Meting van BK-polyomavirus niet-coderende controle regio gedreven transcriptionele activiteit via Flowcytometrie
Summary
In dit manuscript wordt een protocol gepresenteerd voor het uitvoeren van FACS-based meting van de transcriptionele activiteit van BK-polyomavirus door gebruik te maken van HEK293T cellen met een bidirectionele reporter plasmide die tdTomato en eGFP uitdrukt. Deze methode maakt het mogelijk om de invloed van nieuwe verbindingen op virale transcriptie kwantitatief te bepalen.
Abstract
Polyomavirussen, zoals het BK-polyomavirus (BKPyV), kunnen ernstige pathologieën veroorzaken bij immuungecompromitteerde patiënten. Echter, aangezien zeer effectieve antivirale middelen momenteel niet beschikbaar zijn, zijn methoden voor het meten van de impact van potentiële antivirale agenten vereist. Hier werd een dubbele fluorescentie reporter die de analyse van de BKPyV non-coding Control-Region (NCCR) gedreven vroege en late promotor activiteit mogelijk gemaakt om de impact van potentiële antivirale geneesmiddelen op virale genexpressie via tdTomato en eGFP te kwantificeren. Expressie. Bovendien kan door het klonen van BKPyV-NCCR-amplicons die in dit protocol voorbeeld zijn verkregen uit het bloed afgeleide DNA van immuungecompromitteerde niertransplantatiepatiënten, de impact van NCCR-rearrangementen op virale genexpressie worden bepaald. Na het klonen van de patiënt afgeleide amplicons, HEK293T cellen werden met de reporter-plasmiden, en behandeld met potentiële antivirale middelen. Vervolgens werden de cellen onderworpen aan FACS-analyse voor het meten van de gemiddelde fluorescentie intensiteiten 72 h post transfectie. Om ook de analyse van geneesmiddelen die een potentiële celcyclus remming van effect te testen, alleen getransffecteerd en dus fluorescerende cellen worden gebruikt. Aangezien deze test wordt uitgevoerd in een groot T-antigeen dat cellen uitdrukt, kan de impact van vroegtijdige en late expressie op een wederzijds onafhankelijke manier worden geanalyseerd.
Introduction
Polyomavirussen vertegenwoordigen een onafhankelijke familie van kleine dubbel-gestrande DNA (dsDNA) virussen met het Simian virus 40 (SV40) als prototype soort. De primaire infectie treedt voornamelijk op tijdens de kindertijd, die meestal doorgaat zonder ziektesymptomen en meestal latente infecties veroorzaken in immuun competente hosts. Het BK-polyomavirus (BKPyV) blijft voornamelijk bestaan in nierbuisjes cellen zonder nefropathologieën, echter, in geval van aantasting van de immuun-competentie na niertransplantatie het virus kan reactiveren en veroorzaken ernstige schade en verminderde transplantaat functie bij het bereiken van een hoge hersenen (1 x 104 bkpyv DNA-kopieën/ml)1,2. Bij ongeveer 10% van de niertransplantatie ontvangers resulteert reactivering van het BK-polyomavirussen (bkpyv) in een met polyomavirussen geassocieerde nefropathie (pyvan), die tot 80% geassocieerd met een hoog risico op renale allotransplantaat storingen3,4 . Aangezien er geen goedgekeurde antivirale middelen beschikbaar zijn, is de huidige therapie gebaseerd op de reductie van immunosuppressie. Interessant, mTOR-remmers lijken te hebben een antivirale effect; Zo kan het overschakelen van de immunosuppressieve therapie op mtor-gebaseerde immunosuppressie een alternatieve benadering zijn om progressie van de bkpyv hersenen5,6,7te voorkomen. Echter, het mTOR gebaseerde antivirale mechanisme is momenteel nog niet volledig begrepen. Daarom zijn methoden vereist voor het meten van de impact van potentiële antivirale middelen in klinisch relevante concentraties.
Het circulaire genoom van de BKPyV bestaat uit ongeveer 5 KB die een niet-coderende controle regio (NCCR) verveelt die dient als een bron van replicatie en tegelijkertijd een bidirectionele promotor die de uitdrukking van vroege en late fase mRNA transcripten besturen. Aangezien spontaan voorkomende nccr-herschikkingen, verwijderingen en duplicaties worden aangetroffen in pathogene bkpyv8 en aanzienlijk worden opgehoopt bij patiënten die lijden aan pvan5,9, een vergelijking van archetypische (WT) en Re-gerangschikte (RR) NCCR-activiteiten zijn nuttig om virale replicatieve fitness te karakteriseren.
Zoals samengevat in Figuur 1, beschrijft dit protocol een veelgebruikte methode om de BKPyV nccr-transcriptionele activiteit te meten door de fluorescentie van twee fluoroforen tdTomato en EGFP te kwantificeren, uitgedrukt door een reporter plasmide5, 9,10,11. De procedure wordt uitgevoerd in de aanwezigheid van het SV40 grote T-antigeen (lTAg), die het mogelijk maakt om de impact van potentiële antivirale middelen op de vroege en late NCCR-activiteit afzonderlijk te analyseren5. Deze assay analyseert verder de impact van herschikkingen op de nccr-activiteit en vergelijking met WT-nccrs5,9. De reporter plasmide herbergt het SV40 late polyadenylatie signaal stroomafwaarts van elk de open reading frame om te zorgen voor een vergelijkbare en efficiënte verwerking van beide transcripten voor respectievelijk tdtomato en EGFP. Vergeleken met QRT-PCR-gebaseerde methoden5,12, vertegenwoordigt deze op FACS gebaseerde aanpak een laaggeprijsde en hoge doorvoer compatibel alternatief omdat geen ingewikkelde extractie protocollen voor geïnfecteerde celcultuur en geen dure Er zijn antilichamen voor immuun fluorescentie kleuring nodig. Bovendien, aangezien een bepaalde hoeveelheid fluorescerende cellen wordt geanalyseerd via Flowcytometrie, is de analyse van celcyclus remmende middelen ook mogelijk op een kwantitatieve manier.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit artikel wordt een veelgebruikte methode gepresenteerd die de analyse van de BKPyV non-coding Control-Region (NCCR) gedreven vroege en late Promoter activiteit mogelijk maakt. De NCCR-activiteit kan gelijktijdig worden gemeten en heeft geen lysis nodig van de getransfunteerde cellen. Bovendien kan een relatief groot aantal cellen worden geanalyseerd en is de co-transfectie van extra markers voor normalisatie van de fluorescentie waarden niet nodig.
Een essentieel onderdeel van deze metho…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken Barbara Bleekmann voor de uitstekende technische assistentie. Deze studies werden ondersteund door het IFORES-programma van de Universiteit van Duisburg-Essen Medical School en het RIMUR-programma van de University Alliance Ruhr en Mercator Research Center Ruhr (MERCUR). De auteurs danken de Jürgen-manchot-Stiftung voor het doctoraats Genootschap van Helene Sertznig en voortdurende steun. Het verzamelen en gebruiken van patiëntenmateriaal is goedgekeurd door de ethische commissie van de medische faculteit van de Universiteit Duisburg-Essen (14-6028-BO).
Materials
| 100 bp ladder | NEB | N3231 | Any ladder with a range up to 1 kb can be substituted |
| 2-log ladder | NEB | N0550 | Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted |
| Agar-Agar, Kobe I | Carl Roth | 5210.3 | |
| AgeI-HF | NEB | R3552 | |
| Ampicillin Natriumsalz Cellpure | Carl Roth | HP62.1 | |
| Aqua ad iniectabilia | Bbraun | 2351744 | can be substituted by any manufacturer |
| BD FACSCanto™ II | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva | BD Biosciences | ||
| DAPI | Sigma | 10236276001 | |
| DFC450C camera module | Leica | Any camera can be used | |
| DMEM | Gibco | 41966-029 | can be substituted by any manufacturer |
| DMIL LED microscope | Leica | Any fluorescence microscope can be used | |
| DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51104 | can be substituted by any manufacturer |
| E.coli DH5alpha Competent Cells | Thermo Scientific | 18258012 | |
| FBS Superior | MerckMillipore | 50615 | Any FBS can be used |
| FlowJo v10.5.3 | FlowJo, LLC | Any flow cytometry software FBS can be used | |
| Gel Loading Dye, Purple (6X) | NEB | B7024 | Any 6x loading dye can be substituted |
| HEK293T cells | ATCC | 11268 | These cells constitutively express the simian virus 40 (SV40) large T antigen, and clone 17 was selected specifically for its high transfectability. |
| HERAcell® 240i CO2 Incubator | Thermo Scientific | can be substituted by any manufacturer | |
| HotStar PCR kit | Qiagen | 203203 | |
| Intas Gel documentation system | Intas | Any visualisation system for stained DNA containing agarose gels can be used | |
| Low Melt Agarose | Biozym | 850081 | can be substituted by any manufacturer |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985070 | can be substituted by any manufacturer |
| pBKV (34-2) | ATCC | 45025 | Plasmid harboring the full-length genome of BKPyV strain Dunlop; was used as a positive control; DNA Seq. Acc.: KP412983 |
| PBS | Gibco | 14190-136 | |
| PCR Cycler MJ Mini 48-Well Personal Cycler | Bio-Rad | discontinued product | Any thermocycler can be used |
| PCR Nucleotide Mix, 10 mM | Promega | #C1145 | can be substituted by any manufacturer |
| PCR1 and PCR2 Primers | metabion | not applicable | Desalted. Dilute to (10 µM) with PCR grade water |
| PenStrep (100x) | Gibco | 15140-122 | can be substituted by any manufacturer |
| Roti®-GelStain | Carl Roth | 3865 | A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration |
| SpeI-HF | NEB | R3133 | |
| T4-DNA Ligase | NEB | M0202 | |
| TransIT LT1 | Mirus | MIR2300 | |
| Trypsin 0.05% – EDTA | Gibco | 25300-054 | can be substituted by any manufacturer |
| ZymoPURE II Plasmid Kit | Zymo | D4201 | can be substituted by any manufacturer |
References
- Drachenberg, C. B., et al. Histological patterns of polyomavirus nephropathy: correlation with graft outcome and viral load. American Journal of Transplant. 4 (12), 2082-2092 (2004).
- Korth, J., et al. Impact of low-level BK polyomavirus viremia on intermediate-term renal allograft function. Transplant Infectious Disease. 20 (1), (2018).
- Hirsch, H. H., et al. European perspective on human polyomavirus infection, replication and disease in solid organ transplantation. Clinical Microbiology and Infection. 20 Suppl 7, 74-88 (2014).
- Masutani, K., et al. The Banff 2009 Working Proposal for polyomavirus nephropathy: a critical evaluation of its utility as a determinant of clinical outcome. American Journal of Transplantation. 12 (4), 907-918 (2012).
- Korth, J., et al. Impact of immune suppressive agents on the BK-Polyomavirus non coding control region. Antiviral Research. 159, 68-76 (2018).
- Hirsch, H. H., Yakhontova, K., Lu, M., Manzetti, J. BK Polyomavirus Replication in Renal Tubular Epithelial Cells Is Inhibited by Sirolimus, but Activated by Tacrolimus Through a Pathway Involving FKBP-12. Amerian Journal of Transplantation. 16 (3), 821-832 (2016).
- Sanchez Fructuoso, A. I., et al. Mammalian target of rapamycin signal inhibitors could play a role in the treatment of BK polyomavirus nephritis in renal allograft recipients. Transplant Infectious Disease. 13 (6), 584-591 (2011).
- Moens, U., Johansen, T., Johnsen, J. I., Seternes, O. M., Traavik, T. Noncoding control region of naturally occurring BK virus variants: sequence comparison and functional analysis. Virus Genes. 10 (3), 261-275 (1995).
- Gosert, R., et al. Polyomavirus BK with rearranged noncoding control region emerge in vivo in renal transplant patients and increase viral replication and cytopathology. Journal of Experimental Medicine. 205 (4), 841-852 (2008).
- Bethge, T., et al. Sp1 sites in the noncoding control region of BK polyomavirus are key regulators of bidirectional viral early and late gene expression. Journal of Virology. 89 (6), 3396-3411 (2015).
- Gosert, R., Kardas, P., Major, E. O., Hirsch, H. H. Rearranged JC virus noncoding control regions found in progressive multifocal leukoencephalopathy patient samples increase virus early gene expression and replication rate. Journal of Virology. 84 (20), 10448-10456 (2010).
- Bernhoff, E., Gutteberg, T. J., Sandvik, K., Hirsch, H. H., Rinaldo, C. H. Cidofovir inhibits polyomavirus BK replication in human renal tubular cells downstream of viral early gene expression. American Journal of Transplantation. 8 (7), 1413-1422 (2008).
- Widera, M., et al. HIV-1 persistent viremia is frequently followed by episodes of low-level viremia. Medical Microbiology Immunology. , (2017).
- Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. Journal of Visualized Experiment. (6), 247 (2007).
- Drew, R. J., Walsh, A., Laoi, B. N., Crowley, B. Phylogenetic analysis of the complete genome of 11 BKV isolates obtained from allogenic stem cell transplant recipients in Ireland. Journal of Medical Virology. 84 (7), 1037-1048 (2012).
- Dorries, K., Vogel, E., Gunther, S., Czub, S. Infection of human polyomaviruses JC and BK in peripheral blood leukocytes from immunocompetent individuals. Virology. 198 (1), 59-70 (1994).
- Teutsch, K., et al. Early identification of renal transplant recipients with high risk of polyomavirus-associated nephropathy. Medical Microbiology Immunology. 204 (6), 657-664 (2015).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiment. (41), (2010).
- Korth, J., et al. The detection of BKPyV genotypes II and IV after renal transplantation as a simple tool for risk assessment for PyVAN and transplant outcome already at early stages of BKPyV reactivation. Journal of Clinical Virology. 113, 14-19 (2019).
- Caputo, A., Barbanti-Brodano, G., Wang, E., Ricciardi, R. P. Transactivation of BKV and SV40 early promoters by BKV and SV40 T-antigens. Virology. 152 (2), 459-465 (1986).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
