Generazione dei Organoids da dotti biliari Extrahepatic Mouse
Summary
Questo protocollo descrive la produzione di un sistema di 3-dimensionale organoid del mouse dei dotti biliari extrahepatic. Questi organoids biliare può essere mantenute in coltura per studiare biologia dei colangiociti. Organoids biliare esprimono marcatori di cellule progenitrici e cellule biliari e sono composte da cellule epiteliali polarizzate.
Abstract
Cholangiopathies, che interessano i dotti biliari extrahepatic (EHBDs), includono atresia biliare, colangite sclerosante primitiva e colangiocarcinoma. Non hanno nessuna opzione terapeutica efficace. Strumenti per studiare EHBD sono molto limitati. Il nostro scopo era di sviluppare un modello dei colangiociti preclinici, derivati da cellule staminali organo-specifiche, versatile, adulto che può essere facilmente generato da wild type e topi geneticamente modificati. Quindi, segnaliamo sulla nuova tecnica di sviluppare un sistema di coltura EHBD organoid (EHBDO) da EHBDs di topo adulto. Il modello è costo-efficiente, in grado di essere facilmente analizzati, e ha molteplici applicazioni a valle. In particolare, descriviamo la metodologia di isolamento EHBD mouse e dissociazione singola cella, organoid cultura iniziazione, propagazione e mantenimento a lungo termine e deposito. Questo manoscritto descrive anche EHBDO elaborazione per immunoistochimica, microscopia fluorescente e quantificazione di abbondanza del mRNA da reazione a catena della polimerasi in tempo reale di trascrizione d’inversione quantitativa (qRT-PCR). Questo protocollo ha significativi vantaggi oltre a produrre organoids EHBD specifici. L’uso di un medium condizionato dalle cellule L-WRN riduce significativamente il costo di questo modello. L’uso del mouse EHBDs fornisce quasi illimitato del tessuto per la generazione di cultura, a differenza di tessuto umano. EHBDOs del mouse generati contengono una popolazione pura di cellule epiteliali con marcatori del progenitore endodermico e biliare cellule differenziate. Colta organoids mantenere omogenea morfologia attraverso passaggi multipli e possono essere recuperate dopo un lungo periodo di conservazione in azoto liquido. Il modello consente lo studio di proliferazione delle cellule progenitrici biliare, può essere manipolato farmacologicamente e può essere generato da topi geneticamente modificati. Gli studi futuri sono necessari per ottimizzare le condizioni di coltura al fine di aumentare l’efficienza di placcatura, valutare la maturità funzionale delle cellule e differenziazione cellulare diretto. Sviluppo di modelli di co-coltura e una matrice extracellulare più biologicamente neutra sono anche auspicabile.
Introduction
Cholangiopathies sono incurabili disordini progressivi cronici che colpiscono le cellule biliari situate in intra e dotti biliari extrahepatic (EHBDs)1. Alcuni cholangiopathies, come colangite sclerotica primaria, colangiocarcinoma, atresia biliare e le cisti del coledoco, interessano principalmente EHBDs. Sviluppo di terapie per cholangiopathies è limitato dalla disponibilità limitata di modelli preclinici. Inoltre, studi precedenti incentrato su cholangiopathies raggruppati: fegato, intra- ed EHBDs. Tuttavia, intra – ed EHBDs hanno un’origine embrionale distinta e, quindi, dovrebbe essere considerata come patologie molecolari distinte. Dotti biliari intraepatici sviluppano dalle piastre ductal intraepatiche e della parte cranica del diverticolo epatico, tutta EHBDs sviluppare da parte caudale del diverticolo epatico2. Si affidano anche compartimenti cellulari differenti progenitore per adulto omeostasi, compresi canali di Hering in dotti biliari intraepatici e ghiandole peribiliari in EHBDs2,3. Uso di modelli animali per studi preclinici è limitata dalla spesa e deve essere ridotto al minimo per motivi etici. Di conseguenza, riduzionista, riproducibile, tempo e costo-efficienti modelli in vitro sono altamente desiderabili.
Maggior parte degli studi precedente di cholangiopathies utilizzato mouse normale o modelli di ratto del cancro o colangiocarcinoma umano linee cellulari derivate da intra – ed EHBDs4,5,6,7. Tuttavia, questi sono modelli di cellule trasformate e non ripassare biologia dei colangiociti normale omeostasi o in uno stato sano. Recenti progressi nello sviluppo di modelli di coltura organotypic ha permesso lo sviluppo di strutture 3-dimensionale da diversi tipi di tessuto, compresi i tessuti di hepatobiliary, anche se non normale mouse EHBDs8,9, 10. Queste strutture di “organo-come” puntato che imita il tessuto primario e sono cresciute in una nicchia artificiale sostegno auto-rinnovamento delle cellule staminali/progenitrici di organo-specifiche cellule11.
“Organoid” è un vasto termine che più comunemente vengono descritti modelli 3-dimensionale del tessuto derivate da cellule staminali. Organoids può essere generato da riprogrammate pluripotenti le cellule staminali rappresentata da cellule staminali embrionali e cellule staminali pluripotenti indotte. Inoltre possono essere generate da cellule staminali adulte di organo-specific12. Sono stati proposti alcuni modelli di organoid dei colangiociti in precedenti studi di ricerca. Così, organoids derivato da cellule staminali pluripotenti umane sono stati segnalati7,9,13 e fornire uno strumento efficiente di prezioso, tempo che consente la generazione simultanea di diversi tipi di cellule. Tuttavia, questi organoids derivati da cellule staminali pluripotenti non riflettono completamente la struttura e la funzionalità del primario adulto EHBD colangiociti.
Organoids derivate da cellule staminali adulte del umano9 e felino10 del fegato sono stati anche proposti. Modelli di felini non sono ampiamente disponibili e hanno limitato armamentario di strumento per motivi di studio. Inoltre, questi fegato-derivate organoids derivati da cellule staminali di adulti non modellare extrahepatic colangiociti ma piuttosto intraepatico colangiociti.
Generazione di organoid EHBD è stato segnalato da umano normale EHBDs14 e mouse EHBD colangiocarcinoma15. Tuttavia, accesso ai tessuti umani EHBD è estremamente limitato e organoids derivata da un modello genetico murino di colangiocarcinoma15 non rappresentano dei colangiociti sano biologia all’omeostasi e sono derivati dalle cellule geneticamente modificate.
Per risolvere le limitazioni di pluripotent derivati da cellule staminali e fegato dei colangiociti organoid modelli e l’accesso limitato ai tessuti umani necessari in modelli preclinici, abbiamo sviluppato un modello murino di organoid EHBD (Figura 1A). Questo manoscritto descrive lo sviluppo di una tecnica per mouse organoids EHBD-derivate da tessuto adulto. Questi organoids EHBD denominato EHBDOs sarà un importante strumento in vitro per lo studio dei meccanismi alla base di EHBDs dei colangiociti omeostasi e processi di malattia, come ad esempio cholangiopathies.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo lavoro descrive la generazione di un modello 3-dimensionale organotipiche del mouse EHBD colangiociti. Passi importanti nella generazione di cultura EHBDO includono dissezione meticolosa EHBD per evitare la contaminazione delle cellule di pancreas, mantenimento di condizioni di sterilità per evitare contaminazioni batteriche e fungine e un’attenta manipolazione dopo la centrifugazione per evitare il perdita di materiale cellulare. Una stretta aderenza alle condizioni di temperatura descritto è necessaria. Ci son…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dalla associazione americana per il premio di studio del fegato malattie Pinnacle (di N.R.) e il National Institutes of Health, National Institute of Diabetes e digestivo e delle malattie renali (premi P30 DK34933 di N.R., P01 DK062041 a J.L.M.). Ringraziamo il dottor Ramon Ocadiz-Ruiz (Università del Michigan) per la sua assistenza con lo sviluppo di questa metodologia.
Materials
| L-WRN cell culture medium | |||
| Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634-010 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | 1% | Life Technologies | 10437-028 |
| Penicillin-Streptomycin | 100 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| Washing buffer | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | 50 mL | Life Technologies | 10010-023 |
| Penicillin-Streptomycin | 125 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| Amphotericin B | 6.25 µg/mL | Life Technologies | 15290-018 |
| Organoid culture medium | |||
| L-WRN Conditioned medium | 1:1 | ATCC | CRL-3276 |
| Advanced DMEM/F12 | 1:1 | Life Technologies | 12634-010 |
| Penicillin-Streptomycin | 100 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| N-Glutamine | 10 µl/mL | Life Technologies | 35050-061 |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid, HEPES | 10 mM | Life Technologies | 15630-080 |
| B27 | 10 µl/mL | Gibco | 17504-044 |
| N2 | 10 µl/mL | Gibco | 17502-048 |
| Organoid seeding medium | |||
| Organoid culture medium | |||
| Epidermal growth factor (EGF) | 50 ng/mL | Invitrogen | PMG8041 |
| Fibroblast growth factor-10 (FGF10) | 100 ng/mL | PeproTech | 100-26 |
| Primary antibodies | |||
| Anti-Cytokeratin 19 (CK19) antibody, Rabbit | 1:250 | Abcam | ab53119 |
| Sex-Determining Region Y-Box 9 (SOX9) antibody, Rabbit | 1:200 | Santa Cruz | sc-20095 |
| Pancreatic Duodenal Homeobox 1 (PDX1) antibody, Rabbit | 1:2000 | DSRB | F109-D12 |
| E-cadherin antibody, Goat | 1:500 | Santa Cruz | sc-31020 |
| Acetylated α-tubulin antibody, Mouse | 1:500 | Sigma-Aldrich | T6793 |
| Secondary antibodies | |||
| 488 labeled anti-rabbit, Donkey IgG | 1:1000 | Invitrogen | A-21206 |
| 594 labeled anti-goat, Donkey IgG | 1:1000 | Invitrogen | A-11058 |
| 568 labeled anti-mouse, Goat IgG2b | 1:500 | Invitrogen | A-21144 |
| TopFlash Wnt reporter assay | |||
| TopFlash HEK293 cell line | ATCC | CRL-1573 | |
| Luciferase Assay Kit | Biotium | 30003-2 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| 0.4% Trypan Blue Solution | Life Technologies | 15250061 | |
| Additional materials and reagents | |||
| Basement matrix, phenol free Matrigel | CORNING | 356237 | |
| Dissociation buffer, Accutase | Gibco | A1110501 | |
| Cell culture freezing medium, Recovery | Life Technologies | 12648010 | |
| Cell strainer (70 µm, steriled) | Fisherbrand | 22363548 | |
| Guanidinium thiocyanate-phenol RNA extraction, TRIzol | Invitrogen | 15596026 | |
| Specimen processing gel, HistoGel | Thermo Fisher Scientific | HG-4000-012 | |
| Universal mycoplasma detection kit | ATCC | 30-1012K | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Fisherbrand | 05-408-129 | |
| 24 well plate | USA Scientific | CC7682-7524 | |
| 50 mL conical centrifuge tube | Fisher scientific | 14-432-22 | |
| Fluorescence microscope | Nikon | Eclipse E800 | |
| Inverted microscope | Biotium | 30003-2 | |
| Necropsy tray | Fisherbrand | 13-814-61 |
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