flamable |
| Kanamycin sulfate | Sigma | K4000 | Toxic |
| KCl | Sigma | P9541 | 2 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS |
| KH2PO4 | Sigma | P9791 | 2.4 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KCl to make PBS |
| Loading Buffer | |||
| Luminol solution | Ge Healthcare | RPN2232 | Prepare the solution using the ECL Prime Western Blotting System commercial kit |
| Lyophilizator | 5Pascal | LIO5P0000DGT | |
| Mass Spectometer | Bruker Daltonics | - | Bruker Esquire 6000; the mass spectrometer was equipped with an ESI source and the analyzer was an ion trap |
| Methanol | Sigma | 32213 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| Milk-blocking solution | Ristora | - | 3 % in PBS |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907 | Use with NaH2PO4 to make Sodium Phospate buffer |
| NaCl | Sigma | S3014 | 80 g/L with KCl, Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS; 10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, Tryptone and Agar Bacteriological Grade |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | Use with Na2HPO4 to make Sodium Phospate buffer; 14.4 g/L to make PBS |
| NaOH | Sigma | S8045 | |
| Nitrocellulase membrane | Ge Healthcare | 10600002 | |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma | P7000 | |
| Peroxidase substrate ECL | GE Healthcare | RPN2235 | Light sensitive material |
| Pump Vacuum Press | VWR | 111400000098 | |
| Reagent A | Sigma | B9643 | Use 50 parts of this reagent with 1 part of reagent B to prepare BCA working solution |
| Reagent B | Sigma | B9643 | Use 1 part of this reagent with 50 parts of reagent A to prepare BCA working solution |
| Rifampicin | Duchefa Biochemie | R0146 | Toxic – 25 mg/mL stock in DMSO |
| SDS (Sodium dodecyl sulphate) | Sigma | L3771 | Flamable, toxic, corrosive-10 % stock; 3 % to make loading buffer with Tris-HCl, Glycerol and 2–mercaptoethanol |
| Sodium metabisulphite | Sigma | 7681-57-4 | |
| Sonicator system | Soltec | 090.003.0003 | Sonica® 2200 MH; frequency 40 khz |
| Syringe | Terumo | - | |
| Transparent fixed 300-µL insert glass tubes | Thermo Scientific | 11573680 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | Adjust pH with 1N HCl to make Tris-HCl buffer, use 1,5M Tris-HCl (pH 6.8) to make loading buffer with SDS, Glycerol and 2–mercaptoethanol |
| Tryptone | Formedium | TRP03 | 10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Agar Bacteriological Grade |
| Vacuum concentrator | Heto | 3878 F1-3 | Speed-vac System |
| Water LC-MS grade | Sigma | 39253 | |
| Yeast extract | Sigma | Y1333 | 5 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Tryptone, NaCl and Agar Bacteriological Grade |
References
- Merlin, M., Pezzotti, M., Avesani, L. Edible plants for oral delivery of biopharmaceuticals. British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (1), 71-81 (2017).
- Merlin, M., Gecchele, E., Capaldi, S., Pezzotti, M., Avesani, L. Comparative evaluation of recombinant protein production in different biofactories: The green perspective. BioMed Research International. , (2014).
- Menkhaus, T. J., Bai, Y., Zhang, C., Nikolov, Z. L., Glatz, C. E. Considerations for the recovery of recombinant proteins from plants. Biotechnology Progress. 20 (4), 1001-1014 (2004).
- Avesani, L., Bortesi, L., Santi, L., Falorni, A., Pezzotti, M. Plant-made pharmaceuticals for the prevention and treatment of autoimmune diseases: Where are we? Expert Review of Vaccines. 9 (8), 957 (2010).
- Marillonnet, S., Thoeringer, C., Kandzia, R., Klimyuk, V., Gleba, Y. Systemic Agrobacterium tumefaciens-mediated transfection of viral replicons for efficient transient expression in plants. Nature Biotechnology. 23, (2005).
- Ludvigsson, J. Update on treatment of type 1 diabetes in childhood. Current Pediatric Reviews. 1 (2), 118-127 (2013).
- Merlin, M., et al. Enhanced GAD65 production in plants using the MagnICON transient expression system: Optimization of upstream production and downstream processing. Biotechnology Journal. 11 (4), 542-553 (2016).
- Gecchele, E., Merlin, M., Brozzetti, A., Falorni, A., Pezzotti, M., Avesani, L. A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems. Journal of Visualized Experiments. 23 (97), (2015).
- Dal Santo, S., et al. The terroir concept interpreted through grape berry metabolomics and transcriptomics. Journal of Visualized Experiments. 5 (116), (2016).
- Chen, Q., et al. Agroinfiltration as an effective and scalable strategy of gene delivery for production of pharmaceutical proteins. Advanced Techniques in Biology and Medicine. 1 (1), (2013).
- Bertini, E., et al. Design of a type-1 diabetes vaccine candidate using edible plants expressing a major autoantigen. Frontiers in Plant Science. 9, Article 572 (2018).
- Avesani, L., et al. Improved in planta expression of the human islet autoantigen glutamic acid decarboxylase (GAD65). Transgenic Research. 12 (2), 203-212 (2003).
- Sepúlveda-Jiménez, G., Rueda-Benítez, P., Porta, H., Rocha-Sosa, M. A red beet (Beta vulgaris) UDP-glucosyltransferase gene induced by wounding, bacterial infiltration and oxidative stress. Journal of Experimental Botany. 56, jxb/eri036 (2005).
- Renukuntla, J., Vadlapudi, A. D., Patel, A., Boddu, S. H. S., Mitra, A. Approaches for enhancing oral bioavailability of peptides and proteins. International Journal of Pharmaceutics. 447, 75-93 (2013).
- Mustafa, A. Z. Encapsulation importance in pharmaceutical area, how it is done and issues about herbal extraction. , Available from: https://www.researchgate.net/publication/271702091_Encapsulation_importance_in_pharmaceutical_area_how_it_is_done_and_issues_about_herbal_extraction (2015).
- Kamei, N., et al. Complexation hydrogels for intestinal delivery of interferon beta and calcitonin. Journal of Controlled Release. 134, 98-102 (2009).
- Tuesca, A., et al. Complexation hydrogels for oral insulin delivery: effects of polymer dosing on in vivo efficacy. Journal of Pharmaceutical Sciences. 97, 2607-2618 (2008).
- Twyman, R. M., Schillberg, S., Fischer, R. Optimizing the yield of recombinant pharmaceutical proteins in plants. Current Pharmaceutical Design. 19, 5486-5494 (2013).
- Dhama, K., et al. Plant-based oral vaccines for human and animal pathogens – a new era of prophylaxis: current and future perspectives. Journal of Experimental Biology and Agricultural Sciences. 447 (0), 75-93 (2013).
- Hefferon, K. Reconceptualizing cancer immunotherapy based on plant production systems. Future science. O3, FSO217 (2017).
