全山荧光在小鼠胚胎发生过程中心脏室发育的分析
Summary
我们提出的方案, 以检查小鼠心脏的发展使用整个安装视网膜显微镜从心室特异性 Mlc-2v-t分解番茄记者敲入小鼠解剖小鼠胚胎。这种方法使我们能够直接想象小鼠心脏发育过程中心室形成的每个阶段, 而无需劳动密集型组织化学方法。
Abstract
该协议的目的是描述一种方法, 解剖小鼠胚胎和可视化胚胎小鼠室在心脏发育过程中使用心室特异性荧光记者敲入小鼠 (Mlc-2v-tdtocoto 小鼠)。心脏发育涉及一个线性心脏管形成, 心脏管循环, 和四个室间隔。这些复杂的过程在所有脊椎动物中都是高度保守的。小鼠胚胎心脏已被广泛用于心脏发育研究。然而, 由于其非常小的尺寸, 解剖老鼠胚胎心脏是技术上具有挑战性的。此外, 心脏室形成的可视化往往需要原位杂交, β-半乳糖苷酶染色使用 LacZ 报告小鼠, 或免疫染色的切片胚胎心脏。在这里, 我们描述了如何解剖小鼠胚胎心脏和直接可视化室形成的 Mlc-2v-td 番茄小鼠使用整个安装上皮荧光显微镜。利用这种方法, 可以直接检查心脏管的形成和循环, 四腔形成, 而无需进一步的实验操作小鼠胚胎。尽管本协议中使用了 Mlc-2v-td-tdato 记者敲门砖线, 但该协议可应用于其他心脏特定荧光记者转基因鼠标线。
Introduction
心脏发育过程中的腔形成是一个复杂的过程,通过几个形态上不同的胚胎阶段 1,2进行过渡。心脏祖细胞的新月形态形成一个线性心脏管, 然后经过伸长和循环, 形成发育中的心脏的螺旋状。在它的败血症过程后, 发育中的心脏转化为四腔的心脏。这些过程中的任何一个都会导致发育性心脏缺陷。因此, 了解心脏发育过程中室形成的分子机制是很重要的。尽管以前对心脏发育进行了许多研究, 但我们对这一复杂过程的理解仍然有限。
原位杂交、免疫组织化学和β-半乳糖苷酶染色使用 lacz 记者小鼠已被广泛用于研究小鼠心脏发育过程中的腔体形成, 通过标记心脏特异性或腔体特异性结构基因或蛋白质 (例如, nppa、coup-tfii、irx4、mlc-2a 和 mlc-2v)3、4、5、6、7、8、9、10.然而, 这些使用小鼠胚胎的实验需要大量的时间和专业知识, 因为必须按顺序执行几个不同的实验步骤11。在这里, 我们描述了一个简单的整体安装上皮荧光显微镜方法, 以可视化发展中的心室使用胚胎解剖从 Mlc-2v-t分解番茄记者敲门砖 12.与以前使用的方法相比, 这种方法的优点是避免复杂的实验步骤, 这些步骤往往会造成实验变化。该方案的主要目的是描述如何解剖小鼠胚胎和发展心脏, 并检查每个阶段的小鼠心脏室发展, 而无需繁琐的组织化学实验。这种方法可以很容易地应用于评估心脏发育使用各种其他转基因小鼠线标记早期心脏标记 (例如, Mesp1cor:roas26eyfp13, isl1cor:roasa26eyfp13, hcn4h2bgfp14, Hcn4cre: rosa mt”mgg14, Nkx2-5core:rosa mtmg14, Hcn4-egfp15, isl1cor:rosa Mt/2 g 14, Nkx2.5 Cre:roas26ttomato15和 tgmef2c ahf-gfp16小鼠).
Protocol
Representative Results
Discussion
这里描述的方法是相对简单的检查心室室的发展, 而不进行劳动密集型实验, 以标记心室或心脏特异性结构基因或蛋白质。因此, 这种方法最大限度地减少了通常在免疫抑制的心脏部分发现的技术变异性。
成功实施这种方法有两个关键步骤, 包括精确估计小鼠的胚胎年龄和胚胎心脏的解剖。我们实际上是通过识别雌性小鼠的阴道插头来估计小鼠的胚胎年龄。然而, 阴道堵塞的存?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了 NIH R03 HL140264 (Y.J) 的支持。N) 和吉列德科学研究学者项目 (y.-j。N)。
Materials
| dissecting microscope | Leica | MZ125 | |
| DNA ladder (100 bp) | Promega | G2101 | |
| epifluorescence dissecting microscope | Leica | M165 FC | |
| GoTaq Green master Mix | Promega | M712 | |
| PCR machine (master cycler) | Eppendorf | 6336000023 |
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