מדידה של מחוז בקרת וירוס BK-פוליפוניים שאינו קידוד מונחה פעילות באמצעות הזרמת שפות
Summary
בכתב יד זה, פרוטוקול מוצג לבצע מדידה מבוססת FACS של וירוס BK-poly, באמצעות שימוש בתאי HEK293T באמצעות כתבת דו-מפלסי של כתב דו-כיווני המבטא tdTomato ו-eGFP. שיטה זו מאפשרת לקבוע את ההשפעה של תרכובות הרומן על תמלול ויראלי.
Abstract
וירוסים מפולדונים, כמו וירוס BK-polyדונים (BKPyV), יכול לגרום לפתווגיות חמורות בחולים חיסוני. עם זאת, מאז אנטי ויראלים יעילים מאוד אינם זמינים כרגע, שיטות מדידת ההשפעה של סוכני אנטי ויראליות פוטנציאליים נדרשים. כאן, כתב פלואורסצנטית כפול המאפשר ניתוח של BKPyV שאינו קידוד בקרת האזור (NCCR) מונחה מוקדם ומאוחר הפעילות יזם נבנה כדי לכמת את ההשפעה של תרופות אנטי ויראליות פוטנציאליים על ביטוי גנים נגיפי באמצעות tdTomato ו eGFP ביטוי. בנוסף, על ידי שיבוט BKPyV-NCCR הגברה אשר בפרוטוקול זה שהתקבלו בעבר מן ה-DNA הנגזר דם של חולי חיסוני מושתלים כליות, ההשפעה של NCCR-סידור מחדש על ביטוי גנים ויראלי ניתן לקבוע. בעקבות השיבוט של המטופל הופק הגברה, תאים HEK293T היו מזוהמים העיתונאי-פלמידים, וטיפל עם סוכני אנטי ויראליות פוטנציאליים. לאחר מכן, התאים היו חשופים FACS-ניתוח עבור מדידת ממוצע עוצמות זריחה 72 h לאחר התיקון. כדי לבדוק גם את הניתוח של תרופות כי יש מחזור התא פוטנציאלי השפעה מעכבת, רק מנוכר ובכך תאי פלורסנט משמשים. מאחר שהבדיקה מבוצעת בתאי T אנטיגן ביטוי גדול, ההשפעה של ביטוי מוקדם ומאוחר ניתן לנתח בצורה עצמאית הדדית.
Introduction
וירוסים פולידונים מייצגים משפחה עצמאית של קטן כפול תקועים DNA (dsDNA) וירוסים עם וירוס Simian 40 (SV40) כמו מינים אב טיפוס. הזיהום העיקרי מתרחשת בעיקר במהלך הילדות, אשר בדרך כלל להמשיך ללא תסמיני המחלה ובדרך כלל לגרום לזיהומים סמויים מארחים המוסמכים החיסונית. וירוס BK-פולידונים (BKPyV) ממשיך בעיקר בתאי tubules כליות מבלי לגרום לנפרולוגיה, עם זאת, במקרה של פגיעה ביכולת החיסון לאחר השתלת כליות הווירוס יכול להפעיל מחדש ולגרום נזקים חמורים השתל לקוי פונקציה בעת הגעה viremia גבוה (1 x 104 bkpyv העתקים DNA/mL)1,2. בתוך כ 10% של מקבלי השתלת כליה, ההפעלה מקדימה של וירוס BK-polyדונים (bkpyv) תוצאות וירוס מקושר הקשורים לנפרופתיה (pyvan), אשר היה עד 80% הקשורים בסיכון גבוה של כשלים השתלת כליות3,4 . מכיוון שלא קיימים סוכני אנטי-ויראליים מאושרים, הטיפול הנוכחי מבוסס על צמצום הדיכוי החיסוני. מעניין, מעכבי mTOR נראה שיש לו אפקט אנטי ויראלי; לפיכך, העברת הטיפול המדכא לדיכוי חיסוני מבוסס mtor עשוי לייצג גישה חלופית כדי למנוע התקדמות של virepyv ויסמיה5,6,7. עם זאת, מנגנון האנטי-ויראלי המבוסס על mTOR עדיין מובן לחלוטין. לפיכך, נדרשות שיטות למדידת ההשפעה של גורמי אנטי-ויראליים פוטנציאליים בריכוזים רלוונטיים של קליניות.
הגנום המעגלי של BKPyV מורכב כ 5 kb מחסה אזור שליטה ללא קידוד (NCCR) המשמש כמקור של השכפול ובמקביל יזם דו-כיווני המניע את הביטוי של מוקדם ומאוחר התעתיקים mRNA. מאז התרחשות באופן ספונטני nccr-rearrangements, מחיקות, וכפילויות מצויים ב-bkpyv הפתוגני8 והצטבר משמעותית בחולים הסובלים pvan5,9, השוואה של הארכיאופייני (wt) ו מסודרים מחדש (rr) NCCR-פעילויות מועילים לאפיין כושר replicative ויראלי.
כפי שסוכם באיור 1, פרוטוקול זה מתאר שיטה בשימוש נפוץ כדי למדוד את הפעילות הנפוצה של BKPyV nccr על ידי כימות הזריחה של שני fluorophores tdTomato ו-egfp ביטא מתוך הכתב פלבאמצע5, 9,10,11. ההליך מבוצע בנוכחות של האנטיגן T SV40 גדול (lTAg), אשר מאפשר לנתח את ההשפעה של סוכני אנטי ויראליים פוטנציאליים על מוקדם ומאוחר NCCR-פעילות בנפרד5. שיטת הפעולה עוד מנתחת את ההשפעה של הסדרים מחדש על פעילות nccr והשוואה עם wt-NCCRs5,9. הכתב פלסמאמצע הנמלים את האות SV40 מאוחר במורד במורד של כל fluorophore לפתוח מסגרת קריאה כדי להבטיח עיבוד דומה ויעיל של שני התעתיקים של tdTomato ו-eGFP, בהתאמה. בהשוואה לשיטות המבוססות על רביעיית ה-PCR,5,12, גישה זו מבוססת-facs מייצגת עלות נמוכה וחלופה גבוהה לתפוקה בקצב גבוה, מאחר שאין פרוטוקולי הוצאה מסובכים לתרבות התא הנגועה וללא יקר יש צורך בנוגדנים לצביעת מערכת הקרינה החיסונית. יתר על כן, מאז כמות מוגדרת של תאי פלורסנט מנותח באמצעות cy, הניתוח של מחזור התאים הסוכנים מעכבים ניתן גם באופן כמותי.
Protocol
Representative Results
Discussion
במאמר זה, שיטה בשימוש נפוץ מוצגת המאפשרת ניתוח של BKPyV לא קידוד בקרת אזור (NCCR) מונחה מוקדם ומאוחר הפעילות המקדם. ניתן למדוד את פעילות NCCR בו ואינה זקוקה לפירוק של התאים הניתנים להעברה. יתרה מזאת, ניתן לנתח מספר גדול יחסית של תאים ושיתוף ההעברה של סמנים נוספים לנורמליזציה של ערכי הקרינה הפלואור…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לברברה בלקמן על סיוע טכני מעולה. מחקרים אלה תמכו על ידי IFORES-תוכנית של אוניברסיטת Duisburg-אסן הספר לרפואה ואת RIMUR-תוכנית של הברית האוניברסיטה הרוהר ומרקטור מרכז מחקר רוהר (MERCUR). המחברים מודים לג-מנצ-סטיפטונג עבור מלגת הדוקטורט של הלן סרצניג ותמיכה מתמדת. האיסוף והשימוש בחומר המטופל אושר על ידי ועדת האתיקה של הפקולטה לרפואה של האוניברסיטה Duisburg-אסן (14-6028-BO).
Materials
| 100 bp ladder | NEB | N3231 | Any ladder with a range up to 1 kb can be substituted |
| 2-log ladder | NEB | N0550 | Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted |
| Agar-Agar, Kobe I | Carl Roth | 5210.3 | |
| AgeI-HF | NEB | R3552 | |
| Ampicillin Natriumsalz Cellpure | Carl Roth | HP62.1 | |
| Aqua ad iniectabilia | Bbraun | 2351744 | can be substituted by any manufacturer |
| BD FACSCanto™ II | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva | BD Biosciences | ||
| DAPI | Sigma | 10236276001 | |
| DFC450C camera module | Leica | Any camera can be used | |
| DMEM | Gibco | 41966-029 | can be substituted by any manufacturer |
| DMIL LED microscope | Leica | Any fluorescence microscope can be used | |
| DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51104 | can be substituted by any manufacturer |
| E.coli DH5alpha Competent Cells | Thermo Scientific | 18258012 | |
| FBS Superior | MerckMillipore | 50615 | Any FBS can be used |
| FlowJo v10.5.3 | FlowJo, LLC | Any flow cytometry software FBS can be used | |
| Gel Loading Dye, Purple (6X) | NEB | B7024 | Any 6x loading dye can be substituted |
| HEK293T cells | ATCC | 11268 | These cells constitutively express the simian virus 40 (SV40) large T antigen, and clone 17 was selected specifically for its high transfectability. |
| HERAcell® 240i CO2 Incubator | Thermo Scientific | can be substituted by any manufacturer | |
| HotStar PCR kit | Qiagen | 203203 | |
| Intas Gel documentation system | Intas | Any visualisation system for stained DNA containing agarose gels can be used | |
| Low Melt Agarose | Biozym | 850081 | can be substituted by any manufacturer |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985070 | can be substituted by any manufacturer |
| pBKV (34-2) | ATCC | 45025 | Plasmid harboring the full-length genome of BKPyV strain Dunlop; was used as a positive control; DNA Seq. Acc.: KP412983 |
| PBS | Gibco | 14190-136 | |
| PCR Cycler MJ Mini 48-Well Personal Cycler | Bio-Rad | discontinued product | Any thermocycler can be used |
| PCR Nucleotide Mix, 10 mM | Promega | #C1145 | can be substituted by any manufacturer |
| PCR1 and PCR2 Primers | metabion | not applicable | Desalted. Dilute to (10 µM) with PCR grade water |
| PenStrep (100x) | Gibco | 15140-122 | can be substituted by any manufacturer |
| Roti®-GelStain | Carl Roth | 3865 | A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration |
| SpeI-HF | NEB | R3133 | |
| T4-DNA Ligase | NEB | M0202 | |
| TransIT LT1 | Mirus | MIR2300 | |
| Trypsin 0.05% – EDTA | Gibco | 25300-054 | can be substituted by any manufacturer |
| ZymoPURE II Plasmid Kit | Zymo | D4201 | can be substituted by any manufacturer |
References
- Drachenberg, C. B., et al. Histological patterns of polyomavirus nephropathy: correlation with graft outcome and viral load. American Journal of Transplant. 4 (12), 2082-2092 (2004).
- Korth, J., et al. Impact of low-level BK polyomavirus viremia on intermediate-term renal allograft function. Transplant Infectious Disease. 20 (1), (2018).
- Hirsch, H. H., et al. European perspective on human polyomavirus infection, replication and disease in solid organ transplantation. Clinical Microbiology and Infection. 20 Suppl 7, 74-88 (2014).
- Masutani, K., et al. The Banff 2009 Working Proposal for polyomavirus nephropathy: a critical evaluation of its utility as a determinant of clinical outcome. American Journal of Transplantation. 12 (4), 907-918 (2012).
- Korth, J., et al. Impact of immune suppressive agents on the BK-Polyomavirus non coding control region. Antiviral Research. 159, 68-76 (2018).
- Hirsch, H. H., Yakhontova, K., Lu, M., Manzetti, J. BK Polyomavirus Replication in Renal Tubular Epithelial Cells Is Inhibited by Sirolimus, but Activated by Tacrolimus Through a Pathway Involving FKBP-12. Amerian Journal of Transplantation. 16 (3), 821-832 (2016).
- Sanchez Fructuoso, A. I., et al. Mammalian target of rapamycin signal inhibitors could play a role in the treatment of BK polyomavirus nephritis in renal allograft recipients. Transplant Infectious Disease. 13 (6), 584-591 (2011).
- Moens, U., Johansen, T., Johnsen, J. I., Seternes, O. M., Traavik, T. Noncoding control region of naturally occurring BK virus variants: sequence comparison and functional analysis. Virus Genes. 10 (3), 261-275 (1995).
- Gosert, R., et al. Polyomavirus BK with rearranged noncoding control region emerge in vivo in renal transplant patients and increase viral replication and cytopathology. Journal of Experimental Medicine. 205 (4), 841-852 (2008).
- Bethge, T., et al. Sp1 sites in the noncoding control region of BK polyomavirus are key regulators of bidirectional viral early and late gene expression. Journal of Virology. 89 (6), 3396-3411 (2015).
- Gosert, R., Kardas, P., Major, E. O., Hirsch, H. H. Rearranged JC virus noncoding control regions found in progressive multifocal leukoencephalopathy patient samples increase virus early gene expression and replication rate. Journal of Virology. 84 (20), 10448-10456 (2010).
- Bernhoff, E., Gutteberg, T. J., Sandvik, K., Hirsch, H. H., Rinaldo, C. H. Cidofovir inhibits polyomavirus BK replication in human renal tubular cells downstream of viral early gene expression. American Journal of Transplantation. 8 (7), 1413-1422 (2008).
- Widera, M., et al. HIV-1 persistent viremia is frequently followed by episodes of low-level viremia. Medical Microbiology Immunology. , (2017).
- Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. Journal of Visualized Experiment. (6), 247 (2007).
- Drew, R. J., Walsh, A., Laoi, B. N., Crowley, B. Phylogenetic analysis of the complete genome of 11 BKV isolates obtained from allogenic stem cell transplant recipients in Ireland. Journal of Medical Virology. 84 (7), 1037-1048 (2012).
- Dorries, K., Vogel, E., Gunther, S., Czub, S. Infection of human polyomaviruses JC and BK in peripheral blood leukocytes from immunocompetent individuals. Virology. 198 (1), 59-70 (1994).
- Teutsch, K., et al. Early identification of renal transplant recipients with high risk of polyomavirus-associated nephropathy. Medical Microbiology Immunology. 204 (6), 657-664 (2015).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiment. (41), (2010).
- Korth, J., et al. The detection of BKPyV genotypes II and IV after renal transplantation as a simple tool for risk assessment for PyVAN and transplant outcome already at early stages of BKPyV reactivation. Journal of Clinical Virology. 113, 14-19 (2019).
- Caputo, A., Barbanti-Brodano, G., Wang, E., Ricciardi, R. P. Transactivation of BKV and SV40 early promoters by BKV and SV40 T-antigens. Virology. 152 (2), 459-465 (1986).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
