Summary

Préparation de la moelle osseuse entière pour l'analyse de la cytométrie de masse des cellules de lignée neutrophile

Published: June 19, 2019
doi:

Summary

Ici, nous présentons un protocole pour traiter la moelle osseuse fraîche (BM) isolée de la souris ou de l’homme pour la cytométrie de masse de haute dimension (Cytométrie par Time-Of-Flight, CyTOF) analyse des cellules de neutrophile-lignée.

Abstract

Dans cet article, nous présentons un protocole qui est optimisé pour préserver des cellules de neutrophile-ligne dans BM frais pour l’analyse entière de CyTOF de BM. Nous avons utilisé un panneau CyTOF de 39 anticorps myéloïde-biaisé pour évaluer le système hématopoïétique avec un foyer sur les cellules de neutrophile-ligne en utilisant ce protocole. Le résultat de CyTOF a été analysé avec un algorithme de réduction dimensionnelle à ressources ouvertes, viSNE, et les données ont été présentées pour démontrer les résultats de ce protocole. Nous avons découvert de nouvelles populations de cellules de neutrophile basées sur ce protocole. Ce protocole de préparation bM entière fraîche peut être employé pour 1), analyse de CyTOF pour découvrir des populations non identifiées de cellules de BM entière, 2), étudiant des défauts entiers de BM pour des patients présentant des désordres de sang tels que la leucémie, 3), aidant l’optimisation de protocoles de cytométrie de débit fluorescence activés qui utilisent BM entier frais.

Introduction

Au cours des dernières décennies, les méthodes de cytométrie ont été un outil puissant pour étudier le système hématopoïétique dans le BM. Ces méthodes comprennent la cytométrie d’écoulement activée par la fluorescence et la nouvelle méthode de CyTOF utilisant des anticorps étiquetés métal lourd. Ils ont mené à la découverte de nombreux types de cellules dans un spécimen biologique hétérogène en identérant leurs profils uniques d’expression de marqueurde de surface. L’augmentation des chevauchements de spectre associés à un plus grand nombre de canaux entraîne une inexactitude accrue des données dans les applications de cytométrie de débit activée par la fluorescence. Par conséquent, les cellules indésirables sont systématiquement enlevées afin d’enrichir les populations cellulaires d’intérêt pour l’analyse de cytométrie de débit activée par fluorescence. Par exemple, Les cellules Ly6G (ou Gr-1) et CD11b sont considérées comme des marqueurs de cellules myéloïdes matures et les cellules Ly6G(ou Gr-1)et CD11b sont systématiquement retirées des échantillons de BM à l’aide de kits d’enrichissement magnétique avant l’analyse de la cytométrie du flux. cellules souches hématopoïétiques et progénitrices (HSPC) ou en combinant ces marqueurs dans un canal de cocktail à décharge1,2,3. Un autre exemple est que les neutrophiles sont systématiquement retirés du spécimen de sang humain pour enrichir les cellules mononucléaires périphériques de sang (PBMC) pour des études immunologiques. La moelle osseuse entière isolée de la souris ou de l’homme, cependant, est rarement étudiée intacte pour l’analyse de cytométrie.

Récemment, CyTOF est devenu un outil révolutionnaire pour étudier le système hématopoïétique4,5,6. Avec CyTOF, les anticorps étiquetés fluorophore sont remplacés par des anticorps étiquetés par des journalistes à élément lourd. Cette méthode permet de mesurer plus de 40 marqueurs simultanément sans se soucier du chevauchement du spectre. Il a permis l’analyse d’un spécimen biologique intact sans étapes de pré-épuisement ou d’un canal de vidange. Par conséquent, nous pouvons voir le système hématopoïétique de manière complète avec la dimensionnalité à haute teneur à partir des parcelles conventionnelles de cytométrie de flux 2-D. Les populations cellulaires omises dans le passé lors de l’épuisement ou du processus de gating peuvent maintenant être mises en lumière avec les données de haute dimension générées par CyTOF4,5. Nous avons conçu un panneau d’anticorps qui mesure simultanément 39 paramètres dans le système hématopoïétique avec un accent sur le linage myéloïde7. Par rapport aux données conventionnelles de cytométrie de flux, l’interprétation et la visualisation des données unicellulaires sans précédent à haute dimensionnalité générées par CyTOF est un défi. Les scientifiques computationnels ont développé des techniques de réduction de dimensionnalité pour la visualisation des ensembles de données de haute dimension. Dans cet article, nous avons utilisé l’algorithme, viSNE, qui utilise t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding (t-SNE) technique pour analyser les données CyTOF et de présenter le résultat de haute dimension sur une carte en 2 dimensions tout en conservant la structure de haute dimension des données8,9,10. Sur la parcelle tSNE, des cellules similaires sont regroupées en sous-ensembles et la couleur est utilisée pour mettre en évidence la caractéristique des cellules. Par exemple, à la figure 1, les cellules myéloïdes sont réparties dans plusieurs sous-ensembles cellulaires en fonction des similitudes de leurs modèles d’expression de 33 marqueurs de surface résultant de CyTOF (Figure 1)4. Ici nous avons étudié la moelle d’os de souris avec notre panneau précédemment rapporté de 39 marqueurs de CyTOF par l’analysedeviSNE 7. l’analyse viSNE de nos données CyTOF a révélé une population cellulaire non identifiée qui a montré à la fois HSPC (CD117)et neutrophiles (Ly6G)(figure2)7.

En conclusion, nous présentons un protocole pour traiter la moelle osseuse entière fraîche pour l’analyse de CyTOF. Dans cet article, nous avons utilisé la moelle osseuse de souris comme exemple, tandis que ce protocole peut également être utilisé pour traiter des échantillons de moelle osseuse humaine. Les détails spécifiques aux échantillons de moelle osseuse humaine sont également notés dans le protocole. L’avantage de ce protocole est qu’il contient des détails tels que le temps d’incubation et la température qui ont été optimisés pour préserver les cellules de neutrophile dans toute la moelle osseuse pour permettre l’investigation sur la moelle osseuse entière intacte. Ce protocole peut également être facilement modifié pour les applications de cytométrie de débit activée par fluorescence.

Protocol

Toutes les expériences ont suivi les directives approuvées du Comité d’allergie et d’immunologie des animaux de l’Institut La Jolla pour l’allergie et l’immunologie, et l’approbation de l’utilisation des rongeurs a été obtenue de l’Institut La Jolla pour l’allergie et l’immunologie selon les critères décrits dans le Guide for the Care and Use of Laboratory Animals des National Institutes of Health. 1. Récolte de la moelle osseuse de souris (BM) Achetez des souris C57BL/6J aup…

Representative Results

La figure 1 est présentée comme un exemple résultant d’expériences CyTOF. Sur cette parcelle tSNE les cellules à travers plusieurs tissus de souris ont été regroupés en sous-ensembles basés sur la similitude de leurs profils d’expression de marqueur de surface mesurés par un panneau CyTOF de 33 paramètres. Les cellules avec des propriétés plus semblables ont été automatiquement regroupées comme les neutrophiles, les macrophages, ou les DC s’appuyant sur l’expression des 33 ma…

Discussion

Au cours des dernières décennies, la cytométrie à base de fluorescence a été utilisée comme méthode principale pour étudier les lignées cellulaires et l’hétérogénéité1,2,3. Bien que la cytométrie de flux ait fourni des données multidimensionnelles, cette méthode est limitée par des choix de paramètres et de chevauchement spectral. Pour surmonter la faiblesse de la cytométrie d’écoulement, nous avons profit?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous tenons à remercier le noyau de cytométrie de flux de LJI pour l’aide avec la procédure de cytométrie de masse. Ce travail a été soutenu par les subventions des NIH R01HL134236, P01HL136275, et R01CA202987 (tous à C.C.H) et ADA7-12-MN-31 (04) (à C.C.H. et Y.P.Z).

Materials

CyTOF Antibodies (mouse)
Anti-Mouse CD45 (Clone 30-F11) -89Y Fluidigm Cat# 3089005B
Anti-Human/Mouse CD45R/B220 (Clone RA36B2)-176Yb Fluidigm Cat# 3176002B
Anti-mouse CD105 (Clone MJ7/18)-Purified Biolegend Cat# 120402; RRID:AB_961070
Anti-mouse CD115 (CSF-1R) (Clone AFS98)-Purified Biolegend Cat# 135502; RRID:AB_1937293
Anti-Mouse CD117/c-kit (Clone 2B8)-166Er Fluidigm Cat# 3166004B
Anti-mouse CD11a (Clone M17/4)-Purified Biolegend Cat# 101101; RRID:AB_312774
Anti-Mouse CD11b (Clone M1/70)-148Nd Fluidigm Cat# 3148003B
Anti-Mouse CD11c (Clone N418)-142Nd Fluidigm Cat# 3142003B
Anti-mouse CD127 (IL-7Rα) (Clone A7R34)-MaxPar Ready Biolegend Cat# 133919; RRID:AB_2565433
Anti-Mouse CD150 (Clone TC1512F12.2)-167Er Fluidigm Cat# 3167004B
Anti-mouse CD16.2 (FcγRIV) (Clone 9E9)-Purified Biolegend Cat# 149502; RRID:AB_2565302
Anti-Mouse CD162 (Clone 4RA10 (RUO))-Purified BD Biosciences Cat# 557787; RRID:AB_647340
Anti-mouse CD169 (Siglec-1) (Clone 3D6.112)-Purified Biolegend Cat# 142402; RRID:AB_10916523
Anti-mouse CD182 (CXCR2) (Clone SA044G4)-Purified Biolegend Cat# 149302; RRID:AB_2565277
Anti-mouse CD183 (Clone CXCR3-173)-Purified Biolegend Cat# 126502; RRID:AB_1027635
Anti-mouse CD335 (NKp46) (Clone 29A1.4)-MaxPar Ready Biolegend Cat# 137625; RRID:AB_2563744
Anti-mouse CD34 (Clone MEC14.7)-Purified Biolegend Cat# 119302; RRID:AB_345280
Anti-mouse CD41 (Clone MWReg30)-MaxPar Ready Biolegend Cat# 133919; RRID:AB_2565433
Anti-Mouse CD43 (Clone S11)-146Nd Fluidigm Cat# 3146009B
Anti-Mouse CD48 (Clone HM48.1)-156Gd Fluidigm Cat# 3156012B
Anti-mouse CD62L (Clone MEL-14)-MaxPar Ready ThermoFisher Cat# 14-1351-82; RRID:AB_467481
Anti-mouse CD71 (Clone RI7217)-Purified Biolegend Cat# 113802; RRID:AB_313563
Anti-mouse CD90 (Clone G7)-Purified Biolegend Cat# 105202; RRID:AB_313169
Anti-Mouse F4/80 (Clone BM8)-159Tb Fluidigm Cat# 3159009B
Anti-mouse FcεRIα (Clone MAR-1)-MaxPar Ready Biolegend Cat# 134321; RRID:AB_2563768
Anti-mouse GM-CSF (MP1-22E9 (RUO))-Purified BD Biosciences Cat# 554404; RRID:AB_395370
Anti-Mouse I-A/I-E (Clone M5/114.15.2)-174Yb Fluidigm Cat# 3174003B
Anti-Mouse Ki67 (Clone B56 (RUO))-Purified BD Biosciences Cat# 556003; RRID:AB_396287
Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) (Clone D7)-169Tm Fluidigm Cat# 3169015B
Anti-Mouse Ly6B (Clone 7/4)-Purified abcam Cat# ab53457; RRID:AB_881409
Anti-mouse Ly-6G (Clone 1A8)-MaxPar Ready Biolegend Cat# 127637; RRID:AB_2563784
Anti-Mouse NK1.1 (Clone PK136)-165Ho Fluidigm Cat# 3165018B
Anti-Mouse Siglec-F (Clone E50-2440 (RUO))-Purified BD Biosciences Cat# 552125; RRID:AB_394340
Anti-Mouse TCRβ (Clone H57-597)-143Nd Fluidigm (Clone H57-597)-143Nd
Anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (Clone TER-119)-MaxPar Ready Biolegend Cat# 116241; RRID:AB_2563789
Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins
Antibody Stabilizer CANDOR Bioscience Cat# 130050
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich Cat# A4503
Cisplatin-194Pt Fluidigm Cat# 201194
eBioscience 1X RBC Lysis Buffer ThermoFisher Cat# 00-4333-57
eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set ThermoFisher Cat# 00-4333-57
EQ Four Element Calibration Beads Fluidigm Cat# 201078
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) ThermoFisher Cat# AM9260G
Fetal Bovine Serum Omega Scientific Cat# FB-02
HyClone Phosphate Buffered Saline solution GE Lifesciences Cat#SH30256.01
Intercalator-Ir Fluidigm Cat# 201192B
MAXPAR Antibody Labeling Kits Fluidigm http://www.dvssciences.com/product-catalog-maxpar.php
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich Cat# 158127
Sodium azide Sigma-Aldrich Cat# S2002
Triton X-100 Sigma-Aldrich Cat# X100
Trypsin EDTA 1X Corning Cat# 25-053-Cl
Experimental Model: Organism/Strains
Mouse: C57BL/6J The Jackson Laboratory Stock No: 000664
Software Alogrithm
Bead-based Normalizer Finck et al., 2013 https://med.virginia.edu/flow-cytometry-facility/wp-content/uploads/sites/170/2015/10/3_Finck-Rachel_CUGM_May2013.pdf
Cytobank Cytobank https://www.cytobank.org/
Cytofkit v1.r.0 Chen et al., 2016 https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cytofkit.html
t-SNE van der Maaten and Hinton, 2008 https://cran.r-project.org/web/packages/Rtsne/index.html

References

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Cite This Article
Zhu, Y. P., Padgett, L., Dinh, H. Q., Marcovecchio, P., Wu, R., Hinz, D., Kim, C., Hedrick, C. C. Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells. J. Vis. Exp. (148), e59617, doi:10.3791/59617 (2019).

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