Analyse der Entwicklung der kardialen Kammer in der Maus Embryogenese mit ganzen Mount Epifluoreszenz
Summary
Wir präsentieren Ihnen die Protokolle, um die Maus Herz Entwicklung mit ganzen Berg Epifluorescent Mikroskopie auf Mausembryonen seziert von ventrikulären spezifische MLC-2v-TdTomato Reporter Knock-in Mäusen zu untersuchen. Diese Methode ermöglicht es uns, jede Stufe der ventrikulären Formation während der Maus Herz Entwicklung ohne arbeitsintensive histochemische Methoden direkt zu visualisieren.
Abstract
Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine Methode für die Zerlegung von Mäuseembryonen und Visualisierung der embryonalen Maus ventrikuläre Kammern während Herz-Entwicklung mit ventrikulären bestimmte fluoreszierende Reporter Knock-in Mäusen (MLC-2v-TdTomato Mäuse) zu beschreiben. Herz-Entwicklung beinhaltet eine lineare Herz Rohr Formation, das Herz Rohr Schleifen und vier Kammer Septation. Diese komplexen Prozesse sind hoch bei allen Wirbeltieren konserviert. Das embryonale Herz Maus hat seit Herz Studien weit verbreitet. Allerdings ist aufgrund ihrer sehr geringen Größe sezieren embryonalen Mäuseherzen technisch anspruchsvoll. Darüber hinaus braucht Visualisierung der kardialen Kammer Bildung oft in-situ Hybridisierung, Beta-Galaktosidase Färbung mit LacZ Reporter Mäuse oder Immunostaining geschnittenen embryonale Herz. Hier beschreiben wir wie sie sezieren embryonalen Mäuseherzen und ventrikuläre Kammer Bildung von MLC-2v-TdTomato Mäuse mit ganzen Berg Epifluorescent Mikroskopie direkt zu visualisieren. Mit dieser Methode ist es möglich, direkt Herz Rohr Bildung und looping und vier-Kammer-Bildung ohne weitere experimentelle Manipulation von Mäuseembryonen untersuchen. Obwohl die MLC-2v-TdTomato Reporter Knock-in Maus Zeile in diesem Protokoll als Beispiel verwendet wird, kann dieses Protokoll auf andere Herz-spezifischen fluoreszierenden Reporter transgene Mauslinien angewendet werden.
Introduction
Kammer-Formation während Herz-Entwicklung ist ein komplexer Prozess, der Übergang durch mehrere morphologisch unterschiedliche embryonalen Phase1,2. Die sichelförmige Form von kardialen Progenitorzellen Bevölkerung bildet eine lineare Herz Rohr und dann erfährt, Dehnung und Schleife um die Spirale form des entwickelnden Herzen. Nach seiner Septation Prozess wandelt sich entwickelnden Herzen in vier Kammern Herzen. Unterbrechung der Prozesse führt zu Entwicklungsstörungen Herzfehler. Daher ist es wichtig zu verstehen, die molekularen Mechanismen Kammer Bildung bei der Entwicklung von Herzen. Trotz zahlreichen früheren Studien über Herz-Entwicklung bleibt unser Verständnis dieses komplexen Prozesses begrenzt.
In-situ Hybridisierung, Immunohistochemistry und Beta-Galaktosidase Färbung mit LacZ Reporter Mäusen wurden weithin verwendet, um die Kammer Bildung während der Maus Herz Entwicklung untersuchen durch Kennzeichnung bestimmten Herz- oder Kammer bestimmte STRUKTURGENE oder Proteine (z. B. Nppa, Putsch-TFII, Irx4, MLC-2a und MLC-2v)3,4,5,6,7,8,9,10. Diese Experimente mit Mausembryonen erfordern jedoch viel Zeit und Know-how, weil mehrere verschiedene experimentelle Schritte werden nacheinander11durchgeführt. Hier beschreiben wir eine einfache ganze Berg Epifluorescent Mikroskopie Methode um entwickelnden Embryonen von MLC-2v-TdTomato Reporter Knock-in Mäusen12seziert Ventrikel zu visualisieren. Der Vorteil dieser Methode im Vergleich zur bisher verwendeten Methoden ist es, komplexe experimentelle Schritte zu vermeiden, die oft experimentelle Variationen erstellen kann. Der Hauptzweck dieses Protokolls soll beschreiben, wie Mausembryonen und entwickelnden Herzen zu sezieren und zu jedem Entwicklungsschritt Maus kardiale Kammer ohne mühsame histochemische Experimente zu prüfen. Diese Methode kann leicht verwendet werden, um Herz-Entwicklung mit verschiedenen anderen transgene Mauslinien frühen kardialen Marker beschriften zu bewerten (z. B. Mesp1Cre: Rosa26EYFP13, Isl1Cre: Rosa26EYFP13, Hcn4H2BGFP14, Hcn4Cre: Rosa mT /mG14, Nkx2-5Cre: Rosa mT/mG14, Hcn4-eGFP15, Isl1Cre: Rosa mT/mG14, Nkx2.5Cre: Rosa26tdTomato15und TgMef2c-AHF-GFP16 Mäuse).
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hier beschriebene Methode ist relativ einfach, ventrikuläre Kammer Entwicklung zu untersuchen, ohne arbeitsintensive experimentieren um ventrikuläre oder Herz-Kreislauf-spezifische strukturelle Gene oder Proteine zu beschriften. Diese Methode minimiert so, technische Variabilitäten, die oft in Immunostained Herzen Abschnitten gefunden wurden.
Es gibt zwei wichtige Schritte zum erfolgreich durchführen dieses Verfahrens einschließlich genaue Schätzung der embryonalen Alter von Mäusen …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt von NIH R03 HL140264 (Y.-J. (N) und Gilead Sciences Research Scholar Program (Y.-J. (N).
Materials
| dissecting microscope | Leica | MZ125 | |
| DNA ladder (100 bp) | Promega | G2101 | |
| epifluorescence dissecting microscope | Leica | M165 FC | |
| GoTaq Green master Mix | Promega | M712 | |
| PCR machine (master cycler) | Eppendorf | 6336000023 |
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