اختبار تكعيبي لتحديد التفاعلات التنافسية بين عزل فيبريو فيشري
Summary
البكتيريا ترميز آليات متنوعة للانخراط في المنافسة بين البكتيريا. هنا، نقدم بروتوكولاً قائماً على الثقافة لتوصيف التفاعلات التنافسية بين العزلات البكتيرية وكيفية تأثيرها على البنية المكانية للسكان المختلطين.
Abstract
تصف هذه المخطوطة اختبارًا قائمًا على الثقافة وتكعيباً للكشف عن التفاعلات التنافسية بين اثنين من التجمعات البكتيرية ووصفها. وتستخدم هذه الطريقة بلازميدات مستقرة تسمح لكل مجموعة من السكان بأن تكون الموسومة بشكل مختلف بقدرات مقاومة المضادات الحيوية المتميزة والبروتينات الفلورية للاختيار والتمييز البصري لكل شعب، على التوالي. هنا، نقوم بوصف إعداد وتكتكع سلالات Vibrio fischeri المتنافسة، والتصوير المجهري الفلوري، وتحليل البيانات الكمية. وهذا النهج بسيط، ويسفر عن نتائج سريعة، ويمكن استخدامه لتحديد ما إذا كان أحد السكان يقتل أو يعوق نمو سكان آخرين، وما إذا كانت المنافسة تتوسط من خلال جزيء غير قابل للاستخدام أو تتطلب الاتصال المباشر بالخلايا الخلوية. ولأن كل مجموعة بكتيرية تعبر عن بروتين فلورسنت مختلف، فإن هذا التحليل يسمح بالتمييز المكاني للسكان المتنافسين داخل مستعمرة مختلطة. على الرغم من أن يتم تنفيذ الأساليب الموصوفة مع البكتيريا التكافلية V. fischeri باستخدام الظروف الأمثل لهذا النوع، يمكن تكييف البروتوكول لمعظم العزلات البكتيرية القابلة للزراعة.
Introduction
تحدد هذه المخطوطة طريقة قائمة على الثقافة لتحديد ما إذا كان عزلتان بكتيريتان قادرتين على التفاعل التنافسي. عند دراسة السكان المختلطين، من المهم تقييم مدى تفاعل العزلات البكتيرية، لا سيما ما إذا كانت المعزولات تتنافس مباشرة من خلال آليات التداخل. تشير المنافسة على التداخل إلى التفاعلات التي يمنع فيها أحد السكان بشكل مباشر النمو أو يقتل السكان المنافسين1. هذه التفاعلات مهمة لتحديد لأنها يمكن أن يكون لها آثار عميقةعلى بنية المجتمع الميكروبي ووظيفته 2،3.
وقد تم اكتشاف آليات للمنافسة الميكروبية على نطاق واسع في جينومات البكتيريا من بيئات متنوعة بما في ذلك كل من البكتيريا المرتبطة بالمضيف والبكتيريا الحية الحرة4،5،6،7، 8،9. وقد تم وصف مجموعة متنوعة من استراتيجيات المنافسة10،11 بما في ذلك آليات غير قابلة للاختراق، مثل المواد الكيميائية مبيدة للجراثيم1،12 والببتيدات المضادة للميكروبات تفرز13 ، وكذلك الآليات المعتمدة على الاتصال التي تتطلب اتصال الخلية لنقل تأثيرمثبط إلى الخلايا المستهدفة 9،14،15،16،17 ،18.
على الرغم من أن التكعيبات القائمة على الثقافة تستخدم عادة في علم الأحياء الدقيقة5و8و19،فإن هذه المخطوطة تحدد كيفية استخدام التدقيق لتوصيف آلية المنافسة، فضلاً عن اقتراحات للتكيف بروتوكول للاستخدام مع الأنواع البكتيرية الأخرى. وعلاوة على ذلك، تصف هذه الطريقة نُهجاً متعددة لتحليل البيانات وعرضها للإجابة على أسئلة مختلفة حول طبيعة التفاعلات التنافسية. على الرغم من أن التقنيات الموصوفة هنا استخدمت سابقا لتحديد آلية القتل بين البكتيريا الكامنةالكامنة داخل المنافسة المحددة بين سلالات تكافلية من البكتيريا Vibrio fischeri معزولة co9 ، فهي مناسبة ل العديد من الأنواع البكتيرية بما في ذلك العزلات البيئية ومسببات الأمراض البشرية، ويمكن استخدامها لتقييم كل من الآليات التنافسية المعتمدة على الاتصال وغير القابلة للاختراق. وقد تتطلب الخطوات المتخذة في البروتوكول تحسين الأنواع البكتيرية الأخرى. وبالنظر إلى أن المزيد من النظم النموذجية توسع دراساتها إلى ما بعد استخدام الكائنات المسببة للسرطان لتشمل مختلف الأنماط الجينية10و16و20و21،فإن هذه الطريقة ستكون مورداً قيماً للباحثين الذين يسعون إلى فهم كيفية تأثير المنافسة على الأنظمة متعددة السلال أو الأنواع المتعددة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يوفر تصنيف التكعيبات الموضحة أعلاه طريقة قوية لاكتشاف المنافسة بين البكتيريا. وسمح هذا النهج بتحديد المنافسة الداخلية بين V. fischeri isolates وتوصيف الآلية التنافسية19. على الرغم من أن الطريقة الموصوفة تم تحسينها للبكتيريا البحرية V. fischeri، فإنه يمكن تعديلها بسهولة لاستيعاب…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر المراجعين على ملاحظاتهم المفيدة. وقد تم دعم A.N.S. من قبل مؤسسة غوردون وبيتي مور من خلال منحة GBMF 255.03 لمؤسسة بحوث علوم الحياة.
Materials
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 10 μL multichannel pipette | |||
| 100 μL multichannel pipette | |||
| 300 μL multichannel pipette | |||
| 10 μL single channel pipette | |||
| 20 μL single channel pipette | |||
| 200 μL single channel pipette | |||
| 1000 μL single channel pipette | |||
| 24-well plates | Fisher | 07-200-84 | sterile with lid |
| 96-well plates | VWR | 10062-900 | sterile with lid |
| Calculator | |||
| Chloramphenicol | Sigma | C0378 | stock (20 mg/mL in Ethanol); final concentration in media (2 μg /mL LBS) |
| Fluorescence dissecting microscope with camera and imaging software | |||
| forceps | Fisher | 08-880 | |
| Kanamycin Sulfate | Fisher | BP906-5 | stock (100 mg/mL in water, filter sterilize); final concentration in media (1 μg/mL LBS) |
| Nitrocellulose membrane (FS MCE, 25MM, NS) | Fisher | SA1J788H5 | 0.22 μm nitrocellulose membrane (pk of 100) |
| petri plates | Fisher | FB0875713 | sterile with lid |
| Spectrophotometer | |||
| Semi-micro cuvettes | VWR | 97000-586 | |
| TipOne 0.1-10 μL starter system | USA Scientific | 1111-3500 | 10 racks |
| TipOne 200 μL starter system | USA Scientific | 1111-500 | 10 racks |
| TipOne 1000 μL starter system | USA Scientific | 1111-2520 | 10 racks |
| Vortex | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LBS media | |||
| 1M Tris Buffer (pH ~7.5) | 50 mL 1 M stock buffer (62 mL HCl, 938 mL DI water, 121 g Trizma Base) | ||
| Agar Technical | Fisher | DF0812-17-9 | 15 g (Add only for plates) |
| DI water | 950 mL | ||
| Sodium Chloride | Fisher | S640-3 | 20 g |
| Tryptone | Fisher | BP97265 | 10 g |
| Yeast Extract | Fisher | BP9727-2 | 5 g |
References
- Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nature Reviews Microbiology. 8 (1), 15-25 (2010).
- Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbiosis. Nature Reviews Microbiology. 2 (8), 632-642 (2004).
- Dörr, N. C. D., Blockesh, M. Bacterial type VI secretion system facilitates niche domination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), 8855-8857 (2018).
- Maclntyre, D. L., Miyata, S. T., Kitaoka, M., Pukatzki, S. The Vibrio cholerae type VI secretion system displays antimicrobial properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (45), 19520-19524 (2010).
- Salomon, D., Gonzalez, H., Updegraff, B. L., Orth, K. Vibrio parahaemolyticus type VI secretion system 1 is activated in marine conditions to target bacteria, and is differentially regulated from system 2. PloS One. 8 (4), e61086 (2013).
- Sana, T. G., et al. Salmonella Typhimurium utilizes a T6SS-mediated antibacterial weapon to establish in the host gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (34), E5044-E5051 (2016).
- Schwarz, S., et al. Burkholderia type VI secretion systems have distinct roles in eukaryotic and bacterial cell interactions. PLoS Pathogens. 6 (8), e1001068 (2010).
- Wenren, L. M., Sullivan, N. L., Cardarelli, L., Septer, A. N., Gibbs, K. A. Two independent pathways for self-recognition in Proteus mirabilis are linked by type VI-dependent export. MBio. 4 (4), (2013).
- García-Bayona, L., Guo, M. S., Laub, M. T. J. E. Contact-dependent killing by Caulobacter crescentus via cell surface-associated, glycine zipper proteins. Elife. 6, 24869 (2017).
- Stubbendieck, R. M., Straight, P. D. Multifaceted interfaces of bacterial competition. Journal of bacteriology. 198 (16), 2145-2155 (2016).
- Cornforth, D. M., Foster, K. R. Antibiotics and the art of bacterial war. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (35), 10827-10828 (2015).
- Shank, E. A., Kolter, R. New developments in microbial interspecies signaling. Current Opinion in Microbiology. 12 (2), 205-214 (2009).
- Roelofs, K. G., Coyne, M. J., Gentyala, R. R., Chatzidaki-Livanis, M., Comstock, L. E. Bacteroidales secreted antimicrobial proteins target surface molecules necessary for gut colonization and mediate competition in vivo. MBio. 7 (4), e01055-e01016 (2016).
- Dey, A., Vassallo, C. N., Conklin, A. C., Pathak, D. T., Troselj, V., Wall, D. Sibling rivalry in Myxococcus xanthus is mediated by kin recognition and a polyploid prophage. Journal of bacteriology. 198 (6), (2016).
- Danka, E. S., Garcia, E. C., Cotter, P. A. Are CDI systems multicolored, facultative, helping greenbeards?. Trends in Microbiology. 25 (5), 391-401 (2017).
- Willett, J. L., Ruhe, Z. C., Coulding, C. W., Low, D. A., Hayes, C. S. Contact-dependent growth inhibition (CDI) and CdiB/CdiA two-partner secretion proteins. Journal of molecular biology. 427 (23), 3754-3765 (2015).
- Cianfanelli, F. R., Monlezun, L., Coulthurst, S. J. Aim, load, fire: the type VI secretion system, a bacterial nanoweapon. Trends in Microbiology. 24 (1), 51-62 (2016).
- Joshi, A., Kostiuk, B., Rogers, A., Teschler, J., Pukatzki, S., Yildiz, F. H. Rules of engagement: the type VI secretion system in Vibrio cholerae. Trends in microbiology. 25 (4), 267-279 (2017).
- Speare, L., et al. Bacterial symbionts use a type VI secretion system to eliminate competitors in their natural host. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), E8528-E8537 (2018).
- Shank, E. A. Using coculture to detect chemically mediated interspecies interactions. Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).
- Long, R. A., Rowley, D. C., Zamora, E., Liu, J., Bartlett, D. H., Azam, F. Antagonistic interactions among marine bacteria impede the proliferation of Vibrio cholerae. Applied and Environmental Microbiology. 71 (12), 8531-8536 (2005).
- Dunn, A. K., Millikan, D. S., Adin, D. M., Bose, J. L., Stabb, E. V. New rfp-and pES213-derived tools for analyzing symbiotic Vibrio fischeri reveal patterns of infection and lux expression in situ. Applied and Environmental Microbiology. 72 (1), 802-810 (2006).
- Sana, T. G., et al. The second type VI secretion system of Pseudomonas aeruginosa strain PAO1 is regulated by quorum sensing and Fur and modulates internalization in epithelial cells. Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 27095-27105 (2012).
- Bachmann, V., Kostiuk, B., Unterweger, D., Diaz-Satizabal, L., Ogg, S., Pukatzki, S. Bile salts modulate the mucin-activated type VI secretion system of pandemic Vibrio cholerae. PLoS. 9 (8), e0004031 (2015).
- Ishikawa, T., Rompikuntal, P. K., Lindmark, B., Milton, D. L., Wai, S. N. Quorum sensing regulation of the two hcp alleles in Vibrio cholerae O1 strains. PloS One. 4 (8), e6734 (2009).
- Ishikawa, T., et al. Pathoadaptive conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio cholerae O1 strains. Infection and immunity. 80 (2), 575-584 (2012).
- Pollack-Berti, A., Wollenberg, M. S., Ruby, E. G. Natural transformation of Vibrio fischeri requires tfoX and tfoY. Environmental Microbiology. 12 (8), 2302-2311 (2010).
- Meibom, K. L., Blockesh, M., Dolganov, N. A., Wu, C. Y., Schoolnik, G. K. Chitin induces natural competence in Vibrio cholerae. Science. 310 (5755), 1824-1827 (2005).
- Borgeaud, S., Metzger, L. C., Scrignari, T., Blockesh, M. The type VI secretion system of Vibrio cholerae fosters horizontal gene transfer. Science. 347 (6217), 63-67 (2015).
- Townsley, L., Mangus, M. P. S., Mehic, S., Yildiz, F. H. Response of Vibrio cholerae to low-temperature shift: CpsV regulates type VI secretion, biofilm formation, and association with zooplankton. Applied and Environmental Microbiology. 82 (14), 00807-00816 (2016).
- Huang, Y., et al. Functional characterization and conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio fluvialis. Frontiers in microbiology. 8, 528 (2017).
