Summary

Preparação de medula óssea inteira para análise de citometria de massa de células de linhagem de neutrófilos

Published: June 19, 2019
doi:

Summary

Aqui, nós apresentamos um protocolo para processar a medula fresca (BM) isolada do rato ou do ser humano para a análise de massa High-dimensional da citometria (citometria pela tempo–vôo, cytof) de pilhas da neutrófilos-linhagem.

Abstract

Neste artigo, nós apresentamos um protocolo que seja aperfeiçoado para preservar pilhas da neutrófilos-linhagem no BM fresco para a análise inteira de BM CyTOF. Nós utilizamos um painel Myeloid-tendencioso do CyTOF do 39-anticorpo para avaliar o sistema hematopoietic com um foco nas pilhas da neutrófilos-linhagem usando este protocolo. O resultado do CyTOF foi analisado com um algoritmo de redução dimensional de recurso aberto, o viSNE, e os dados foram apresentados para demonstrar o desfecho deste protocolo. Descobrimos novas populações de células de linhagem de neutrófilos com base neste protocolo. Este protocolo da preparação inteira fresca do BM pode ser usado para 1), análise de CyTOF para descobrir populações não identificadas da pilha do BM inteiro, 2), investigando defeitos inteiros do BM para pacientes com desordens de sangue tais como a leucemia, 3), auxiliando a optimização de protocolos de citometria de fluxo ativados por fluorescência que utilizam BM inteiro fresco.

Introduction

Nas últimas décadas, os métodos de citometria têm sido uma poderosa ferramenta para investigar o sistema hematopoiético na BM. Esses métodos incluem citometria de fluxo ativada por fluorescência e o novo método de CyTOF usando anticorpos com rótulo de metal pesado. Conduziram às descobertas de muitos tipos da pilha em um espécime biológico heterogêneo pela identificação de seus perfis originais da expressão do marcador de superfície. As sobreposições aumentadas do espectro que é associada com mais canaletas conduzem à inexatidão de dados mais elevada em aplicações fluorescência-ativadas da citometria do fluxo. Conseqüentemente, as pilhas indesejadas são removidas rotineiramente a fim enriquecer populações da pilha do interesse para a análise fluorescência-ativada do fluxo citometria. Por exemplo, Ly6G (ou GR-1) e CD11b são considerados marcadores de células mielóides maduros e Ly6G+ (ou GR-1+) e células CD11b+ são ROTINEIRAMENTE removidas das amostras de BM usando kits de enriquecimento magnético antes da análise de citometria de fluxo de tronco hematopoiético e células progenitoras (hspcs) ou combinando esses marcadores em um canal de coquetel de despejo1,2,3. Um outro exemplo é que os neutrófilos são removidos rotineiramente do espécime humano do sangue para enriquecer pilhas mononucleares do sangue periférico (PBMC) para estudos imunológicos. A medula óssea inteira isolada do rato ou do ser humano, entretanto, é investigada raramente intact para a análise da citometria.

Recentemente, cytof tornou-se uma ferramenta revolucionária para investigar o sistema hematopoiético4,5,6. Com CyTOF, os anticorpos etiquetados fluorophore são substituídos por anticorpos repórter-etiquetados do elemento pesado. Este método permite a medição de mais de 40 marcadores simultaneamente sem a preocupação de sobreposição de espectro. Permitiu a análise do espécime biológico intacto sem etapas da pre-depleção ou de uma canaleta da descarga. Portanto, podemos ver o sistema hematopoiético de forma abrangente com dimensionalidade de alto conteúdo a partir de parcelas convencionais de citometria de fluxo 2-D. As populações de células omitidas no passado durante o processo de depleção ou gating agora podem ser trazidas à luz com os dados de alta dimensão gerados pelo cytof4,5. Nós projetamos um painel do anticorpo que mede simultaneamente 39 parâmetros no sistema hematopoietic com um foco no linage Myeloid7. Em comparação com os dados convencionais de citometria de fluxo, a interpretação e visualização dos dados de células unidimensionais sem precedentes gerados pela CyTOF é um desafio. Os cientistas computacionais desenvolveram técnicas de redução de dimensionalidade para a visualização de conjuntos de dados de alta dimensão. Neste artigo, utilizamos o algoritmo viSNE, que utiliza a técnica t-Distributed Stochastic Neighbor incorporação (t-SNE) para analisar os dados CyTOF e apresentar o resultado de alta dimensão em um mapa de 2 dimensões, conservando a estrutura de alta dimensão dos dados8,9,10. No gráfico tSNE, células semelhantes são agrupadas em subconjuntos e a cor é usada para realçar o recurso das células. Por exemplo, na Figura 1 as células mielóides são distribuídas em vários subconjuntos de células com base nas semelhanças de seus padrões de expressão de 33 marcadores de superfície resultantes de cytof (Figura 1)4. Aqui nós investigamos a medula do osso do rato com nosso painel previamente relatado do CyTOF do 39-Marker pela análise7de visne. a análise de visne de nossos dados de cytof revelou uma população não identificada da pilha que mostrasse características de hspc (CD117+) e de neutrófilos (Ly6G+) (Figura 2)7.

Em conclusão, nós apresentamos um protocolo para processar a medula inteira fresca do osso para a análise de CyTOF. Neste artigo, nós usamos a medula óssea do rato como um exemplo, quando este protocolo puder igualmente ser usado para processar amostras humanas da medula. Os detalhes específicos para amostras de medula óssea humana também são observados no protocolo. A vantagem deste protocolo é que contem detalhes tais como o tempo e a temperatura da incubação que foram aperfeiçoados para preservar pilhas da neutrófilos-linhagem na medula inteira para permitir a investigação na medula inteira intacta do osso. Este protocolo também pode ser facilmente modificado para aplicações de citometria de fluxo ativada por fluorescência.

Protocol

Todos os experimentos seguiram as diretrizes aprovadas do Instituto La Jolla para o Comitê de cuidados e uso de animais de alergia e Imunologia, e a aprovação para o uso de roedores foi obtida do Instituto La Jolla para alergia e Imunologia, de acordo com critérios descritos em o guia para o cuidado e uso de animais de laboratório dos institutos nacionais de saúde. 1. colheita da medula óssea do rato (BM) Compre camundongos C57BL/6J de um vendedor comercial. Alimente a dieta e…

Representative Results

A Figura 1 é apresentada como um resultado de exemplo de experimentos cytof. Neste gráfico de tSNE as células em vários tecidos de mouse foram agrupadas em subconjuntos com base na semelhança de seus perfis de expressão de marcador de superfície medidos por um painel CyTOF 33-Parameter. As células com propriedades mais semelhantes foram agrupadas automaticamente, como os neutrófilos, macrófagos ou os DCs com base na expressão dos marcadores 33 em cada célula. <p class="jove_c…

Discussion

Nas últimas décadas, a citometria de fluxo à base de fluorescência foi utilizada como método principal para estudar linhagens celulares e heterogeneidade1,2,3. Embora a citometria de fluxo tenha fornecido dados multidimensionais, este método é limitado por opções de parâmetros e sobreposição espectral. Para superar a fraqueza do fluxo citometria nós aproveitamos de cytof, que usa isótopos do metal pesado em vez dos…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gostaríamos de agradecer ao núcleo de citometria de fluxo LJI para assistência com procedimento de citometria de massas. Este trabalho foi apoiado por NIH Grants R01HL134236, P01HL136275, e R01CA202987 (all to C. C. H) e ADA7-12-MN-31 (04) (para C.C.H. e Y. P. Z).

Materials

CyTOF Antibodies (mouse)
Anti-Mouse CD45 (Clone 30-F11) -89Y Fluidigm Cat# 3089005B
Anti-Human/Mouse CD45R/B220 (Clone RA36B2)-176Yb Fluidigm Cat# 3176002B
Anti-mouse CD105 (Clone MJ7/18)-Purified Biolegend Cat# 120402; RRID:AB_961070
Anti-mouse CD115 (CSF-1R) (Clone AFS98)-Purified Biolegend Cat# 135502; RRID:AB_1937293
Anti-Mouse CD117/c-kit (Clone 2B8)-166Er Fluidigm Cat# 3166004B
Anti-mouse CD11a (Clone M17/4)-Purified Biolegend Cat# 101101; RRID:AB_312774
Anti-Mouse CD11b (Clone M1/70)-148Nd Fluidigm Cat# 3148003B
Anti-Mouse CD11c (Clone N418)-142Nd Fluidigm Cat# 3142003B
Anti-mouse CD127 (IL-7Rα) (Clone A7R34)-MaxPar Ready Biolegend Cat# 133919; RRID:AB_2565433
Anti-Mouse CD150 (Clone TC1512F12.2)-167Er Fluidigm Cat# 3167004B
Anti-mouse CD16.2 (FcγRIV) (Clone 9E9)-Purified Biolegend Cat# 149502; RRID:AB_2565302
Anti-Mouse CD162 (Clone 4RA10 (RUO))-Purified BD Biosciences Cat# 557787; RRID:AB_647340
Anti-mouse CD169 (Siglec-1) (Clone 3D6.112)-Purified Biolegend Cat# 142402; RRID:AB_10916523
Anti-mouse CD182 (CXCR2) (Clone SA044G4)-Purified Biolegend Cat# 149302; RRID:AB_2565277
Anti-mouse CD183 (Clone CXCR3-173)-Purified Biolegend Cat# 126502; RRID:AB_1027635
Anti-mouse CD335 (NKp46) (Clone 29A1.4)-MaxPar Ready Biolegend Cat# 137625; RRID:AB_2563744
Anti-mouse CD34 (Clone MEC14.7)-Purified Biolegend Cat# 119302; RRID:AB_345280
Anti-mouse CD41 (Clone MWReg30)-MaxPar Ready Biolegend Cat# 133919; RRID:AB_2565433
Anti-Mouse CD43 (Clone S11)-146Nd Fluidigm Cat# 3146009B
Anti-Mouse CD48 (Clone HM48.1)-156Gd Fluidigm Cat# 3156012B
Anti-mouse CD62L (Clone MEL-14)-MaxPar Ready ThermoFisher Cat# 14-1351-82; RRID:AB_467481
Anti-mouse CD71 (Clone RI7217)-Purified Biolegend Cat# 113802; RRID:AB_313563
Anti-mouse CD90 (Clone G7)-Purified Biolegend Cat# 105202; RRID:AB_313169
Anti-Mouse F4/80 (Clone BM8)-159Tb Fluidigm Cat# 3159009B
Anti-mouse FcεRIα (Clone MAR-1)-MaxPar Ready Biolegend Cat# 134321; RRID:AB_2563768
Anti-mouse GM-CSF (MP1-22E9 (RUO))-Purified BD Biosciences Cat# 554404; RRID:AB_395370
Anti-Mouse I-A/I-E (Clone M5/114.15.2)-174Yb Fluidigm Cat# 3174003B
Anti-Mouse Ki67 (Clone B56 (RUO))-Purified BD Biosciences Cat# 556003; RRID:AB_396287
Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) (Clone D7)-169Tm Fluidigm Cat# 3169015B
Anti-Mouse Ly6B (Clone 7/4)-Purified abcam Cat# ab53457; RRID:AB_881409
Anti-mouse Ly-6G (Clone 1A8)-MaxPar Ready Biolegend Cat# 127637; RRID:AB_2563784
Anti-Mouse NK1.1 (Clone PK136)-165Ho Fluidigm Cat# 3165018B
Anti-Mouse Siglec-F (Clone E50-2440 (RUO))-Purified BD Biosciences Cat# 552125; RRID:AB_394340
Anti-Mouse TCRβ (Clone H57-597)-143Nd Fluidigm (Clone H57-597)-143Nd
Anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (Clone TER-119)-MaxPar Ready Biolegend Cat# 116241; RRID:AB_2563789
Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins
Antibody Stabilizer CANDOR Bioscience Cat# 130050
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich Cat# A4503
Cisplatin-194Pt Fluidigm Cat# 201194
eBioscience 1X RBC Lysis Buffer ThermoFisher Cat# 00-4333-57
eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set ThermoFisher Cat# 00-4333-57
EQ Four Element Calibration Beads Fluidigm Cat# 201078
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) ThermoFisher Cat# AM9260G
Fetal Bovine Serum Omega Scientific Cat# FB-02
HyClone Phosphate Buffered Saline solution GE Lifesciences Cat#SH30256.01
Intercalator-Ir Fluidigm Cat# 201192B
MAXPAR Antibody Labeling Kits Fluidigm http://www.dvssciences.com/product-catalog-maxpar.php
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich Cat# 158127
Sodium azide Sigma-Aldrich Cat# S2002
Triton X-100 Sigma-Aldrich Cat# X100
Trypsin EDTA 1X Corning Cat# 25-053-Cl
Experimental Model: Organism/Strains
Mouse: C57BL/6J The Jackson Laboratory Stock No: 000664
Software Alogrithm
Bead-based Normalizer Finck et al., 2013 https://med.virginia.edu/flow-cytometry-facility/wp-content/uploads/sites/170/2015/10/3_Finck-Rachel_CUGM_May2013.pdf
Cytobank Cytobank https://www.cytobank.org/
Cytofkit v1.r.0 Chen et al., 2016 https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cytofkit.html
t-SNE van der Maaten and Hinton, 2008 https://cran.r-project.org/web/packages/Rtsne/index.html

References

  1. Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404, 193-197 (2000).
  2. Iwasaki, H., Akashi, K. Myeloid lineage commitment from the hematopoietic stem cell. Immunity. 26, 726-740 (2007).
  3. Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99, 11872-11877 (2002).
  4. Becher, B., et al. High-dimensional analysis of the murine myeloid cell system. Nature Immunology. 15, 1181-1189 (2014).
  5. Bendall, S. C., et al. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science. 332, 687-696 (2011).
  6. Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. Automated mapping of phenotype space with single-cell data. Nature Methods. 13, 493-496 (2016).
  7. Zhu, Y. P., et al. Identification of an Early Unipotent Neutrophil Progenitor with Pro-tumoral Activity in Mouse and Human Bone Marrow. Cell Reports. 24, 2329-2341 (2018).
  8. Van der Maaten, L. J. P., Hinton, G. E. Visualizing High-Dimensional Data Using t-SNE. Journal of Machine Learning Research. 9, 2579-2605 (2008).
  9. Amir, E. A. D., et al. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nature Biotechnology. 31, 545-552 (2013).
  10. van der Maaten, L., Hinton, G. Visualizing data using t-SNE. Journal of Machine Learning Research. 9 (85), 2579-2065 (2008).
  11. Cloos, J., et al. Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia. Journal of Visualized Experiment. 133, 56386 (2018).
  12. Bendall, S. C., Nolan, G. P., Roederer, M., Chattopadhyay, P. K. A deep profiler’s guide to cytometry. Trends in Immunology. 33, 323-332 (2012).
  13. Ley, K., et al. Neutrophils: New insights and open questions. Science Immunology. 3 (30), 4579 (2018).
  14. Ng, L. G., Ostuni, R., Hidalgo, A. Heterogeneity of neutrophils. Nature Reviews in Immunology. , (2019).

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Cite This Article
Zhu, Y. P., Padgett, L., Dinh, H. Q., Marcovecchio, P., Wu, R., Hinz, D., Kim, C., Hedrick, C. C. Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells. J. Vis. Exp. (148), e59617, doi:10.3791/59617 (2019).

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