Summary

マウス肝外胆管からオルガノイドの生成

Published: April 23, 2019
doi:

Summary

このプロトコルでは、マウス肝外胆管内 3 次元におけるシステムの運用について説明します。これらの肝オルガノイド cholangiocyte 生物を勉強する文化で維持できます。胆道 organoids 前駆細胞と胆管細胞のマーカーの表現し、偏光の上皮細胞で構成されています。

Abstract

胆道閉鎖症、原発性硬化性胆管炎、胆管癌、肝外胆管 (EHBDs) に影響を与える、Cholangiopathies が含まれます。彼らは効果的な治療オプションであるないです。EHBD を検討するためのツールは非常に制限されます。私たちの目的は、野生型および遺伝子改変マウスから簡単に生成することができます臓器特異、汎用性の高い、大人の幹細胞、臨床 cholangiocyte モデルを開発することでした。したがって、成体マウス EHBDs から EHBD (EHBDO) における文化システムの開発手法について報告する.モデルはコスト効率の高い、容易に分析することができる複数のダウン ストリーム アプリケーションであり。具体的には、マウスの EHBD 分離と単一細胞解離、organoid 文化発生, 伝ぱと長期的な保守とストレージの方法論について述べる。この原稿には、リアルタイムの定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (qRT PCR) による免疫組織化学、蛍光顕微鏡および mRNA 豊富な定量処理 EHBDO もについて説明します。このプロトコルには、EHBD 固有オルガノイドを生産に加えて重要な利点があります。L 警告細胞馴化培地の使用このモデルのコストを大幅に削減します。EHBDs ・ マウスの使用は、人間の組織とは異なり、文化世代のほぼ無制限の組織を提供します。生成されたマウス EHBDOs 内皮前駆細胞のマーカーと上皮細胞の純粋な人口を含めるし、胆管細胞を分化します。オルガノイド培養は複数の通路を通って同種の形態を維持し、液体窒素で長期保管後回復することができます。モデル肝前駆細胞増殖に関する研究では、薬理学的、操作することができます、遺伝子組み換えマウスから生成される可能性があります。将来の研究は、めっき効率を高める機能を細胞の成熟と分化の直接評価するために培養条件を最適化するために必要です。共培養モデルともっと生物学的に中立的な細胞外マトリックスの開発も目指しています。

Introduction

Cholangiopathies は、内・肝外胆管 (EHBDs)1に位置する胆管細胞に影響を与える難病の慢性進行性疾患です。原発性硬化性胆管炎、胆管癌、胆道閉鎖症と総胆管の嚢胞のようないくつかの cholangiopathies は、EHBDs を主に影響します。Cholangiopathies 治療法の開発は、前臨床モデルの限られた供給によって制限されます。さらに、先行研究をまとめ cholangiopathies に焦点を当て: 肝臓、内および EHBDs。しかし、内 EHBDs 異なる胚起源を持っているし、したがって、異なる分子病態として考慮されるべき。肝内胆管は、肝膵板と肝憩室の頭蓋の一部から開発、肝憩室2の尾の部分から全体の EHBDs を開発します。彼らはまた、肝内胆管と EHBDs2,3の後腺ヘリングの運河を含む大人の恒常性の異なる前駆細胞コンパートメントに依存します。前臨床研究のための動物モデルの使用費用によって制限され、倫理的な理由のため最小限に抑える必要があります。したがって、還元、再現性のある、時間およびコスト効率の高い体外モデルは非常に望ましいです。

Cholangiopathies のほとんどの先行研究では、正常マウスまたはラット癌モデルまたは EHBDs4,5,6,7からひと胆管癌細胞の増殖を利用されています。ただし、これらは変換されたセルのモデルであり、通常 cholangiocyte 生物の恒常性や健康状態を再現できません。切片培養モデルの開発の最近の進展は、正常ではないマウス EHBDs8,9、肝胆道系組織を含む、異なる組織タイプから 3 次元構造の開発を許可しています。 10。これらの「オルガンのような”構造は主な組織模倣目的し、11臓器特異幹/前駆細胞の自己複製を支援人工ニッチで栽培されて。

「Organoid」は広範な言葉それほとんど一般幹細胞由来三次元組織モデルをについて説明します。オルガノイドをプログラムし直された多能性幹細胞は胚性幹細胞で表され、誘導多能性幹細胞から生成できます。彼らはまた臓器特異成体幹細胞12から生成できます。いくつかの cholangiocyte におけるモデルは、以前の研究で提案されている.したがって、ひと多能性幹細胞由来 organoids 報告7,9,13をされている、異なる種類の細胞を同時生成できる、貴重な時間の効率的なツールを提供します。ただし、構造と機能の主なアダルト EHBD 胆管に、完全に、これら多能性幹細胞由来 organoids は反映されません。

9の人間の成人の幹細胞から派生したオルガノイドとネコ10肝はまた提案しました。猫のモデルは広く利用可能ではないと研究用ツール装備一式が限られています。また、これら肝臓由来成人幹細胞オルガノイドむしろ肝内胆管、肝外胆管にモデル化を行います。

EHBD organoid 世代は人間普通 EHBDs14マウス EHBD 肝門部胆管癌の15から報告されました。EHBD 人体へのアクセスは非常に限られた organoids に由来する胆管細胞癌15の遺伝的マウスモデルは恒常性の生物学の健康的な cholangiocyte ではないし、遺伝子組換え細胞由来します。

多能性幹細胞と肝臓由来 cholangiocyte organoid モデルおよび前臨床モデルで必要とされる人間の組織への限られたアクセスの制限に対処するには、マウス EHBD organoid モデル (図 1 a) を開発しました。本稿では、マウス成体組織から EHBD 派生オルガノイドの技術の開発について説明します。EHBDOs の名前これら EHBD オルガノイド EHBDs cholangiocyte の恒常性と病気プロセス、cholangiopathies などの基になるメカニズムの研究のための重要な生体外のツールになります。

Protocol

ここで説明したすべてのメソッドは、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC)、ミシガン大学によって承認されています。 1. マウス EHBD 分離用装置および材料の準備 播種培地と 50 mL の洗浄バッファー (材料表) の円錐管を準備し、使用するまで 4 ° c または氷の上にそれらを保ちます。 手術台 (図 1 b) を設定します。滅菌外…

Representative Results

提案プロトコルでは、組織特異的幹細胞から派生した大人は、マウス EHBD オルガノイドの世代について説明します。オルガノイド培養される後、嚢胞構造形成 EHBD 分離後 1 日も早く観測できます。通常、線維芽細胞の混入は文化の生成中には反映されません。EHBDO めっき効率は約 2% (2 か月より古い) 新生児または成人から分離されたときマウス (図 2 b<…

Discussion

この作品では、マウス EHBD 胆管の切片 3次元モデルの生成について説明します。EHBDO 文化世代の重要なステップは、膵臓細胞汚染、細菌および真菌の汚染と遠心分離を避けるために後慎重に操作を防ぐために滅菌条件の整備を避けるため細心の EHBD 郭清、細胞材料の損失。記載されている温度条件との密着が必要です。手法にいくつかの制限があります。成体マウスの EHBDs、小さな (約 1 mm の…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、アメリカ協会 (ノーマン ・) に研究の肝疾患ピナクル賞、国立衛生研究所、国立糖尿病、消化器・腎臓病 (ノーマン ・ J.L.M. に影響するもの P01 DK062041 に P30 DK34933 賞受賞) によって支えられました。この方法論の開発と彼の援助ありがとう博士ラモン Ocadiz-ルイス (ミシガン大学)。

Materials

L-WRN cell culture medium
Advanced DMEM/F12 Life Technologies 12634-010
Fetal Bovine Serum (FBS) 1% Life Technologies 10437-028
Penicillin-Streptomycin 100 U/mL Life Technologies 15140-122
Washing buffer
Phosphate Buffered Saline (PBS) 50 mL Life Technologies 10010-023
Penicillin-Streptomycin 125 U/mL Life Technologies 15140-122
Amphotericin B  6.25 µg/mL Life Technologies 15290-018
Organoid culture medium
L-WRN Conditioned medium  1:1 ATCC CRL-3276
Advanced DMEM/F12 1:1 Life Technologies 12634-010
Penicillin-Streptomycin 100 U/mL Life Technologies 15140-122
N-Glutamine 10 µl/mL Life Technologies 35050-061
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid, HEPES 10 mM Life Technologies 15630-080
B27 10 µl/mL Gibco 17504-044
N2 10 µl/mL Gibco 17502-048
Organoid seeding medium
Organoid culture medium 
Epidermal growth factor (EGF) 50 ng/mL Invitrogen PMG8041
Fibroblast growth factor-10 (FGF10) 100 ng/mL PeproTech 100-26
Primary antibodies
Anti-Cytokeratin 19 (CK19) antibody, Rabbit 1:250 Abcam ab53119
Sex-Determining Region Y-Box 9 (SOX9) antibody, Rabbit 1:200 Santa Cruz sc-20095
Pancreatic Duodenal Homeobox 1 (PDX1) antibody, Rabbit 1:2000 DSRB F109-D12
E-cadherin antibody, Goat 1:500 Santa Cruz sc-31020
Acetylated α-tubulin antibody, Mouse 1:500 Sigma-Aldrich T6793
Secondary antibodies
488 labeled anti-rabbit, Donkey IgG 1:1000 Invitrogen A-21206
594 labeled anti-goat, Donkey IgG 1:1000 Invitrogen A-11058
568 labeled anti-mouse, Goat IgG2b 1:500 Invitrogen A-21144
TopFlash Wnt reporter assay
TopFlash HEK293 cell line ATCC CRL-1573
Luciferase Assay Kit Biotium 30003-2
0.05% Trypsin-EDTA Life Technologies 25300054
0.4% Trypan Blue Solution Life Technologies 15250061
Additional materials and reagents
Basement matrix, phenol free Matrigel CORNING 356237
Dissociation buffer, Accutase Gibco A1110501
Cell culture freezing medium, Recovery Life Technologies 12648010
Cell strainer (70 µm, steriled) Fisherbrand 22363548
Guanidinium thiocyanate-phenol RNA extraction, TRIzol Invitrogen 15596026
Specimen processing gel, HistoGel Thermo Fisher Scientific HG-4000-012
Universal mycoplasma detection kit ATCC 30-1012K
1.5 mL microcentrifuge tube Fisherbrand 05-408-129
24 well plate USA Scientific CC7682-7524
50 mL conical centrifuge tube Fisher scientific 14-432-22
Fluorescence microscope Nikon Eclipse E800
Inverted microscope Biotium 30003-2
Necropsy tray Fisherbrand 13-814-61

References

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Cite This Article
Shiota, J., Zaki, N. H. M., Merchant, J. L., Samuelson, L. C., Razumilava, N. Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts. J. Vis. Exp. (146), e59544, doi:10.3791/59544 (2019).

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