قياس BK-polyomavirus غير الترميز السيطرة المنطقة مدفوعة النشاط النسخي عن طريق قياس التدفق
Summary
في هذه المخطوطة، يتم تقديم بروتوكول لإجراء قياس يستند إلى FACS للنشاط النسخي لفيروس الورم الأوب باستخدام خلايا HEK293T المنقولة مع بلازميد مراسل ثنائي الاتجاه يعبر عن tdTomato وeGFP. كما تسمح هذه الطريقة بتحديد تأثير المركبات الجديدة على النسخ الفيروسي بشكل كمي.
Abstract
يمكن أن تسبب الفيروسات المتعددة، مثل فيروس الورم المتعدد BK (BKPyV)، أمراضًا حادة لفي المرضى الذين يعانون من ضعف المناعة. ومع ذلك، بما أن مضادات الفيروسات عالية الفعالية غير متوفرة حالياً، فإن هناك حاجة إلى أساليب لقياس تأثير العوامل المضادة للفيروسات المحتملة. هنا، تم بناء مراسل الفلورة المزدوجة التي تسمح بتحليل BKPyV غير الترميز السيطرة المنطقة (NCCR) مدفوعة في وقت مبكر ونشاط المروج في وقت متأخر لتحديد تأثير الأدوية المضادة للفيروسات المحتملة على التعبير الجيني الفيروسي عن طريق tdTomato وeGFP التعبير. وبالإضافة إلى ذلك، عن طريق استنساخ التضخيم BKPyV-NCCR التي تم الحصول عليها في هذا البروتوكول بشكل مثالي من الحمض النووي المستمدة من الدم من المرضى الذين زرعوا الكلى المناعية، يمكن تحديد تأثير إعادة ترتيب NCCR على التعبير الجيني الفيروسي. بعد استنساخ التضخيم المشتقة من المريض، تم نقل خلايا HEK293T مع البلازميدات المراسل، وعولجت مع العوامل المضادة للفيروسات المحتملة. وفي وقت لاحق، خضعت الخلايا لتحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية لقياس متوسط كثافة الفلورة 72 ساعة بعد الانتراب. لاختبار أيضا تحليل الأدوية التي لها دورة الخلية المحتملة تثبيط تأثير, يتم استخدام الخلايا الفلورية فقط وبالتالي. بما أنّ هذا فحص يكون أنجزت في كبيرة [ت] مستضد عبّر عن خلايا, التأثير صدمة من مبكّرة وتعبير متأخّرة يستطيع كنت حللت في طريقة مستقلّة متبادلة.
Introduction
تمثل فيروسات الورم اللامع عائلة مستقلة من فيروسات الحمض النووي المزدوج (dsDNA) الصغيرة التي تقطعت بها السبل مع فيروس سيميان 40 (SV40) كنوع أولي. تحدث العدوى الأولية بشكل رئيسي خلال مرحلة الطفولة، والتي عادة ما تستمر دون أعراض المرض وعادة ما تسبب التهابات كامنة في المضيفين المختصة المناعية. فيروس الورم الحميد BK (BKPyV) يستمر بشكل رئيسي في خلايا الأنابيب الكلوية دون التسبب في أمراض الكلى، ومع ذلك، في حالة ضعف الكفاءة المناعية بعد زرع الكلى يمكن أن يعيد تنشيط الفيروس ويسبب أضرار شديدة وضعف الكسب غير المشروع وظيفة عند الوصول إلى فيرميا عالية (1 × 104 BKPyV نسخ الحمض النووي / مل)1،2. في ما يقرب من 10٪ من متلقي زراعة الكلى، يؤدي إعادة تنشيط فيروس الورم البولي BK (BKPyV) إلى اعتلال الكلى المرتبط بفيروس الورم الحميد (PyVAN)، والذي كان يصل إلى 80٪ المرتبطة بارتفاع خطر فشل الطعوم الكلوية3،4 . وبما أنه لا تتوفر أي عوامل مضادة للفيروسات المعتمدة، يقوم العلاج الحالي على الحد من كبت المناعة. ومن المثير للاهتمام, مثبطات mTOR يبدو أن لها تأثير مضاد للفيروسات; وبالتالي، فإن تحويل العلاج المثبط للمناعة إلى كبت المناعة القائم على mTOR قد يمثل نهجا بديلا لمنع تطور فيرميا BKPyV5،6،7. ومع ذلك، فإن الآلية المضادة للفيروسات المستندة إلى mTOR لا تزال حاليا غير مفهومة بشكل كامل. وبالتالي، هناك حاجة إلى طرق لقياس تأثير العوامل المضادة للفيروسات المحتملة في التركيزات ذات الصلة سريرياً.
يتكون الجينوم الدائري للBKPyV من حوالي 5 كيلو بايت يؤوي منطقة تحكم غير ترميزية (NCCR) التي تعمل كأصل للنسخ المتماثل وفي الوقت الذي يقوم فيه مروج ثنائي الاتجاه يقود التعبير عن النصوص في مرحلة مبكرة ومتأخرة من الحمض النووي الريبي. منذ تحدث تلقائيا NCCR-إعادة ترتيب، يتم العثور على الحذف، والازدواجية في BKPyV المسببة للأمراض8 وتراكمت بشكل كبير في المرضى الذين يعانون من PVAN5،9، مقارنة بين archetypical (الوزن) و إعادة ترتيب (ص) NCCR الأنشطة مفيدة لوصف اللياقة البدنية فيروسي ة.
كما هو ملخص في الشكل 1، يصف هذا البروتوكول طريقة شائعة الاستخدام لقياس نشاط النسخ BKPyV NCCR من خلال قياس الفلورة من اثنين من الفلوروفور tdTomato وeGFP أعرب عنها من بلازميد مراسل5، 9،10،11. يتم تنفيذ هذا الإجراء في وجود مستضد T SV40 كبيرة (lTAg)، والذي يسمح لتحليل تأثير العوامل المضادة للفيروسات المحتملة على نشاط NCCR في وقت مبكر ومتأخر بشكل منفصل5. ويحلل هذا التقييم كذلك أثر إعادة الترتيب على نشاط اللجنة الوطنية للامتحانات والمقارنة مع التقارير الوطنية المتعلقة بالموارد المعتمدة في مجال الصدمات الأرضية5و9. مراسل بلازميد يأوي إشارة SV40 في وقت متأخر polyadenylation المصب من كل إطار القراءة المفتوحة فلوروفور لضمان معالجة قابلة للمقارنة وفعالة من كل من النصوص لtdTomato وeGFP، على التوالي. بالمقارنة مع أساليب qRT-PCR القائمة5،12،وهذا النهج القائم على FACS يمثل منخفضة التكلفة وعالية الإنتاجية البديل متوافق منذ عدم وجود بروتوكولات استخراج معقدة لثقافة الخلايا المصابة وليس مكلفة هناك حاجة إلى الأجسام المضادة لتلطيخ الفلورة المناعية. وعلاوة على ذلك، منذ يتم تحليل كمية محددة من الخلايا الفلورية عن طريق قياس التدفق الخلوي، وتحليل دورة الخلية تثبيط وكلاء ممكن أيضا بطريقة كمية.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه المقالة، يتم عرض طريقة شائعة الاستخدام تسمح بتحليل منطقة التحكم غير الترميز BKPyV (NCCR) مدفوعة نشاط المروج المبكر والمتأخر. يمكن قياس نشاط NCCR في وقت واحد ولا يحتاج إلى lysis من الخلايا المنقولة. وعلاوة على ذلك، يمكن تحليل عدد كبير نسبيا من الخلايا والمشاركة في نقل علامات إضافية لتطبيع قيم …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويشكر أصحاب البلاغ باربرا بليكمان على مساعدتها التقنية الممتازة. وقد تم دعم هذه الدراسات من قبل برنامج IFORES التابع لجامعة دويسبورغ- إيسن وكلية الطب في جامعة دويسبورغ- إيسن وبرنامج RIMUR التابع لتحالف جامعة روهر ومركز أبحاث ميركاتور رور (MERCUR). ويشكر المؤلفون يورغن – مانشوت – ستيفتونغ على زمالة الدكتوراه التي حصلت عليها هيلين سيرتزنغ وعلى الدعم المستمر. وقد وافقت لجنة الأخلاقيات في كلية الطب في جامعة دويسبورغ-إيسن (14-6028-BO) على جمع واستخدام مواد المرضى.
Materials
| 100 bp ladder | NEB | N3231 | Any ladder with a range up to 1 kb can be substituted |
| 2-log ladder | NEB | N0550 | Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted |
| Agar-Agar, Kobe I | Carl Roth | 5210.3 | |
| AgeI-HF | NEB | R3552 | |
| Ampicillin Natriumsalz Cellpure | Carl Roth | HP62.1 | |
| Aqua ad iniectabilia | Bbraun | 2351744 | can be substituted by any manufacturer |
| BD FACSCanto™ II | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva | BD Biosciences | ||
| DAPI | Sigma | 10236276001 | |
| DFC450C camera module | Leica | Any camera can be used | |
| DMEM | Gibco | 41966-029 | can be substituted by any manufacturer |
| DMIL LED microscope | Leica | Any fluorescence microscope can be used | |
| DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51104 | can be substituted by any manufacturer |
| E.coli DH5alpha Competent Cells | Thermo Scientific | 18258012 | |
| FBS Superior | MerckMillipore | 50615 | Any FBS can be used |
| FlowJo v10.5.3 | FlowJo, LLC | Any flow cytometry software FBS can be used | |
| Gel Loading Dye, Purple (6X) | NEB | B7024 | Any 6x loading dye can be substituted |
| HEK293T cells | ATCC | 11268 | These cells constitutively express the simian virus 40 (SV40) large T antigen, and clone 17 was selected specifically for its high transfectability. |
| HERAcell® 240i CO2 Incubator | Thermo Scientific | can be substituted by any manufacturer | |
| HotStar PCR kit | Qiagen | 203203 | |
| Intas Gel documentation system | Intas | Any visualisation system for stained DNA containing agarose gels can be used | |
| Low Melt Agarose | Biozym | 850081 | can be substituted by any manufacturer |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985070 | can be substituted by any manufacturer |
| pBKV (34-2) | ATCC | 45025 | Plasmid harboring the full-length genome of BKPyV strain Dunlop; was used as a positive control; DNA Seq. Acc.: KP412983 |
| PBS | Gibco | 14190-136 | |
| PCR Cycler MJ Mini 48-Well Personal Cycler | Bio-Rad | discontinued product | Any thermocycler can be used |
| PCR Nucleotide Mix, 10 mM | Promega | #C1145 | can be substituted by any manufacturer |
| PCR1 and PCR2 Primers | metabion | not applicable | Desalted. Dilute to (10 µM) with PCR grade water |
| PenStrep (100x) | Gibco | 15140-122 | can be substituted by any manufacturer |
| Roti®-GelStain | Carl Roth | 3865 | A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration |
| SpeI-HF | NEB | R3133 | |
| T4-DNA Ligase | NEB | M0202 | |
| TransIT LT1 | Mirus | MIR2300 | |
| Trypsin 0.05% – EDTA | Gibco | 25300-054 | can be substituted by any manufacturer |
| ZymoPURE II Plasmid Kit | Zymo | D4201 | can be substituted by any manufacturer |
References
- Drachenberg, C. B., et al. Histological patterns of polyomavirus nephropathy: correlation with graft outcome and viral load. American Journal of Transplant. 4 (12), 2082-2092 (2004).
- Korth, J., et al. Impact of low-level BK polyomavirus viremia on intermediate-term renal allograft function. Transplant Infectious Disease. 20 (1), (2018).
- Hirsch, H. H., et al. European perspective on human polyomavirus infection, replication and disease in solid organ transplantation. Clinical Microbiology and Infection. 20 Suppl 7, 74-88 (2014).
- Masutani, K., et al. The Banff 2009 Working Proposal for polyomavirus nephropathy: a critical evaluation of its utility as a determinant of clinical outcome. American Journal of Transplantation. 12 (4), 907-918 (2012).
- Korth, J., et al. Impact of immune suppressive agents on the BK-Polyomavirus non coding control region. Antiviral Research. 159, 68-76 (2018).
- Hirsch, H. H., Yakhontova, K., Lu, M., Manzetti, J. BK Polyomavirus Replication in Renal Tubular Epithelial Cells Is Inhibited by Sirolimus, but Activated by Tacrolimus Through a Pathway Involving FKBP-12. Amerian Journal of Transplantation. 16 (3), 821-832 (2016).
- Sanchez Fructuoso, A. I., et al. Mammalian target of rapamycin signal inhibitors could play a role in the treatment of BK polyomavirus nephritis in renal allograft recipients. Transplant Infectious Disease. 13 (6), 584-591 (2011).
- Moens, U., Johansen, T., Johnsen, J. I., Seternes, O. M., Traavik, T. Noncoding control region of naturally occurring BK virus variants: sequence comparison and functional analysis. Virus Genes. 10 (3), 261-275 (1995).
- Gosert, R., et al. Polyomavirus BK with rearranged noncoding control region emerge in vivo in renal transplant patients and increase viral replication and cytopathology. Journal of Experimental Medicine. 205 (4), 841-852 (2008).
- Bethge, T., et al. Sp1 sites in the noncoding control region of BK polyomavirus are key regulators of bidirectional viral early and late gene expression. Journal of Virology. 89 (6), 3396-3411 (2015).
- Gosert, R., Kardas, P., Major, E. O., Hirsch, H. H. Rearranged JC virus noncoding control regions found in progressive multifocal leukoencephalopathy patient samples increase virus early gene expression and replication rate. Journal of Virology. 84 (20), 10448-10456 (2010).
- Bernhoff, E., Gutteberg, T. J., Sandvik, K., Hirsch, H. H., Rinaldo, C. H. Cidofovir inhibits polyomavirus BK replication in human renal tubular cells downstream of viral early gene expression. American Journal of Transplantation. 8 (7), 1413-1422 (2008).
- Widera, M., et al. HIV-1 persistent viremia is frequently followed by episodes of low-level viremia. Medical Microbiology Immunology. , (2017).
- Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. Journal of Visualized Experiment. (6), 247 (2007).
- Drew, R. J., Walsh, A., Laoi, B. N., Crowley, B. Phylogenetic analysis of the complete genome of 11 BKV isolates obtained from allogenic stem cell transplant recipients in Ireland. Journal of Medical Virology. 84 (7), 1037-1048 (2012).
- Dorries, K., Vogel, E., Gunther, S., Czub, S. Infection of human polyomaviruses JC and BK in peripheral blood leukocytes from immunocompetent individuals. Virology. 198 (1), 59-70 (1994).
- Teutsch, K., et al. Early identification of renal transplant recipients with high risk of polyomavirus-associated nephropathy. Medical Microbiology Immunology. 204 (6), 657-664 (2015).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiment. (41), (2010).
- Korth, J., et al. The detection of BKPyV genotypes II and IV after renal transplantation as a simple tool for risk assessment for PyVAN and transplant outcome already at early stages of BKPyV reactivation. Journal of Clinical Virology. 113, 14-19 (2019).
- Caputo, A., Barbanti-Brodano, G., Wang, E., Ricciardi, R. P. Transactivation of BKV and SV40 early promoters by BKV and SV40 T-antigens. Virology. 152 (2), 459-465 (1986).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
