Analyse du développement de la chambre cardiaque durant l’embryogenèse de souris à l’aide de toute monture épifluorescence
Summary
Nous présentons les protocoles afin d’examiner le développement de coeur de souris au microscope de toute monture épifluorescente sur des embryons de souris disséqués de ventriculaire spécifiques MLC-2v-tdTomato journaliste souris knock-in. Cette méthode nous permet de directement visualiser chaque étape de la formation ventriculaire au cours du développement de coeur de souris sans fastidieuses méthodes histochimiques.
Abstract
Le but du présent protocole est de décrire une méthode pour la dissection des embryons de souris et la visualisation des cavités ventriculaires embryonnaires de souris au cours du développement de coeur à l’aide de la souris knock-in ventriculaire journaliste fluorescents spécifiques (MLC-2v-tdTomato souris). Développement de coeur implique une formation du tube cardiaque linéaire, le tube de coeur looping et quatre chambre septation. Ces processus complexes sont hautement conservées chez tous les vertébrés. Le coeur embryonnaire de souris a été largement utilisé pour les études sur le développement cardiaque. Toutefois, en raison de leur taille extrêmement petite, coeurs embryonnaires de souris de dissection est techniquement difficile. En outre, visualisation de formation de chambre cardiaque souvent a besoin d’hybridation in situ, bêta-galactosidase, coloration à l’aide de la souris journaliste LacZ ou immunostaining des coeurs embryonnaires sectionnés. Ici, nous décrivons comment disséquer coeurs embryonnaires de souris et de visualiser directement formation chambre ventriculaire du MLC-2v-tdTomato de souris au microscope toute monture épifluorescente. Avec cette méthode, il est possible d’examiner directement la formation du tube cardiaque et une boucle et quatre formation de chambre sans plus loin la manipulation expérimentale des embryons de souris. Bien que la ligne de souris knock-in journaliste MLC-2v-tdTomato est utilisée dans le présent protocole à titre d’exemple, le présent protocole peut être appliqué aux autres lignées de souris transgéniques journaliste fluorescents spécifiques à cœur.
Introduction
Formation de chambre pendant le développement du cœur est un processus complexe qui passe par plusieurs stades embryonnaires morphologiquement distinctes1,2. La forme en croissant de progéniteurs cardiaques de population forme un tube cardiaque linéaire et puis subit une élongation et une boucle pour obtenir la forme de la spirale du coeur en développement. Après son processus de cloisonnement, le coeur en développement se transforme en le cœur à quatre cavités. Interruption de le quelconque de ces processus résulte du développement de cardiopathies congénitales. Ainsi, il est important de comprendre les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la formation de la chambre au cours du développement du cœur. Malgré de nombreuses études précédentes sur le développement du cœur, notre compréhension de ce processus complexe reste limitée.
Hybridation in situ, immunohistochimie et bêta-galactosidase LacZ journaliste chez des souris de coloration ont été largement utilisées pour étudier la formation de chambre pendant le développement cardiaque chez la souris par marquage cardiaque spécifique ou une chambre spécifique des gènes de structure ou protéines (p. ex., Ppne, Coup-TFII, Irx4, MLC-2 a et MLC-2v)3,4,5,6,7,8,9,10. Toutefois, ces expériences utilisant des embryons de souris exigent beaucoup de temps et expertise, parce que plusieurs différentes étapes expérimentales doivent être effectuées dans l’ordre de11. Nous décrivons ici une méthode de microscopie épifluorescente de Mont toute simple pour visualiser les ventricules en développement utilisant des embryons disséqués du MLC-2v-tdTomato journaliste souris knock-in12. L’avantage de cette méthode par rapport aux méthodes utilisées précédemment est d’éviter les étapes expérimentales complexes qui peuvent souvent créer des variations expérimentales. L’objectif principal du présent protocole est de décrire comment disséquer des embryons de souris et coeurs en voie de développement et d’examiner chaque étape du développement cardiaque chambre souris sans expériences histochimiques fastidieux. Cette méthode peut être facilement appliquée pour évaluer le développement de coeur à l’aide de divers autres lignées de souris transgéniques étiquetage des marqueurs cardiaques précoces (par exemple, Mesp1Cre : Rosa26EYFP13, Isl1Cre : Rosa26EYFP13, Hcn4H2BGFP14, Hcn4Cre : Rosa mT /mG14, Nkx2-5Cre : Rosa mT/mG14, Hcn4-eGFP15, Isl1Cre : Rosa mT/mG14, Nkx2.5Cre : Rosa26tdTomato TgMef2c-AHF-GFP16 souris et15).
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode décrite ici est relativement simple d’examiner le développement chambre ventriculaire, sans effectuer des expériences à forte main-d’oeuvre pour étiqueter ventriculaires ou cardiaque spécifique des gènes de structure ou de protéines. Ainsi, cette méthode minimise les variabilités techniques qui souvent trouvées dans les sections de cœur immunostained.
Il y a deux étapes cruciales pour réaliser avec succès cette méthode notamment l’évaluation précise de l’âg…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les NIH R03 HL140264 (Y.-J. N) et Gilead Sciences Research Scholar Program (Y.-J. N).
Materials
| dissecting microscope | Leica | MZ125 | |
| DNA ladder (100 bp) | Promega | G2101 | |
| epifluorescence dissecting microscope | Leica | M165 FC | |
| GoTaq Green master Mix | Promega | M712 | |
| PCR machine (master cycler) | Eppendorf | 6336000023 |
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