Summary

דור של Organoids של צינורות המרה Extrahepatic העכבר

Published: April 23, 2019
doi:

Summary

פרוטוקול זה מתאר את הייצור של מערכת תלת-ממדי תא צורב של צינור המרה extrahepatic העכבר. אלה organoids בכיס המרה יכול להישמר בתרבות ללמוד ביולוגיה cholangiocyte. Organoids בכיס המרה אקספרס סמנים של קדמון והן תאים בכיס המרה, המורכבת של תאי אפיתל מקוטב.

Abstract

Cholangiopathies, אשר משפיעים על צינורות המרה extrahepatic (EHBDs), כוללים בהכנת בכיס המרה, מחלת כבד כרונית חסימתית ו- cholangiocarcinoma. להם אין אפשרויות טיפולית יעילה. כלים ללמוד EHBD מוגבלים מאוד. המטרה שלנו הייתה לפתח מודל ייחודיים, תכליתי למבוגרים, תאי גזע, נגזר, פרה cholangiocyte זה ניתן להפיק בקלות של פראי סוג ועכברים מהונדסים גנטית. לפיכך, אנו מדווחים על הטכניקה הרומן של פיתוח מערכת תרבות תא צורב (EHBDO) EHBD מ- EHBDs העכבר למבוגרים. המודל הוא חסכוניים, מסוגל בקלות להיות מנותח, ויש לו מספר יישומים במורד הזרם. באופן ספציפי, אנו מתארים את המתודולוגיה של העכבר EHBD בידוד, דיסוציאציה תא בודד, חניכה תרבות תא צורב, הפצת, ואת תחזוקה לטווח הארוך ואחסון. כתב יד זה מתאר גם EHBDO עיבוד אימונוהיסטוכימיה, מיקרוסקופ פלואורסצנטי של mRNA שפע כימות על ידי תגובת שרשרת של פולימראז בזמן אמת שעתוק במהופך כמותית (לרביעיית-PCR). פרוטוקול זה יש יתרונות משמעותיים בנוסף לייצור organoids EHBD ספציפיים. השימוש במדיום ממוזגים מתאי L-WRN מפחית באופן משמעותי את העלות של מודל זה. השימוש העכבר EHBDs מספק רקמות כמעט בלתי מוגבל לדור תרבות, בניגוד רקמה אנושית. העכבר שנוצר EHBDOs להכיל אוכלוסיה טהור של תאים אפיתל עם סמנים של קדמון endodermal והוא הבדיל תאים בכיס המרה. Organoids בתרבית לשמור על מורפולוגיה הומוגנית דרך מעברים מרובים, ניתן לשחזר לאחר אחסון לטווח ארוך של חנקן נוזלי. המודל מאפשר לחקר התפשטות תאים קדמון בכיס המרה, ניתן לטפל בנושא פרמקולוגית, וכן עלול להיווצר מתוך עכברים מהונדסים גנטית. מחקרים עתידיים נחוצים כדי למטב את תרבות תנאים על מנת להגביר את היעילות יופיצ, להעריך תא פונקציונלי בגרות ולאחר ישירה תאית התמיינות. פיתוח מודלים של תרבות משותפת, מטריצה חוץ-תאית נייטרלי יותר ביולוגית הם גם רצוי.

Introduction

Cholangiopathies הן הפרעות פרוגרסיבית כרונית חשוכת מרפא המשפיעים על תאים בכיס המרה ממוקם אינטרה – ו צינוריות המרה extrahepatic (EHBDs)1. Cholangiopathies מסוימים, כמו מחלת כבד כרונית חסימתית, cholangiocarcinoma, בהכנת בכיס המרה, ציסטות choledochal, משפיעים בעיקר על EHBDs. ההתפתחות של טיפולים cholangiopathies הוא מוגבל על ידי המוגבל של מודלים פרה. בנוסף, מחקרים קודמים התמקדו cholangiopathies המקובצים יחד: הכבד, אינטרה- ו EHBDs. עם זאת, אינטרה – EHBDs של מקור עובריים שונים והם יהיו, לכן, צריך להיחשב פתולוגיות מולקולרית ברורים. צינורות המרה intrahepatic להתפתח הלוחות ductal intrahepatic והחלק הגולגולת של הסעיף הכבד, EHBDs כל לפתח מן החלק סימטרית של הסעיף הכבד2. הם גם להסתמך על תאים תאים קדמון שונים הומאוסטזיס למבוגרים, כולל תעלות של הרינג צינורות המרה intrahepatic ובלוטות peribiliary2,EHBDs3. השימוש במודלים ללימודי פרה מוגבל על ידי הוצאות, צריך להיות ממוזער מסיבות מוסריות. לכן, רדיוקציוניסטי, לשחזור, זמן ומודלים במבחנה חסכוניים הן רצוי מאוד.

רוב המחקרים מוקדמת של cholangiopathies מנוצל העכבר הרגיל או עכברוש סרטן מודלים, או שורות תאים אנושיים cholangiocarcinoma נגזר אינטרה – ו6,5,4,EHBDs7. אולם, אלו הם דגמי תאים טרנספורמציה, לא מסכם את הדברים cholangiocyte נורמלי ביולוגיה או הומאוסטזה במצב בריא. התקדמות האחרונות בפיתוח מודלים של תרבות organotypic אפשרה הפיתוח של מבנים תלת-ממדי של סוגי רקמות שונות, כולל רקמות כיס המרה, למרות העכבר הרגיל לא EHBDs8,9, 10. מבנים אלה “איברים כמו” מכוון מחקה רקמות העיקרי, גדלים בנישה מלאכותי תמיכה התחדשות עצמית של תאי גזע ייחודיים/קדמון11.

“תא צורב” היא רחבה בטווח זה רוב מתאר בדרך כלל מודלים תלת-ממדי רקמות שמקורם בתאי גזע. ניתן להפיק Organoids של pluripotent מחדש תאי גזע המיוצג על-ידי תאי גזע עובריים, המושרה בתאי גזע pluripotent. הם גם ניתן להפיק תאי גזע בוגרים ייחודיים12. דגמים תא צורב cholangiocyte הוצעו במחקרים קודמים של המחקר. לפיכך, organoids שמקורם בתאי גזע pluripotent האנושית כבר דווח על7,9,13 ולספק כלי רב ערך, זמן יעיל המאפשר לדור בו זמנית של סוגי תאים שונים. עם זאת, אלה organoids נגזר תאי גזע pluripotent אינן משקפות באופן מלא את המבנה ואת הפונקציונליות של ראשי cholangiocytes EHBD למבוגרים.

Organoids שמקורם בתאי גזע בוגרים של האדם9 , חתולים10 הכבד הוצעו גם. מודלים של חתולים אינם זמינים באופן נרחב, יש מוגבל כלי armamentarium למטרות מחקר. יתר על כן, אלה הכבד-derived מבוגרים נגזר תאי גזע organoids לא מודל extrahepatic cholangiocytes אבל cholangiocytes intrahepatic למדי.

EHBD תא צורב דור דווח בין אדם נורמלי EHBDs14 ו העכבר EHBD cholangiocarcinoma15. עם זאת, גישה EHBD-רקמה אנושית מוגבלת מאד ולאחר organoids נגזר מודל מאתר גנטי של cholangiocarcinoma15 אינם מייצגים הביולוגיה cholangiocyte בריא הומאוסטזיס נגזרים מתאי מהונדס גנטית.

כדי לטפל המגבלות של pluripotent תאי הגזע ואת הכבד-נגזר cholangiocyte תא צורב מודלים וגישה מוגבלת ברקמות אנושיות צורך במודלים פרה, פיתחנו מודל תא צורב EHBD מאתר (איור 1 א’). כתב יד זה מתאר את ההתפתחות של טכניקה עבור העכבר נגזר EHBD organoids מרקמות למבוגרים. אלה organoids EHBD בשם EHBDOs יהיה כלי במבחנה חשוב בחקר המנגנונים שבבסיס EHBDs cholangiocyte הומאוסטזיס ומחלות תהליכים, כגון cholangiopathies.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת מישיגן. 1. הכנת ציוד וחומרים לבידוד EHBD העכבר להכין בינונית זריעה, מאגר כביסה (טבלה של חומרים) ב- 50 מ ל צינורות חרוט ולשמור אותם ב 4 ° C או על קרח עד השימוש. בצע כיוו?…

Representative Results

פרוטוקול שלנו מתאר את הדור של העכבר EHBD organoids רקמות ספציפיות, מבוגר נגזר תאי גזע. לאחר organoids מתורבתים, ניתן לצפות מוקדם ככל 1 יום לאחר הבידוד EHBD צורה מבנה פיברוזיס. זיהום עם fibroblasts לא נצפית בדרך כלל בעת יצירת תרבות. EHBDO יופיצ יעילות הוא כ 2% כאשר מבודד neonatal או למבוגרים (שגילם חוד…

Discussion

עבודה זו מתארת את הדור של מודל תלת-ממדי organotypic של העכבר EHBD cholangiocytes. צעדים חשובים בדור תרבות EHBDO כוללים ניתוח קפדני EHBD כדי למנוע זיהום תא לבלב, תחזוקת בתנאים סטריליים כדי למנוע זיהום חיידקים ופטריות, מניפולציה זהיר לאחר צנטריפוגה כדי למנוע אובדן חומר הסלולר. הדבקות קרוב בתנאי טמפרטורה שתואר …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי האגודה האמריקאית את פרס מחקר של פסגת מחלות הכבד (ל. נ) מכוני הבריאות הלאומיים, במכון הלאומי של סוכרת ואת העיכול ומחלות כליה (פרסים P30 DK34933 נ, DK062041 P01 כדי J.L.M.). אנו מודים ד ר רמון Ocadiz-רואיז (אוניברסיטת מישיגן) על העזרה שלו עם פיתוח מתודולוגיה זו.

Materials

L-WRN cell culture medium
Advanced DMEM/F12 Life Technologies 12634-010
Fetal Bovine Serum (FBS) 1% Life Technologies 10437-028
Penicillin-Streptomycin 100 U/mL Life Technologies 15140-122
Washing buffer
Phosphate Buffered Saline (PBS) 50 mL Life Technologies 10010-023
Penicillin-Streptomycin 125 U/mL Life Technologies 15140-122
Amphotericin B  6.25 µg/mL Life Technologies 15290-018
Organoid culture medium
L-WRN Conditioned medium  1:1 ATCC CRL-3276
Advanced DMEM/F12 1:1 Life Technologies 12634-010
Penicillin-Streptomycin 100 U/mL Life Technologies 15140-122
N-Glutamine 10 µl/mL Life Technologies 35050-061
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid, HEPES 10 mM Life Technologies 15630-080
B27 10 µl/mL Gibco 17504-044
N2 10 µl/mL Gibco 17502-048
Organoid seeding medium
Organoid culture medium 
Epidermal growth factor (EGF) 50 ng/mL Invitrogen PMG8041
Fibroblast growth factor-10 (FGF10) 100 ng/mL PeproTech 100-26
Primary antibodies
Anti-Cytokeratin 19 (CK19) antibody, Rabbit 1:250 Abcam ab53119
Sex-Determining Region Y-Box 9 (SOX9) antibody, Rabbit 1:200 Santa Cruz sc-20095
Pancreatic Duodenal Homeobox 1 (PDX1) antibody, Rabbit 1:2000 DSRB F109-D12
E-cadherin antibody, Goat 1:500 Santa Cruz sc-31020
Acetylated α-tubulin antibody, Mouse 1:500 Sigma-Aldrich T6793
Secondary antibodies
488 labeled anti-rabbit, Donkey IgG 1:1000 Invitrogen A-21206
594 labeled anti-goat, Donkey IgG 1:1000 Invitrogen A-11058
568 labeled anti-mouse, Goat IgG2b 1:500 Invitrogen A-21144
TopFlash Wnt reporter assay
TopFlash HEK293 cell line ATCC CRL-1573
Luciferase Assay Kit Biotium 30003-2
0.05% Trypsin-EDTA Life Technologies 25300054
0.4% Trypan Blue Solution Life Technologies 15250061
Additional materials and reagents
Basement matrix, phenol free Matrigel CORNING 356237
Dissociation buffer, Accutase Gibco A1110501
Cell culture freezing medium, Recovery Life Technologies 12648010
Cell strainer (70 µm, steriled) Fisherbrand 22363548
Guanidinium thiocyanate-phenol RNA extraction, TRIzol Invitrogen 15596026
Specimen processing gel, HistoGel Thermo Fisher Scientific HG-4000-012
Universal mycoplasma detection kit ATCC 30-1012K
1.5 mL microcentrifuge tube Fisherbrand 05-408-129
24 well plate USA Scientific CC7682-7524
50 mL conical centrifuge tube Fisher scientific 14-432-22
Fluorescence microscope Nikon Eclipse E800
Inverted microscope Biotium 30003-2
Necropsy tray Fisherbrand 13-814-61

References

  1. Lazaridis, K. N., LaRusso, N. F. The Cholangiopathies. Mayo Clinic Proceedings. 90 (6), 791-800 (2015).
  2. Carpino, G., et al. Stem/Progenitor Cell Niches Involved in Hepatic and Biliary Regeneration. Stem Cells International. 2016, 3658013 (2016).
  3. DiPaola, F., et al. Identification of intramural epithelial networks linked to peribiliary glands that express progenitor cell markers and proliferate after injury in mice. Hepatology. 58 (4), 1486-1496 (2013).
  4. Venter, J., et al. Development and functional characterization of extrahepatic cholangiocyte lines from normal rats. Digestive And Liver Disease. 47 (11), 964-972 (2015).
  5. Glaser, S. S., et al. Morphological and functional heterogeneity of the mouse intrahepatic biliary epithelium. Laboratry Investigation. 89 (4), 456-469 (2009).
  6. Cardinale, V., et al. Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes, and pancreatic islets. Hepatology. 54 (6), 2159-2172 (2011).
  7. De Assuncao, T. M., et al. Development and characterization of human-induced pluripotent stem cell-derived cholangiocytes. Laboratry Investigation. 95 (6), 684-696 (2015).
  8. Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
  9. Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
  10. Kruitwagen, H. S., et al. Long-Term Adult Feline Liver Organoid Cultures for Disease Modeling of Hepatic Steatosis. Stem Cell Reports. 8 (4), 822-830 (2017).
  11. Spence, J. R. Taming the Wild West of Organoids, Enteroids, and Mini-Guts. Cellular And Molecular Gastroenterology And Hepatology. 5 (2), 159-160 (2018).
  12. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems. Trends In Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
  13. Sampaziotis, F. Building better bile ducts. Science. 359 (6380), 1113 (2018).
  14. Sampaziotis, F., et al. Reconstruction of the mouse extrahepatic biliary tree using primary human extrahepatic cholangiocyte organoids. Nature Medicine. 23 (8), 954-963 (2017).
  15. Nakagawa, H., et al. Biliary epithelial injury-induced regenerative response by IL-33 promotes cholangiocarcinogenesis from peribiliary glands. Proceedings Of The Natural Academy Of Science Of The United States Of America. 114 (19), E3806-E3815 (2017).
  16. Razumilava, N. Hedgehog signaling modulates IL-33-dependent extrahepatic bile duct cell proliferation in mice. Hepatology Communications. , (2018).
  17. Boyer, J. L. Bile formation and secretion. Comprehensive Physiology. 3 (3), 1035-1078 (2013).
  18. Carpino, G., et al. Biliary tree stem/progenitor cells in glands of extrahepatic and intraheptic bile ducts: an anatomical in situ study yielding evidence of maturational lineages. Journal Of Anatomy. 220 (2), 186-199 (2012).
  19. Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
  20. Williamson, I. A., et al. A High-Throughput Organoid Microinjection Platform to Study Gastrointestinal Microbiota and Luminal Physiology. Cellular And Molecular Gastroenterology And Hepatology. 6 (3), 301-319 (2018).
  21. Wan, A. C. A. Recapitulating Cell-Cell Interactions for Organoid Construction – Are Biomaterials Dispensable?. Trends In Biotechnology. 34 (9), 711-721 (2016).

Play Video

Cite This Article
Shiota, J., Zaki, N. H. M., Merchant, J. L., Samuelson, L. C., Razumilava, N. Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts. J. Vis. Exp. (146), e59544, doi:10.3791/59544 (2019).

View Video