Preparazione del midollo osseo intero per l'analisi della citometria di massa delle cellule di lignaggio neutrofilo
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per elaborare il midollo osseo fresco (BM) isolato dal topo o dall’uomo per l’analisi di citometria di massa ad alta dimensione (Cytometria da Time-Of-Flight, CyTOF) delle cellule di filo neutrofilo.
Abstract
In questo articolo, presentiamo un protocollo che è ottimizzato per preservare le cellule di lignaggio neutrofilo in BM fresco per l’intera analisi BM CyTOF. Abbiamo utilizzato un pannello CyTOF a 39 anticorpi di 39 anticorpi mieloidi per valutare il sistema ematopoietico con particolare attenzione alle cellule di linea di neutrofili usando questo protocollo. Il risultato CyTOF è stato analizzato con un algoritmo di riduzione dimensionale delle risorse aperte, viSNE, e i dati sono stati presentati per dimostrare l’esito di questo protocollo. Abbiamo scoperto nuove popolazioni di cellule di lignaggio neutrofia basate su questo protocollo. Questo protocollo di preparazione di BM intero fresco può essere utilizzato per 1), analisi CyTOF per scoprire popolazioni di cellule non identificate da tutta BM, 2), studiando interi difetti BM per i pazienti con disturbi del sangue come la leucemia, 3), assistendo l’ottimizzazione di cicli di citometria di flusso attivati a fluorescenza che utilizzano BM intero fresco.
Introduction
Negli ultimi decenni, i metodi di citometria sono stati un potente strumento per studiare il sistema ematopoietico nel BM. Questi metodi includono la citometria di flusso attivata dalla fluorescenza e il nuovo metodo di CyTOF che utilizza anticorpi con etichettatura di metalli pesanti. Hanno portato a scoperte di molti tipi di cellule in un campione biologico eterogeneo identificando i loro profili unici di espressione dei marcatori di superficie. L’aumento delle sovrapposizioni di spettro associate a più canali porta a una maggiore imprecisione dei dati nelle applicazioni di citometria di flusso attivate dalla fluorescenza. Pertanto, le cellule indesiderate vengono regolarmente rimosse al fine di arricchire le popolazioni cellulari di interesse per l’analisi della citometria del flusso attivata dalla fluorescenza. Ad esempio, I marcatori di cellule mieloidi mature, ad esempio Ly6G (o Gr-1) e CD11b, vengono regolarmente rimossi dai campioni BM utilizzando kit di arricchimento magnetico prima dell’analisi della citometria di flusso cellule staminali ematopoietiche e progenitrici (HPG) o combinando questi marcatori in un unico canale cocktail di scarica1,2,3. Un altro esempio è che i neutrofili vengono regolarmente rimossi dai campioni di sangue umano per arricchire le cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) per gli studi immunologici. Il midollo osseo intero isolato dal topo o dall’uomo, tuttavia, è raramente studiato intatto per l’analisi della citometria.
Recentemente, CyTOF è diventato uno strumento rivoluzionario per studiare il sistema ematopoietico4,5,6. Con CyTOF, gli anticorpi con etichettatura fluoroforo sono sostituiti da anticorpi etichettati come reporter ad elemento pesante. Questo metodo consente la misurazione simultanea di oltre 40 marcatori senza la preoccupazione di sovrapposizione dello spettro. Ha permesso l’analisi di campioni biologici intatti senza passaggi di pre-esaurimento o un canale di scarico. Pertanto, possiamo visualizzare il sistema ematopoietico in modo completo con dimensionalità ad alto contenuto da tradizionali grafici di citometria di flusso 2D. Le popolazioni cellulari omesse in passato durante il processo di deplezione o gating possono ora essere portate alla luce con i dati ad alta dimensione generati da CyTOF4,5. Abbiamo progettato un pannello anticorpale che misura contemporaneamente 39 parametri nel sistema ematopoietico con un focus sul linaggio mieloide7. Rispetto ai dati convenzionali sulla citometria del flusso, l’interpretazione e la visualizzazione dei dati unidimensionali senza precedenti generati da CyTOF è difficile. Scienziati computazionali hanno sviluppato tecniche di riduzione della dimensionalità per la visualizzazione di set di dati ad alta dimensione. In questo articolo è stato utilizzato l’algoritmo viSNE, che utilizza la tecnica t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding (t-SNE) per analizzare i dati CyTOF e per presentare il risultato di alta dimensione su una mappa bidimensionale conservando la struttura ad alta dimensione dei dati8,9,10. Nel grafico tSNE, celle simili sono raggruppate in sottoinsiemi e il colore viene utilizzato per evidenziare la caratteristica delle celle. Ad esempio, nella Figura 1 le celle mieloidi vengono distribuite in diversi sottoinsiemi di celle in base alle somiglianze dei relativi modelli di espressione di 33 marcatori di superficie risultanti da CyTOF (Figura 1)4. Qui abbiamo studiato il midollo osseo del topo con il nostro pannello CyTOF di 39 marcatori segnalato in precedenza dall’analisi viSNE7. L’analisi viSNE dei nostri dati CyTOF ha rivelato una popolazionecellulare non identificata che hamostrato caratteristiche sia HSPC (CD117 ) che neutrofili (Ly6G ) (Figura 2)7.
In conclusione, presentiamo un protocollo per elaborare il midollo osseo intero fresco per l’analisi CyTOF. In questo articolo, abbiamo usato il midollo osseo del topo come esempio, mentre questo protocollo può essere utilizzato anche per elaborare campioni di midollo osseo umano. I dettagli specifici per i campioni di midollo osseo umano sono notati anche nel protocollo. Il vantaggio di questo protocollo è che contiene dettagli come il tempo di incubazione e la temperatura che sono stati ottimizzati per preservare le cellule di lignaggio di neutrofili in tutto il midollo osseo per consentire l’indagine sul midollo osseo intero intatto. Questo protocollo può anche essere facilmente modificato per le applicazioni di citometria di flusso attivate dalla fluorescenza.
Protocol
Representative Results
Discussion
Negli ultimi decenni, la citometria di flusso basata sulla fluorescenza è stata utilizzata come metodo principale per studiare le linee cellulari e l’eterogeneità1,2,3. Sebbene la citometria di flusso abbia fornito dati multidimensionali, questo metodo è limitato da scelte di parametri e sovrapposizione spettrale. Per superare la debolezza della citometria di flusso abbiamo approfittato di CyTOF, che utilizza isotopi di metal…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il nucleo di Cytometry LJI Flow per l’assistenza con la procedura di citometria di massa. Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni NIH R01HL134236, P01HL136275 e R01CA202987 (tutte a C.C.H) e ADA7-12-MN-31 (04) (a C.C.H. e Y.P. ) .
Materials
| CyTOF Antibodies (mouse) | |||
| Anti-Mouse CD45 (Clone 30-F11) -89Y | Fluidigm | Cat# 3089005B | |
| Anti-Human/Mouse CD45R/B220 (Clone RA36B2)-176Yb | Fluidigm | Cat# 3176002B | |
| Anti-mouse CD105 (Clone MJ7/18)-Purified | Biolegend | Cat# 120402; RRID:AB_961070 | |
| Anti-mouse CD115 (CSF-1R) (Clone AFS98)-Purified | Biolegend | Cat# 135502; RRID:AB_1937293 | |
| Anti-Mouse CD117/c-kit (Clone 2B8)-166Er | Fluidigm | Cat# 3166004B | |
| Anti-mouse CD11a (Clone M17/4)-Purified | Biolegend | Cat# 101101; RRID:AB_312774 | |
| Anti-Mouse CD11b (Clone M1/70)-148Nd | Fluidigm | Cat# 3148003B | |
| Anti-Mouse CD11c (Clone N418)-142Nd | Fluidigm | Cat# 3142003B | |
| Anti-mouse CD127 (IL-7Rα) (Clone A7R34)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 133919; RRID:AB_2565433 | |
| Anti-Mouse CD150 (Clone TC1512F12.2)-167Er | Fluidigm | Cat# 3167004B | |
| Anti-mouse CD16.2 (FcγRIV) (Clone 9E9)-Purified | Biolegend | Cat# 149502; RRID:AB_2565302 | |
| Anti-Mouse CD162 (Clone 4RA10 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 557787; RRID:AB_647340 | |
| Anti-mouse CD169 (Siglec-1) (Clone 3D6.112)-Purified | Biolegend | Cat# 142402; RRID:AB_10916523 | |
| Anti-mouse CD182 (CXCR2) (Clone SA044G4)-Purified | Biolegend | Cat# 149302; RRID:AB_2565277 | |
| Anti-mouse CD183 (Clone CXCR3-173)-Purified | Biolegend | Cat# 126502; RRID:AB_1027635 | |
| Anti-mouse CD335 (NKp46) (Clone 29A1.4)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 137625; RRID:AB_2563744 | |
| Anti-mouse CD34 (Clone MEC14.7)-Purified | Biolegend | Cat# 119302; RRID:AB_345280 | |
| Anti-mouse CD41 (Clone MWReg30)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 133919; RRID:AB_2565433 | |
| Anti-Mouse CD43 (Clone S11)-146Nd | Fluidigm | Cat# 3146009B | |
| Anti-Mouse CD48 (Clone HM48.1)-156Gd | Fluidigm | Cat# 3156012B | |
| Anti-mouse CD62L (Clone MEL-14)-MaxPar Ready | ThermoFisher | Cat# 14-1351-82; RRID:AB_467481 | |
| Anti-mouse CD71 (Clone RI7217)-Purified | Biolegend | Cat# 113802; RRID:AB_313563 | |
| Anti-mouse CD90 (Clone G7)-Purified | Biolegend | Cat# 105202; RRID:AB_313169 | |
| Anti-Mouse F4/80 (Clone BM8)-159Tb | Fluidigm | Cat# 3159009B | |
| Anti-mouse FcεRIα (Clone MAR-1)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 134321; RRID:AB_2563768 | |
| Anti-mouse GM-CSF (MP1-22E9 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 554404; RRID:AB_395370 | |
| Anti-Mouse I-A/I-E (Clone M5/114.15.2)-174Yb | Fluidigm | Cat# 3174003B | |
| Anti-Mouse Ki67 (Clone B56 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 556003; RRID:AB_396287 | |
| Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) (Clone D7)-169Tm | Fluidigm | Cat# 3169015B | |
| Anti-Mouse Ly6B (Clone 7/4)-Purified | abcam | Cat# ab53457; RRID:AB_881409 | |
| Anti-mouse Ly-6G (Clone 1A8)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 127637; RRID:AB_2563784 | |
| Anti-Mouse NK1.1 (Clone PK136)-165Ho | Fluidigm | Cat# 3165018B | |
| Anti-Mouse Siglec-F (Clone E50-2440 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 552125; RRID:AB_394340 | |
| Anti-Mouse TCRβ (Clone H57-597)-143Nd | Fluidigm | (Clone H57-597)-143Nd | |
| Anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (Clone TER-119)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 116241; RRID:AB_2563789 | |
| Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins | |||
| Antibody Stabilizer | CANDOR Bioscience | Cat# 130050 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | Cat# A4503 | |
| Cisplatin-194Pt | Fluidigm | Cat# 201194 | |
| eBioscience 1X RBC Lysis Buffer | ThermoFisher | Cat# 00-4333-57 | |
| eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher | Cat# 00-4333-57 | |
| EQ Four Element Calibration Beads | Fluidigm | Cat# 201078 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | ThermoFisher | Cat# AM9260G | |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | Cat# FB-02 | |
| HyClone Phosphate Buffered Saline solution | GE Lifesciences | Cat#SH30256.01 | |
| Intercalator-Ir | Fluidigm | Cat# 201192B | |
| MAXPAR Antibody Labeling Kits | Fluidigm | http://www.dvssciences.com/product-catalog-maxpar.php | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | Cat# 158127 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | Cat# S2002 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | Cat# X100 | |
| Trypsin EDTA 1X | Corning | Cat# 25-053-Cl | |
| Experimental Model: Organism/Strains | |||
| Mouse: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | Stock No: 000664 | |
| Software Alogrithm | |||
| Bead-based Normalizer | Finck et al., 2013 | https://med.virginia.edu/flow-cytometry-facility/wp-content/uploads/sites/170/2015/10/3_Finck-Rachel_CUGM_May2013.pdf | |
| Cytobank | Cytobank | https://www.cytobank.org/ | |
| Cytofkit v1.r.0 | Chen et al., 2016 | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cytofkit.html | |
| t-SNE | van der Maaten and Hinton, 2008 | https://cran.r-project.org/web/packages/Rtsne/index.html | |
References
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