전체 산 Epifluorescence를 사용 하 여 마우스 Embryogenesis 동안 심장 챔버의 분석
Summary
우리는 프로토콜 검사 실의 특정 MLC-2v-tdTomato 기자 노크에 쥐에서 해 부 마우스 배아에 전체 마운트 epifluorescent 현미경 검사 법을 사용 하 여 마우스 심장 개발을 제시. 이 방법을 직접 노동 집약적인 조직화 학적인 방법 없이 마우스 심장 개발 하는 동안 심 실 형성의 각 단계를 시각화 수 있습니다.
Abstract
이 프로토콜의 목표 마우스 태아의 해 부 및 배아 마우스 심 실 챔버의 심장 개발 심 실 특정 형광 기자 노크에서 마우스 (마우스 MLC-2v-tdTomato)를 사용 하 여 시각화 하는 방법을 설명 하는 것입니다. 심장 개발에는 선형 심장 관 형성, 루핑, 심장 관 및 4 챔버 septation 포함 한다. 이러한 복잡 한 프로세스는 매우 모든 척추 동물에 보존 됩니다. 마우스 배아 심장 심장 발달 연구에 널리 사용 되었습니다. 그러나, 그들의 매우 작은 크기로 인해, 마우스 미 발달 심 혼을 해 부 기술적 도전 이다. 또한, 종종 심장 챔버의 시각화 제자리 교 잡, 베타-galactosidase LacZ 기자 쥐, 또는 sectioned 미 발달 심 혼의 immunostaining를 사용 하 여 얼룩을 해야 합니다. 여기, 우리는 쥐 미 발달 심 혼 부 직접 심 실 챔버 형성 MLC-2v-tdTomato 마우스 전체 마운트 epifluorescent 현미경 검사 법을 사용 하 여 시각화 하는 방법을 설명 합니다. 이 방법으로 직접 검사 심장 관 형성 및 반복, 마우스 배아의 추가 실험 조작 없이 4 개의 챔버 형성 가능 하다. MLC-2v-tdTomato 기자 노크 마우스 라인은 사용 하지만이 프로토콜에 예를 들어,이 프로토콜 다른 심장 특정 형광 성 취재 원 유전자 변형 마우스 라인에 적용할 수 있습니다.
Introduction
챔버 형성 심장 개발 하는 동안 여러 형태학 상으로 다른 배아 단계1,2를 통해 전환 복잡 한 과정 이다. 심장 조상 인구 셀의 초승달 모양 선형 심장 튜브를 형성 하 고 신장 및 개발 중심의 나선형 모양을 형성에 반복을 겪 습. 그것의 septation 과정 후 개발 심장 4 연 발 심장으로 변화 됩니다. 이러한 프로세스의 중단 발달 심장 결함 발생합니다. 따라서, 챔버 형성 심장 개발 하는 동안 기본 분자 메커니즘을 이해 하는 것이 중요 하다. 수많은 이전 연구 심장 발달에,에 불구 하 고이 복잡 한 과정의 우리의 이해 제한 된 남아 있습니다.
제자리 교 잡, immunohistochemistry, 및 베타-galactosidase 얼룩 LacZ 기자 마우스를 사용 하 여 널리 사용 된 특정 심장 또는 챔버 특정 구조 유전자의 라벨 마우스 심장 개발 동안 챔버 형성 연구 또는 단백질 (예를 들어, Nppa 쿠데타-TFII, Irx4, MLC-2a, MLC-2v)3,,45,6,7,8,9,10. 그러나, 이러한 실험 마우스 배아를 사용 하 여 필요 상당한 시간과 전문성, 여러 다른 실험적인 단계 될 필요가 있기 때문에11을 순차적으로 수행. 여기, 우리 개발 심 배아 MLC-2v-tdTomato 기자 노크 쥐12에서 해 부를 사용 하 여 시각화 하는 간단한 전체 마운트 epifluorescent 현미경 메서드를 설명 합니다. 이전에 사용한 방법에 비해이 방법의 장점은 종종 실험의 유사 콘텐츠를 만들 수 있습니다 복잡 한 실험 단계를 피하기 위해입니다. 이 프로토콜의 주요 목적은 마우스 배아와 마음을 개발 해 부 하 고 지루한 조직화 학적인 실험 없이 마우스 심장 챔버 개발의 각 단계를 검사 하는 방법을 설명 하는 것 이다. 이 방법은 심장 개발 초기 심장 마커 라벨 다른 다양 한 유전자 변형 마우스 라인을 사용 하 여 평가에 쉽게 적용할 수 있습니다 (예: Mesp1Cre: Rosa26EYFP13, Isl1Cre: Rosa26EYFP13, Hcn4H2BGFP14, Hcn4Cre:로 사 산 /mG14, Nkx2-5Cre:로 사 산/mG14, Hcn4 eGFP15, Isl1Cre:로 사 산/mG14, Nkx2.5Cre: Rosa26tdTomato15및 TgMef2c-AHF-GFP16 쥐).
Protocol
Representative Results
Discussion
여기 설명 하는 방법을 심 실 또는 심장 관련 구조 유전자 또는 단백질을 많은 실험을 수행 하지 않고 심 실 챔버 개발 검토를 상대적으로 간단 하다. 따라서,이 메서드는 immunostained 심장 섹션에서 종종 발견 된 기술 variabilities 최소화 합니다.
쥐의 배아 나이 그리고 미 발달 심 혼의 해 부의 정확한 평가 포함 하 여이 메서드를 성공적으로 수행 하기 위한 두 개의 중요 한 단계?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NIH R03 HL140264에 의해 지원 되었다 (Y.-제이 N)와 길 르 앗 과학 연구 학자 프로그램 (Y.-제이 N)입니다.
Materials
| dissecting microscope | Leica | MZ125 | |
| DNA ladder (100 bp) | Promega | G2101 | |
| epifluorescence dissecting microscope | Leica | M165 FC | |
| GoTaq Green master Mix | Promega | M712 | |
| PCR machine (master cycler) | Eppendorf | 6336000023 |
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