Misurazione di BK-poliomavirus Non-Coding Control Region Guidato Attività Trascrizionional Via Flusso Cytometry

Summary

In questo manoscritto, viene presentato un protocollo per eseguire la misurazione basata su FACS dell’attività trascrizionale BK-poliomavirus utilizzando cellule HEK293T trascate da un plasmide reporter bidirezionale che esprime tdTomato ed eGFP. Questo metodo permette inoltre di determinare quantitativamente l’influenza di nuovi composti sulla trascrizione virale.

Abstract

I poliomavirus, come il BK-poliomavirus (BKPyV), possono causare gravi patologie nei pazienti immunocompromessi. Tuttavia, poiché attualmente non sono disponibili antivirali altamente efficaci, sono necessari metodi che misurano l’impatto di potenziali agenti antivirali. Qui, è stato costruito un reporter a doppia fluorescenza che consente l’analisi dell’attività di promotrice bKPyV basata sulla regione di controllo non codificante (NCCR) in anticipo e in ritardo per quantificare l’impatto di potenziali farmaci antivirali sull’espressione genica virale tramite tdTomato ed eGFP espressione. Inoltre, clonando gli amplificatori BKPyV-NCCR che in questo protocollo sono stati esemplificati dal DNA derivato dal sangue dei pazienti trapiantati renali immunocompromessi, è possibile determinare l’impatto dei riarrangiamenti NCCR sull’espressione genica virale. Dopo la clonazione del paziente derivato amplicons, le cellule HEK293T sono state trascate con il reporter-plasmidi e trattate con potenziali agenti antivirali. Successivamente, le cellule sono state sottoposte all’analisi FACS per misurare le intensità medie di fluorescenza 72 h dopo la trasfezione. Per testare anche l’analisi dei farmaci che hanno un potenziale effetto di inibizione del ciclo cellulare, vengono utilizzate solo cellule trasfette e quindi fluorescenti. Poiché questo saggio viene eseguito in grandi cellule che esprimono l’antigene T, l’impatto dell’espressione precoce e tardiva può essere analizzato in modo reciprocamente indipendente.

Introduction

I poliomavirus rappresentano una famiglia indipendente di piccoli virus di DNA a doppio filamento (dsDNA) con il virus Simian 40 (SV40) come specie prototipo. L’infezione primaria si verifica principalmente durante l’infanzia, che di solito procede senza sintomi di malattia e di solito causano infezioni latenti in ospiti immunitari competenti. Il BK-poliomavirus (BKPyV) persiste principalmente nelle cellule dei tubuli renali senza causare nefropatologie, tuttavia, in caso di compromissione della competenza immunitaria dopo il trapianto renale il virus può riattivarsi e causare gravi danni e alterati innesti quando si raggiunge una viremia alta (1 x 10⁴ BKPyV copie di DNA/mL)^1,2. In circa il 10% dei destinatari del trapianto di rene, la riattivazione del bK-poliomavirus (BKPyV) si traduce in un poliomavirus associato a nefropatia (PyVAN), che è stato fino all’80% associato ad un alto rischio di fallimenti di allotrapianto renale^3,4 . Poiché non sono disponibili agenti antivirali approvati, la terapia attuale si basa sulla riduzione dell’immunosoppressione. È interessante notare che gli inibitori di mTOR sembrano avere un effetto antivirale; pertanto, il passaggio della terapia immunosoppressiva all’immunosoppressione a base di mTOR potrebbe rappresentare un approccio alternativo per prevenire la progressione della viremia BKPyV^5,6,7. Tuttavia, il meccanismo antivirale basato su mTOR è attualmente ancora incompleto. Pertanto, sono necessari metodi che misurano l’impatto di potenziali agenti antivirali in concentrazioni clinicamente rilevanti.

Il genoma circolare del BKPyV è costituito da circa 5 kb che ospitano una regione di controllo non codificante (NCCR) che funge da origine della replicazione e concomitante un promotore bidirezionale che guida l’espressione di trascrizioni di mRNA di fase precoce e tardiva. Poiché si verificano spontaneamente riarrangiamenti, delezioni e duplicazioni di NCCR si trovano in BKPyV⁸ patogeni e significativamente accumulati in pazienti affetti da PVAN^5,9, un confronto di archetipico (wt) e ri-organizzato (rr) NCCR-attività sono utili per caratterizzare la forma replicativa virale.

Come riassunto nella Figura 1, questo protocollo descrive un metodo comunemente usato per misurare l’attività trascrizionale BKPyV NCCR quantificando la fluorescenza di due fluorofori tdTomato ed eGFP espressi da un plotone reporter^{5, 9,10,11}. La procedura viene eseguita in presenza del grande antigene T SV40 (lTAg), che permette di analizzare separatamente l’impatto di potenziali agenti antivirali sulla attività NCCR precoce e tardiva 5 . Questo analisi analizza ulteriormente l’impatto dei riarrangiamenti sull’attività della NCCR e il confronto con wt-NCCR^5,9. Il plotone reporter ospita il segnale di poliadenilazione tardiva SV40 a valle di ogni telaio di lettura aperto del fluoroforo per garantire un’elaborazione comparabile ed efficiente di entrambe le trascrizioni per tdTomato ed eGFP, rispettivamente. Rispetto ai metodi basati su qRT-PCR^5,12, questo approccio basato su FACS rappresenta un’alternativa compatibile a basso costo e ad alta velocità effettiva poiché nessun protocollo di estrazione complicato per la coltura cellulare infetta e non costoso anticorpi per la colorazione della fluorescenza immunitaria. Inoltre, poiché una quantità definita di cellule fluorescenti viene analizzata tramite la citometria di flusso, l’analisi degli agenti inibitori del ciclo cellulare è possibile anche in modo quantitativo.

Protocol

Questo protocollo segue le linee guida della ricerca umana, come approvato dal comitato etico della facoltà di medicina dell’Università di Duisburg-Essen (14-6028-BO). 1. Raccolta di campioni di sangue o urina e isolamento del DNA poliomavirus Raccogliere almeno 3 mL di sangue in tubi EDTA o urina in tubi di acquisizione. Centrifugare il campione a 2.500 x g per 15 min. Se necessario, pipetta plasma in un nuovo tubo e conservare i campioni di plasma a 4 gradi cen…

Representative Results

In questo esperimento rappresentativo, l’attività trascrizionale guidata dalla regione di controllo non codificabil Inoltre, un inibitore mTOR, che potrebbe essere usato per trattare i pazienti dopo la riattivazione di BKPyV, è stato testato per la sua inibizione dell’espressione genica precoce virale. A tal fine, un saggio a doppia fluorescenza-reporter è stato utilizzato come pubblicato in precedenza5. Lo schema di flusso di lavoro complessivo dell’installazio…

Discussion

In questo articolo viene presentato un metodo comunemente usato che consente l’analisi dell’attività BKPyV di controllo non codificante (NCCR) guidata in anticipo e in ritardo. L’attività NCCR può essere misurata simultaneamente e non necessita di lisi delle cellule trafette. Inoltre, è possibile analizzare un numero relativamente elevato di cellule e non è necessaria la co-trasfezione di marcatori aggiuntivi per la normalizzazione dei valori di fluorescenza.

Una parte fondamentale di que…

Materials

100 bp ladder	NEB	N3231	Any ladder with a range up to 1 kb can be substituted
2-log ladder	NEB	N0550	Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted
Agar-Agar, Kobe I	Carl Roth	5210.3
AgeI-HF	NEB	R3552
Ampicillin Natriumsalz Cellpure	Carl Roth	HP62.1
Aqua ad iniectabilia	Bbraun	2351744	can be substituted by any manufacturer
BD FACSCanto™ II	BD Biosciences
BD FACSDiva	BD Biosciences
DAPI	Sigma	10236276001
DFC450C camera module	Leica		Any camera can be used
DMEM	Gibco	41966-029	can be substituted by any manufacturer
DMIL LED microscope	Leica		Any fluorescence microscope can be used
DNA Blood Mini Kit	Qiagen	51104	can be substituted by any manufacturer
E.coli DH5alpha Competent Cells	Thermo Scientific	18258012
FBS Superior	MerckMillipore	50615	Any FBS can be used
FlowJo v10.5.3	FlowJo, LLC		Any flow cytometry software FBS can be used
Gel Loading Dye, Purple (6X)	NEB	B7024	Any 6x loading dye can be substituted
HEK293T cells	ATCC	11268	These cells constitutively express the simian virus 40 (SV40) large T antigen, and clone 17 was selected specifically for its high transfectability.
HERAcell® 240i CO2 Incubator	Thermo Scientific		can be substituted by any manufacturer
HotStar PCR kit	Qiagen	203203
Intas Gel documentation system	Intas		Any visualisation system for stained DNA containing agarose gels can be used
Low Melt Agarose	Biozym	850081	can be substituted by any manufacturer
Opti-MEM	Invitrogen	31985070	can be substituted by any manufacturer
pBKV (34-2)	ATCC	45025	Plasmid harboring the full-length genome of BKPyV strain Dunlop; was used as a positive control; DNA Seq. Acc.: KP412983
PBS	Gibco	14190-136
PCR Cycler MJ Mini 48-Well Personal Cycler	Bio-Rad	discontinued product	Any thermocycler can be used
PCR Nucleotide Mix, 10 mM	Promega	#C1145	can be substituted by any manufacturer
PCR1 and PCR2 Primers	metabion	not applicable	Desalted. Dilute to (10 µM) with PCR grade water
PenStrep (100x)	Gibco	15140-122	can be substituted by any manufacturer
Roti®-GelStain	Carl Roth	3865	A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration
SpeI-HF	NEB	R3133
T4-DNA Ligase	NEB	M0202
TransIT LT1	Mirus	MIR2300
Trypsin 0.05% – EDTA	Gibco	25300-054	can be substituted by any manufacturer
ZymoPURE II Plasmid Kit	Zymo	D4201	can be substituted by any manufacturer