Organoids 마우스 Extrahepatic 담 즙 덕트에서의 세대
Summary
이 프로토콜 마우스 extrahepatic 담 즙 덕트 3 차원 organoid 시스템의 생산을 설명합니다. 이러한 담 즙 organoids cholangiocyte 생물학 연구 문화에서 유지할 수 있습니다. 담 즙 organoids 조상 및 담 즙 셀의 마커를 표현 하 고 편광 된 상피 세포의 구성 됩니다.
Abstract
Cholangiopathies, extrahepatic 담 즙 덕트 (EHBDs)에 영향을 미치는 담 즙이 폐쇄 증, 기본 차 경화 담 관 염, 및 cholangiocarcinoma 포함 됩니다. 그들은 효과적인 치료 옵션이 있다. EHBD를 공부 하는 도구는 매우 제한 됩니다. 우리의 목적은 야생 유형 및 유전자 조작된 생쥐에서 쉽게 생성 될 수 있는 기관 특정, 다목적, 성인 줄기 세포 유래, 전 임상 cholangiocyte 모델을 개발 했다. 따라서, 우리는 성인 마우스 EHBDs에서 EHBD organoid (EHBDO) 문화 시스템 개발의 새로운 기술에 보고 합니다. 모델은 비용 효율적이 고 쉽게 분석할 수 있으며 여러 다운스트림 응용 프로그램. 특히, 마우스 EHBD 절연 및 단일 세포 분리, organoid 문화 개시, 전파, 그리고 장기적인 유지 관리 및 저장의 방법을 설명합니다. 이 원고는 또한 EHBDO를 실시간 양이 많은 반전 녹음 방송 연쇄 반응 (qRT-PCR) immunohistochemistry, 형광 현미경 검사 법, 그리고 mRNA 풍부 정량에 대 한 처리를 설명 합니다. 이 프로토콜 EHBD 특정 organoids를 생산 하는 것 외에도 중요 한 장점이 있습니다. L WRN 셀에서 조건 화 된 매체의 사용은 크게이 모델의 비용을 줄일 수 있습니다. 마우스 EHBDs 사용 하 여 거의 무제한 조직을 문화 세대, 인간의 조직 달리 합니다. 생성 된 마우스 EHBDOs endodermal 조상의 표식이 있는 상피 세포의 순수한 인구를 포함 하 고 담 즙 세포 분화. 교양된 organoids 여러 통로 통해 동일한 형태를 유지 하 고 액체 질소에는 장기 저장 후 복구할 수 있습니다. 모델 담 즙 조상 세포 증식의 연구에 대 한, 약리학, 조작할 수 있으며 유전자 조작된 생쥐에서 생성 될 수 있습니다. 미래 연구는 도금 효율을 평가 하는 기능 세포 성숙, 직접 세포 분화 배양 조건 최적화 필요 합니다. 개발 공동 문화 모델과 더 생물학적으로 중립 세포 외 매트릭스의 바람직한 있습니다.
Introduction
Cholangiopathies는 내부-및 extrahepatic 담 즙 덕트 (EHBDs)1에 있는 담 즙 셀에 영향을 주는 불 치 만성 진보적인 장애. 기본 차 경화 담 관 염, cholangiocarcinoma, 담 즙이 폐쇄 증, choledochal cysts 같은 일부 cholangiopathies EHBDs에 주로 영향을 줍니다. Cholangiopathies에 대 한 치료의 개발 전 임상 모델의 제한 된 가용성에 의해 제한 됩니다. 또한, 이전 연구 cholangiopathies 그룹화에 초점: 간, 내부 및 EHBDs. 그러나, 내부-및 EHBDs 다른 배아 기원 있고, 따라서, 명료한 분자 병 리도 고려 되어야 한다. Intrahepatic 담 즙 덕트 intrahepatic ductal 접시와 간장 계실의 두개골 부분에서 개발, 전체 EHBDs 간 계실2의 꼬리 부분에서 개발. 그들은 또한 성인 항상성, intrahepatic 담 즙 덕트 및 EHBDs2,3peribiliary 동맥에서 Hering의 운하를 포함 하 여에 대 한 다른 조상 세포 구획에 의존. 전 임상 연구를 위한 동물 모델의 사용 비용에 의해 제한 하 고 윤리적인 이유로 최소화 한다. 따라서, reductionist, 재현성, 시간 및 비용 효율적인 체 외 모델은 매우 바람직하다.
Cholangiopathies의 대부분의 이전 연구 활용 일반 마우스 또는 쥐 암 모델, 또는 인간의 cholangiocarcinoma 셀 라인 내부-및 EHBDs4,5,,67에서 파생 된. 그러나,이 변형 된 세포의 모델 이며 정상적인 cholangiocyte 생물학 항상성 또는 정상 상태에서를 정리 하지 않습니다. Organotypic 문화 모델의 개발에 최근 진행 다른 조직 종류, 하지만 하지 일반 마우스 EHBDs8,9, 간담 조직를 포함 하 여 3 차원 구조의 개발을 허용 했다 10. 이러한 “기관” 구조로 기본 조직을 흉내 낸 겨냥 하 고 기관 특정 줄기/뿌리 세포11의 자기 갱신을 지 원하는 인공 틈새에서 성장 된다.
“Organoid”는 광범위 한 용어는 가장 일반적으로 줄기 세포에서 파생 된 3 차원 조직 모델을 설명 합니다. Organoids 재설정된 pluripotent 줄기 세포 배아 줄기 세포로 표현 하 고 유도 만능 줄기 세포에서에서 생성 될 수 있습니다. 그들은 또한 기관 특정 성인 줄기 세포12에서 생성 될 수 있습니다. 일부 cholangiocyte organoid 모델 이전 연구에서 제안 되었습니다. 따라서, 인간의 pluripotent 줄기 세포에서 파생 된 organoids 보고7,,913 이었고 다른 세포 유형의 동시 세대에 대 한 수 가치, 시간 효율적인 도구를 제공. 그러나, 이러한 pluripotent 줄기 세포에서 파생 된 organoids 구조와 기본 성인 EHBD cholangiocytes의 기능 완벽 하 게 반영 하지 않습니다.
인간의9 의 성인 줄기 세포에서 파생 된 Organoids 그리고 고양이10 간도 제안 했다. 고양이 모델 널리 사용 되지 않으며 도구 armamentarium 연구 목적에 대 한 제한. 또한, 이러한 간 파생 성인 줄기 세포 유래 organoids extrahepatic cholangiocytes 하지만 오히려 intrahepatic cholangiocytes 모델 하지 않습니다.
EHBD organoid 세대는 인간의 정상적인 EHBDs14 와 마우스 EHBD cholangiocarcinoma15에서 보고 되었다. 그러나, 인간의 EHBD 조직에 대 한 액세스는 매우 제한 된, 그리고 cholangiocarcinoma15 의 유전자 murine 모델에서 파생 된 organoids 항상성에서 건강 한 cholangiocyte 생물학을 대표 하지 않는다 유전자 변형 세포에서 파생 됩니다.
만능 줄기 세포 및 간 파생 된 cholangiocyte organoid 모델 및 전 임상 모델에서 필요한 인간의 조직에 대 한 제한 된 액세스의 한계를 해결 하기 위해 우리는 murine EHBD organoid 모델 (그림 1A)를 개발 했다. 이 원고 마우스 성인 조직에서 EHBD 파생 된 organoids에 대 한 기술 개발을 설명합니다. EHBDOs 라는이 EHBD organoids EHBDs cholangiocyte 항상성 및 질병 과정, cholangiopathies 같은 기본 메커니즘의 연구에 대 한 중요 한 생체 외에서 도구가 될 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 작품의 마우스 EHBD cholangiocytes organotypic 3 차원 모델의 생성을 설명합니다. 췌 장 세포 오염, 세균 및 곰 팡이 오염 및 피하기 위해 원심 분리 후 주의 조작 방지 하기 위해 살 균 조건의 유지 보수를 방지 하려면 세심 한 EHBD 해 부를 포함 하는 EHBDO 문화 세대의 중요 한 단계는 세포질 물자의 손실입니다. 설명된 온도 조건에 가까운 준수가 필요 합니다. 기술에는 몇 가지 제한이 있습니다. 성인 생?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 간 질병 피나 클의 연구 상 (N.R.)에 국립 보건원, 국립 연구소의 당뇨병과 소화기를 위한 미국 협회 및 신장 질병 (N.R., J.L.M. P01 DK062041 P30 DK34933 수상)에 의해 지원 되었다. 이 방법론의 발달로 그의 도움에 감사 박사 라몬 Ocadiz-루이즈 (미시간 대학) 하 고.
Materials
| L-WRN cell culture medium | |||
| Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634-010 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | 1% | Life Technologies | 10437-028 |
| Penicillin-Streptomycin | 100 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| Washing buffer | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | 50 mL | Life Technologies | 10010-023 |
| Penicillin-Streptomycin | 125 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| Amphotericin B | 6.25 µg/mL | Life Technologies | 15290-018 |
| Organoid culture medium | |||
| L-WRN Conditioned medium | 1:1 | ATCC | CRL-3276 |
| Advanced DMEM/F12 | 1:1 | Life Technologies | 12634-010 |
| Penicillin-Streptomycin | 100 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| N-Glutamine | 10 µl/mL | Life Technologies | 35050-061 |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid, HEPES | 10 mM | Life Technologies | 15630-080 |
| B27 | 10 µl/mL | Gibco | 17504-044 |
| N2 | 10 µl/mL | Gibco | 17502-048 |
| Organoid seeding medium | |||
| Organoid culture medium | |||
| Epidermal growth factor (EGF) | 50 ng/mL | Invitrogen | PMG8041 |
| Fibroblast growth factor-10 (FGF10) | 100 ng/mL | PeproTech | 100-26 |
| Primary antibodies | |||
| Anti-Cytokeratin 19 (CK19) antibody, Rabbit | 1:250 | Abcam | ab53119 |
| Sex-Determining Region Y-Box 9 (SOX9) antibody, Rabbit | 1:200 | Santa Cruz | sc-20095 |
| Pancreatic Duodenal Homeobox 1 (PDX1) antibody, Rabbit | 1:2000 | DSRB | F109-D12 |
| E-cadherin antibody, Goat | 1:500 | Santa Cruz | sc-31020 |
| Acetylated α-tubulin antibody, Mouse | 1:500 | Sigma-Aldrich | T6793 |
| Secondary antibodies | |||
| 488 labeled anti-rabbit, Donkey IgG | 1:1000 | Invitrogen | A-21206 |
| 594 labeled anti-goat, Donkey IgG | 1:1000 | Invitrogen | A-11058 |
| 568 labeled anti-mouse, Goat IgG2b | 1:500 | Invitrogen | A-21144 |
| TopFlash Wnt reporter assay | |||
| TopFlash HEK293 cell line | ATCC | CRL-1573 | |
| Luciferase Assay Kit | Biotium | 30003-2 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| 0.4% Trypan Blue Solution | Life Technologies | 15250061 | |
| Additional materials and reagents | |||
| Basement matrix, phenol free Matrigel | CORNING | 356237 | |
| Dissociation buffer, Accutase | Gibco | A1110501 | |
| Cell culture freezing medium, Recovery | Life Technologies | 12648010 | |
| Cell strainer (70 µm, steriled) | Fisherbrand | 22363548 | |
| Guanidinium thiocyanate-phenol RNA extraction, TRIzol | Invitrogen | 15596026 | |
| Specimen processing gel, HistoGel | Thermo Fisher Scientific | HG-4000-012 | |
| Universal mycoplasma detection kit | ATCC | 30-1012K | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Fisherbrand | 05-408-129 | |
| 24 well plate | USA Scientific | CC7682-7524 | |
| 50 mL conical centrifuge tube | Fisher scientific | 14-432-22 | |
| Fluorescence microscope | Nikon | Eclipse E800 | |
| Inverted microscope | Biotium | 30003-2 | |
| Necropsy tray | Fisherbrand | 13-814-61 |
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