न्यूट्रोफिल-लाइनेज सेल के मास साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए पूरे अस्थि मज्जा की तैयारी
Summary
यहाँ, हम ताजा अस्थि मज्जा (बीएम) उच्च आयामी द्रव्यमान cytometry के लिए माउस या मानव से अलग प्रक्रिया करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत (समय की उड़ान, CyTOF) न्यूट्रोफिल वंश कोशिकाओं के विश्लेषण द्वारा Cytometry.
Abstract
इस आलेख में, हम एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो पूरे बीएम CyTOF विश्लेषण के लिए ताजा बीएम में न्यूट्रोफिल-लाइनेज कोशिकाओं को संरक्षित करने के लिए ऑप्टिमाइज़ किया गया है। हम इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके न्यूट्रोफिल वंश कोशिकाओं पर ध्यान देने के साथ hematopoietic प्रणाली का मूल्यांकन करने के लिए एक माइलॉयड पूर्वाग्रह 39-एंटीबॉडी CyTOF पैनल का उपयोग किया। CyTOF परिणाम एक खुला संसाधन आयामी कमी एल्गोरिथ्म, viSNE के साथ विश्लेषण किया गया था, और डेटा इस प्रोटोकॉल के परिणाम को प्रदर्शित करने के लिए प्रस्तुत किया गया था. हमने इस प्रोटोकॉल के आधार पर नए न्यूट्रोफिल-लाइनेज सेल की आबादी की खोज की है। ताजा पूरे बीएम तैयारी के इस प्रोटोकॉल के लिए इस्तेमाल किया जा सकता 1), CyTOF विश्लेषण पूरे बीएम से अज्ञात सेल आबादी की खोज करने के लिए, 2), ल्यूकेमिया के रूप में रक्त विकारों के साथ रोगियों के लिए पूरे बीएम दोष की जांच, 3), के अनुकूलन की सहायता फ्लोरोसेंट सक्रिय प्रवाह साइटोमेट्री प्रोटोकॉल है कि ताजा पूरे बीएम का उपयोग।
Introduction
पिछले कुछ दशकों में, साइटोमेट्री तरीकों बीएम में hematopoietic प्रणाली की जांच करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण किया गया है। इन विधियों में फ्लोरोसेंट-सक्रिय प्रवाह साइटोमेट्री और भारी धातु लेबल वाले एंटीबॉडी का उपयोग करके CyTOF की नई विधि शामिल है। वे अपने अद्वितीय सतह मार्कर अभिव्यक्ति प्रोफाइल की पहचान द्वारा एक विषम जैविक नमूना में कई सेल प्रकार की खोजों के लिए नेतृत्व किया है. अधिक चैनलों के साथ जुड़े स्पेक्ट्रम ओवरलैप फ्लोरोसेंट-सक्रिय प्रवाह साइटोमेट्री अनुप्रयोगों में उच्च डेटा अशुद्धि की ओर जाता है। इसलिए, अवांछित कोशिकाओं को नियमित रूप से फ्लोरोसेंट-सक्रिय प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए ब्याज की सेल आबादी को समृद्ध करने के लिए हटा दिया जाता है। उदाहरण के लिए, Ly6G (या Gr-1) और CD11b परिपक्व माइलॉयड सेल मार्कर और Ly6G+ (या Gr-1+) और CD11b+ कोशिकाओं को नियमित रूप से चुंबकीय संवर्धन किट का उपयोग करके बी एम नमूनों से हटा रहे हैं माना जाता है के प्रवाह से पहले साइटोमेट्री विश्लेषण हेमाटोपोएटिक स्टेम और जनक कोशिकाओं (HSPCs) या एक डंप कॉकटेल चैनल1,2,3में इन मार्करों के संयोजन के द्वारा . एक अन्य उदाहरण यह है कि न्यूट्रोफिल को नियमित रूप से मानव रक्त नमूने से हटा दिया जाता है ताकि प्रतिरक्षा अध्ययन के लिए परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) को समृद्ध किया जा सके। माउस या मानव से अलग पूरे अस्थि मज्जा, तथापि, शायद ही कभी साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए बरकरार जांच की है.
हाल ही में, CyTOF hematopoietic प्रणाली4,5,6की जांच करने के लिए एक क्रांतिकारी उपकरण बन गया है. CyTOF के साथ, फ्लोरोफोर-लेबल एंटीबॉडी को भारी तत्व रिपोर्टर-लेबल एंटीबॉडी द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है। इस विधि स्पेक्ट्रम ओवरलैप की चिंता के बिना एक साथ 40 से अधिक मार्करों की माप के लिए अनुमति देता है. यह पूर्व कमी कदम या एक डंप चैनल के बिना बरकरार जैविक नमूना के विश्लेषण में सक्षम है. इसलिए, हम पारंपरिक 2-डी प्रवाह साइटोमेट्री भूखंडों से उच्च-सामग्री आयामीता के साथ हेमेटोपोएटिक प्रणाली को व्यापक रूप से देख सकते हैं। कमी या गेटिंग प्रक्रिया के दौरान अतीत में छोड़ी गई कोशिका आबादी को अब CyTOF4,5 द्वारा उत्पन्न उच्च आयामी डेटा के साथ प्रकाश में लाया जा सकताहै। हमने एक एंटीबॉडी पैनल तैयार किया है जो एक साथ माइलॉयड लिनेज7पर ध्यान देने के साथ ही हेमाटोपोइटिक प्रणाली में 39 पैरामीटरों को मापता है . पारंपरिक प्रवाह साइटोमेट्री डेटा की तुलना में, CyTOF द्वारा उत्पन्न अभूतपूर्व एकल सेल उच्च आयामी डेटा की व्याख्या और दृश्यावलोकन चुनौतीपूर्ण है। अभिकलनीय वैज्ञानिकों ने उच्च आयामी डेटासेट के दृश्य के लिए विमीयता न्यूनीकरण तकनीक विकसित की है। इस आलेख में, हमने एल्गोरिथ्म, viSNE का उपयोग किया है, जो t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding (t-SNE) तकनीक का उपयोग CyTOF डेटा का विश्लेषण करने के लिए और उच्च-आयामी संरचना को संरक्षित करते समय 2-आयामी मानचित्र पर उच्च-आयामी परिणाम प्रस्तुत करने के लिए करता है के डेटा8,9,10. TSNE प्लॉट पर, समान कक्ष सबसेट में संकुल होते हैं और कक्षों की सुविधा को हाइलाइट करने के लिए रंग का उपयोग किया जाता है. उदाहरण के लिए, चित्र 1 पर माइलॉयड कोशिकाओं को CyTOF (चित्र 1)4से प्राप्त 33 सतह मार्करों के उनके अभिव्यक्ति पैटर्न की समानता के आधार पर कई सेल सबसेट में वितरित किए जाते हैं। यहाँ हम हमारे पहले की सूचना के साथ माउस अस्थि मज्जा की जांच की 39-मार्कर CyTOF पैनल viSNE विश्लेषणद्वारा 7. हमारे CyTOF डेटा के viSNE विश्लेषण एक अज्ञात सेल आबादी है कि दोनों HSPC ( CD117+ )और न्यूट्रोफिल (Ly6G+ )विशेषताओं से पता चला पता चला (चित्र 2)7.
अंत में, हम CyTOF विश्लेषण के लिए ताजा पूरे अस्थि मज्जा प्रक्रिया के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. इस लेख में, हम एक उदाहरण के रूप में माउस अस्थि मज्जा का इस्तेमाल किया, जबकि इस प्रोटोकॉल भी मानव अस्थि मज्जा के नमूने की प्रक्रिया के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. मानव अस्थि मज्जा के नमूने के लिए विशिष्ट विवरण भी प्रोटोकॉल में नोट कर रहे हैं के रूप में अच्छी तरह से. इस प्रोटोकॉल का लाभ यह है कि इसमें ऊष्मायन समय और तापमान जैसे विवरण शामिल हैं जिन्हें पूरे अस्थि मज्जा में न्यूट्रोफिल-लाइनेज कोशिकाओं को संरक्षित करने के लिए अनुकूलित किया गया था ताकि बरकरार पूरे अस्थि मज्जा पर जांच को सक्षम किया जा सके। इस प्रोटोकॉल भी आसानी से फ्लोरोसेंट सक्रिय प्रवाह साइटोमेट्री अनुप्रयोगों के लिए संशोधित किया जा सकता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
पिछले दशकों में, फ्लोरोसेंट आधारित प्रवाह साइटोमेट्री कोशिकीय वंशों और विषमता1,2,3का अध्ययन करने के लिए मुख्य विधि के रूप में प्रयोग किया गया था। हालांकि प्रवाह साइट?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम बड़े पैमाने पर साइटोमेट्री प्रक्रिया के साथ सहायता के लिए LJI प्रवाह साइटोमेट्री कोर धन्यवाद देना चाहते हैं. यह काम NIH अनुदान R01HL134236, P01HL136275, और R01CA202987 (सभी C.C.H) और ADA7-12-MN-31 (04) (C.C.H. और Y.P.$) द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| CyTOF Antibodies (mouse) | |||
| Anti-Mouse CD45 (Clone 30-F11) -89Y | Fluidigm | Cat# 3089005B | |
| Anti-Human/Mouse CD45R/B220 (Clone RA36B2)-176Yb | Fluidigm | Cat# 3176002B | |
| Anti-mouse CD105 (Clone MJ7/18)-Purified | Biolegend | Cat# 120402; RRID:AB_961070 | |
| Anti-mouse CD115 (CSF-1R) (Clone AFS98)-Purified | Biolegend | Cat# 135502; RRID:AB_1937293 | |
| Anti-Mouse CD117/c-kit (Clone 2B8)-166Er | Fluidigm | Cat# 3166004B | |
| Anti-mouse CD11a (Clone M17/4)-Purified | Biolegend | Cat# 101101; RRID:AB_312774 | |
| Anti-Mouse CD11b (Clone M1/70)-148Nd | Fluidigm | Cat# 3148003B | |
| Anti-Mouse CD11c (Clone N418)-142Nd | Fluidigm | Cat# 3142003B | |
| Anti-mouse CD127 (IL-7Rα) (Clone A7R34)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 133919; RRID:AB_2565433 | |
| Anti-Mouse CD150 (Clone TC1512F12.2)-167Er | Fluidigm | Cat# 3167004B | |
| Anti-mouse CD16.2 (FcγRIV) (Clone 9E9)-Purified | Biolegend | Cat# 149502; RRID:AB_2565302 | |
| Anti-Mouse CD162 (Clone 4RA10 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 557787; RRID:AB_647340 | |
| Anti-mouse CD169 (Siglec-1) (Clone 3D6.112)-Purified | Biolegend | Cat# 142402; RRID:AB_10916523 | |
| Anti-mouse CD182 (CXCR2) (Clone SA044G4)-Purified | Biolegend | Cat# 149302; RRID:AB_2565277 | |
| Anti-mouse CD183 (Clone CXCR3-173)-Purified | Biolegend | Cat# 126502; RRID:AB_1027635 | |
| Anti-mouse CD335 (NKp46) (Clone 29A1.4)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 137625; RRID:AB_2563744 | |
| Anti-mouse CD34 (Clone MEC14.7)-Purified | Biolegend | Cat# 119302; RRID:AB_345280 | |
| Anti-mouse CD41 (Clone MWReg30)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 133919; RRID:AB_2565433 | |
| Anti-Mouse CD43 (Clone S11)-146Nd | Fluidigm | Cat# 3146009B | |
| Anti-Mouse CD48 (Clone HM48.1)-156Gd | Fluidigm | Cat# 3156012B | |
| Anti-mouse CD62L (Clone MEL-14)-MaxPar Ready | ThermoFisher | Cat# 14-1351-82; RRID:AB_467481 | |
| Anti-mouse CD71 (Clone RI7217)-Purified | Biolegend | Cat# 113802; RRID:AB_313563 | |
| Anti-mouse CD90 (Clone G7)-Purified | Biolegend | Cat# 105202; RRID:AB_313169 | |
| Anti-Mouse F4/80 (Clone BM8)-159Tb | Fluidigm | Cat# 3159009B | |
| Anti-mouse FcεRIα (Clone MAR-1)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 134321; RRID:AB_2563768 | |
| Anti-mouse GM-CSF (MP1-22E9 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 554404; RRID:AB_395370 | |
| Anti-Mouse I-A/I-E (Clone M5/114.15.2)-174Yb | Fluidigm | Cat# 3174003B | |
| Anti-Mouse Ki67 (Clone B56 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 556003; RRID:AB_396287 | |
| Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) (Clone D7)-169Tm | Fluidigm | Cat# 3169015B | |
| Anti-Mouse Ly6B (Clone 7/4)-Purified | abcam | Cat# ab53457; RRID:AB_881409 | |
| Anti-mouse Ly-6G (Clone 1A8)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 127637; RRID:AB_2563784 | |
| Anti-Mouse NK1.1 (Clone PK136)-165Ho | Fluidigm | Cat# 3165018B | |
| Anti-Mouse Siglec-F (Clone E50-2440 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 552125; RRID:AB_394340 | |
| Anti-Mouse TCRβ (Clone H57-597)-143Nd | Fluidigm | (Clone H57-597)-143Nd | |
| Anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (Clone TER-119)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 116241; RRID:AB_2563789 | |
| Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins | |||
| Antibody Stabilizer | CANDOR Bioscience | Cat# 130050 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | Cat# A4503 | |
| Cisplatin-194Pt | Fluidigm | Cat# 201194 | |
| eBioscience 1X RBC Lysis Buffer | ThermoFisher | Cat# 00-4333-57 | |
| eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher | Cat# 00-4333-57 | |
| EQ Four Element Calibration Beads | Fluidigm | Cat# 201078 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | ThermoFisher | Cat# AM9260G | |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | Cat# FB-02 | |
| HyClone Phosphate Buffered Saline solution | GE Lifesciences | Cat#SH30256.01 | |
| Intercalator-Ir | Fluidigm | Cat# 201192B | |
| MAXPAR Antibody Labeling Kits | Fluidigm | http://www.dvssciences.com/product-catalog-maxpar.php | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | Cat# 158127 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | Cat# S2002 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | Cat# X100 | |
| Trypsin EDTA 1X | Corning | Cat# 25-053-Cl | |
| Experimental Model: Organism/Strains | |||
| Mouse: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | Stock No: 000664 | |
| Software Alogrithm | |||
| Bead-based Normalizer | Finck et al., 2013 | https://med.virginia.edu/flow-cytometry-facility/wp-content/uploads/sites/170/2015/10/3_Finck-Rachel_CUGM_May2013.pdf | |
| Cytobank | Cytobank | https://www.cytobank.org/ | |
| Cytofkit v1.r.0 | Chen et al., 2016 | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cytofkit.html | |
| t-SNE | van der Maaten and Hinton, 2008 | https://cran.r-project.org/web/packages/Rtsne/index.html | |
References
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